HPLC-MS/MS測定茶葉中滅草松及其代謝物殘留量

吳曉萍

福建中檢華日食品安全檢測有限公司（福州 350028）

茶葉作為一種商品，從其產生發展至今對中國經濟及全球貿易的發展起到重要影響作用。世界上存在的3種非酒精類（咖啡、可可和茶葉）飲料中，由于茶葉含有大量多酚、咖啡因和芳香等物質，在抗癌、抗氧化和抗炎等方面具有一定功效，茶葉這一獨特的飲品已贏得全球眾多人的喜愛，成為世界上最受歡迎的飲料之一[1-2]。

茶葉中存在多種化學物質，在農藥殘留的檢測過程中會對檢測結果的準度產生一定的干擾作用，因此在檢測前期需要增加對茶葉的前處理凈化過程，從而提升檢測結果的準確性。有關茶葉的前處理方法主要包括2種，分別為QuEChERS法[3-7]和固相萃取法[8-11]。其中，QuEChERS法具有操作簡便、快捷的特點，尤其與液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）結合使用可以大幅提高檢測效率。GB 2763.1—2022《食品安全國家標準 食品中2,4-滴丁酸鈉鹽等112種農藥最大殘留限量》規定茶葉的滅草松及其代謝物的臨時限量為0.1 mg/kg，但尚未指定檢測的方法。因此建立一種檢測滅草松及其代謝物在茶葉上的殘留的方法具有重要意義。

采用QuEChERS的前處理方法凈化茶葉，采用LCMS/MS聯用的分析方法對茶葉中的滅草松及其代謝物進行定量測定，建立GB 2763.1—2022中滅草松及其代謝物松殘留分析方法，可滿足茶葉中多農藥殘留檢測的要求，為后續制定滅草松及其代謝物殘留分析的標準提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜（1290）-三重四極桿（6475）（美國安捷倫科技有限公司）；低速分離機（德國Sigma公司）；滅草松及代謝產物6-羥基滅草松、8-羥基滅草松（壇墨質檢科技股份有限公司）；乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）及石墨炭黑（GCB）（上海安譜技術有限公司）；檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（國藥集團）；所用溶劑及其他試劑皆為色譜純；試驗用水為3次濾后的純水。

1.2 標準溶液的制備

標準儲備液制備：準確移取1 mL質量濃度為1 000 μg/mL的滅草松及其代謝物于10 mL容量瓶并定容至刻度，得到100 μg/mL的標準儲備液，置于-20 ℃冰箱中儲存備用。

混合標準溶液制備：準確吸取1 mL標準儲備液于10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度線，獲得質量濃度10 mg/L混合標準溶液，放于-18 ℃冰箱中存儲備用。

1.3 樣品的前處理

將茶葉500 g，粉碎后，過0.300 mm（50目）篩，裝入8號塑料袋，待用。精確稱取2.0 g（精確至0.01 g）茶葉粉于50 mL聚四氟乙烯離心管中，向其中添加5 mL超純水將其浸泡30 min，添加15 mL的1%（V/V）乙酸乙腈溶液、5 g無水氯化鈉、1.5 g醋酸鈉，陶瓷均質后在4 000 r/min轉速下離心5 min，取其上清液于5 mL離心管（含混合凈化劑PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 100 mg和MgSO4750 mg）渦漩2 min，置于15 000 r/min的轉速下高速離心5 min，過膜后進行上機檢測。

1.4 LC-MS/MS儀器條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為4 mmol/L乙酸銨水溶液（0.1%甲酸），流動相B為乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。質譜條件：多反應監測模式（MRM）、電子噴霧離子源（ESI-）。離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃、毛細管電壓3.5 kV，噴霧壓強35 psi，脫溶劑氣流量12 L/min。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

為得到最佳質譜條件，將0.1 μg/mL混標在MS1正負模式下進行掃描得最佳模式下母離子，對每個化合物去簇電壓進行優化得到最佳模式，試驗結果表明滅草松、6-羥基滅草松和8-羥基滅草松在負模式下響應較大。通過子離子掃描和MRM掃描得到最佳的碎片離子和碰撞能量，具體參數詳見表2。

表2 3種農藥的保留時間、監測離子對、碰撞能和去簇電壓

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取溶劑的優化

關于滅草松及其代謝物的提取方式大部分是在酸性條件下，使用丙酮或乙腈進行提取。結果表明，丙酮提取出的樣液顏色比乙腈的深，且與水互溶不利于后期的凈化。對于液相來說，丙酮不適合直接上機。試驗比較純乙腈或乙酸乙腈兩者溶劑對試驗結果的影響。如圖2所示，含有乙酸的乙腈回收率明顯高于乙腈，這跟滅草松屬于偏酸性化合物有關，在酸性條件下，使目標物在基質中呈分子態有利于提取。

圖1 3種化合物的提取離子色譜圖

圖2 不同提取劑對3種化合物的回收率的影響

2.2.2 凈化劑的選擇

茶葉中主要雜質有如色素、生物堿、甾醇和茶多酚、水分及其他干擾物質。茶多酚是主要干擾成分，而葉綠素和葉黃素是茶葉中最直接可見的干擾色素成分。Na2SO4和MgSO4常用于除水劑，Na+的半徑相對于Mg2+大，周圍可以容納更多水分子，結合水的數目多，但Mg2+電荷大，半徑小，與水的結合能力較強，故無水硫酸鎂可作為除水劑。分別優化PSA、C18和GCB的用量，往陰性綠茶樣品添加質量濃度20 μg/kg的混標，PSA、GCB和C18的用量為10，50，100，150和200 mg，以3種農藥加標回收率評價試驗結果。試驗結果表明（見圖3），隨著PSA用量增加，3種農藥回收率越來越低，目標物是酸性農藥被堿性的PSA吸附嚴重，其余兩者跟目標物無明顯吸附，當每毫升加入PSA、C18和GCB的量分別為50，100和100 mg時，3種農藥回收率在70%～110%，凈化效果最佳。故試驗采用50 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB和750 mg MgSO4組合凈化劑。

圖3 吸附劑組成對提取回收率的影響

2.3 方法評價

2.3.1 方法的線性范圍、檢出限與定量限

在優化的試驗條件下，用茶葉空白樣品提取液將3種農藥混合儲備液進行稀釋配得1，5，10，20，40，50和100 μg/L的系列基質匹配標準溶液，根據檢測結果繪制標準曲線（橫坐標x為32種農藥的質量濃度μg/L，縱坐標y為定量離子峰面積），計算3種農藥在基質中的檢出限（3倍信噪比），以最小添加濃度為定量限。結果顯示，3種農藥各自線性良好（在基質匹配濃度范圍內），相關系數r均大于0.99，滅草松及其代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松3種農藥的檢出限為0.42，0.12和0.014 μg/kg。

2.3.2 基質效應

基質效應在農藥分析的過程中普遍存在，用陰性茶葉配制濃度與乙腈配制的標準樣液，以二者的響應峰面積的比值計算基質效應的大小。其中，當ME=0.8～1.2時為弱基質效應；反之為中強等基質效應[12]。結果顯示，滅草松的值為0.28，6-羥基滅草松為0.21，8-羥基滅草松為0.23，由此判定基質效應較強，采用基質匹配標準曲線進行定量則可減少基質效應帶來的結果誤差從而提高準確度。

2.3.3 加標回收率與精密度

向空白茶葉基質中添加3個含量水平的混合標準溶液（10，20和100 μg/kg），每個加標水平皆做6次平行試驗，優化檢測條件后進行測定。測定結果見表3，3種化合物在茶葉中的平均回收率為83.4%～99.2%，相對標準偏差（n=6）區間分別為1.2%～7.3%。試驗結果表明，方法的準確度和精密度可以滿足試驗要求[13]。

表3 3種化合物回收率和精密度（n=6）

2.4 樣品的測定

采用建立的方法測定40批市售茶葉樣品中3種農藥，尚未有檢出。

3 結論

通過優化不同的提取方式、凈化劑用量建立基于分散相萃取法聯合LC-MS/MS檢測茶葉中滅草松及其代謝物的分析方法。該方法具有操作簡便、快捷、定性定量準確度高等特點，可應用于茶葉中3種新增農藥（滅草松及其代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松）的殘留檢測，為解決茶葉的農藥殘留檢測技術提供技術指導。