褪黑素提高二苯酮-3暴露小鼠早期胚胎體外發(fā)育潛能的研究

熊鈺瑩 史若錦 朱海瑛 金龍

1廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，粵港澳母胎醫(yī)學(xué)高校聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州 510150）；2廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州 511400）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的預(yù)測(cè)，不孕不育癥是僅次于腫瘤和心腦血管疾病的人類第三大疾病［1］，而日益嚴(yán)重的環(huán)境污染是造成生育能力下降的重要因素之一［2］。二苯酮-3（benzophenone-3， BP-3）是防曬霜中一種常用的紫外線保護(hù)劑，隨著人們防曬意識(shí)的重視，其應(yīng)用日益增多。研究發(fā)現(xiàn)［3］，BP-3 不僅存在于自然環(huán)境中，也存在于人類體液中，已然成為一種常見的環(huán)境污染物。BP-3 暴露與精子、前列腺、嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有重要關(guān)聯(lián)［4-5］。此外，近期研究［6］證明生理濃度范圍內(nèi)（0.8 μmol/L）的BP-3 暴露通過加劇氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞凋亡來降低小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟水平，但其對(duì)早期胚胎發(fā)育的危害和具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究針對(duì)常用防曬霜中可能存在影響女性胚胎發(fā)育潛能的BP-3 以及如何挽救此生殖危害而作了進(jìn)一步研究。此外，褪黑激素（melatonin， MT）是由松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，在機(jī)體內(nèi)有著廣泛的生理功能，如抗炎、抗氧化、抗凋亡等，對(duì)生殖系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用［7-10］。迄今，許多研究已經(jīng)證實(shí)MT 可通過抑制氧化應(yīng)激、維持卵母細(xì)胞膜的通透性、改善胚胎的凍存效果等方面來促進(jìn)卵泡成熟及提高胚胎發(fā)育潛能，進(jìn)而提高輔助生殖技術(shù)（ART）的成功率［11-15］。盡管如此，MT 是否可逆轉(zhuǎn)BP-3 暴露對(duì)早期胚胎的不利影響仍尚未明晰，且相關(guān)研究有限。因此，本研究擬闡明MT 可通過促進(jìn)ATP 生成、降低DNA 損傷、下調(diào)氧化基因，以及抗凋亡等方式，從而改善BP-3 對(duì)早期胚胎發(fā)育的不利作用，旨在理解早期胚胎發(fā)育的調(diào)控機(jī)制以及為臨床上因環(huán)境因素導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降的患者提供新的診療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR 品系7～10 周齡的雌性小鼠及9～12 周齡的雄性小鼠。所有SPF 小鼠均購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，在水云天動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，且所有實(shí)驗(yàn)均獲得水云天倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件號(hào)：SYT2023107。

1.1.2 主要試劑和儀器血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）購自寧波第二激素廠，MT、M2培養(yǎng)液、KSOM培養(yǎng)液購自美國Sigma公司，BP-3 購自Selleck Chemicals 公司，DNA 試劑盒購自Qiagen公司，γ-H2AX購于CST公司，ATP5A、ATP5B購于Santa Cruz Biotechnology 公司，二抗均購于Abcam 公司。主要儀器包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Quantstudio 3、ChampChemi 910 全自動(dòng)發(fā)光儀、Nikon倒置熒光顯微鏡和A1R激光共聚焦顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠胚胎的體外培養(yǎng)（IVC）雌鼠于16：00腹腔注射10 IU PMSG，間隔48 h 再注射10 IU HCG進(jìn)行超數(shù)排卵，隨后與雄鼠1∶1 合籠，第二天早晨檢出含陰道栓小鼠。收集受精卵，經(jīng)透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞，在M2 培養(yǎng)液中清洗3 遍，將胚胎移入IVC 培養(yǎng)液，并在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄胚胎體外發(fā)育情況。

1.2.2 胚胎的實(shí)驗(yàn)處理將BP-3和MT各予DMSO溶解，分別使其濃度為10 mmol/L 和0.1 mol/L。取KSOM 培養(yǎng)液將BP-3 濃度稀釋成0.8 μmol/L，以下簡(jiǎn)稱BP-3培養(yǎng)液。取0.8 μmol/L BP-3培養(yǎng)液將MT稀釋，使最終濃度為1 × 10-5mol/L、1 × 10-7mol/L、1 × 10-9mol/L，以下簡(jiǎn)稱MT 培養(yǎng)液。將采集的小鼠合子期受精卵，分別放入KSOM 培養(yǎng)液（對(duì)照組）、BP-3 培養(yǎng)液（BP-3 組）和MT 培養(yǎng)液（MT 組）中進(jìn)行IVC。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)按照RNeasy Mini Kit 試劑盒配置好反應(yīng)體系，對(duì)囊胚基因組進(jìn)行提取。引物序列如下：GAPDH：正向5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'；Bax：正向5'-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3'，反向5'-ATCCTCTGCAGCTCCATGTT-3'；Gpx1：正向5'-CCAGGAGAATGGCAAGAATGAA-3'，反向5'-AGGAAGGTAAAGAGCGGGTGAG-3'；Cdx2：正向5'-CAAGGACGTGAGCATGTATCC-3'，反向5'-GTAACCACCGTAGTCCGGGTA-3'；Pou5f1：正向5'-CGGAAGAGAAAGCGAACTAGC-3'，反向5'-ATTGGCGATGTGAGTGATCTG-3'。 基于2-ΔΔCt，算出目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 分析囊胚予PBS 洗滌3 次后裂解在含有蛋白酶抑制劑的Laemmli sample buffer中，煮沸5 min。樣品在10% SDS-PAGE 凝膠上電泳，待分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，隨后與一抗ATP5A（1∶200）、ATP5B（1∶200）和GAPDH（1∶1 000）結(jié)合，4 ℃孵育過夜。第2 天PBST 清洗3 次，再加入二抗羊抗兔IgG（1∶3 000）、羊抗鼠IgG（1∶3 000）室溫孵育1 h，隨后用發(fā)光試劑盒來檢測(cè)蛋白。Image J 軟件對(duì)蛋白條帶結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 囊胚DNA 損傷的測(cè)定將囊胚置于4%PFA 固定30 min，1% Triton 通透30 min，0.5% BSA室溫封閉2 h，加入一抗γ-H2AX（1∶400）4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，加入二抗室溫孵育1 h，再放入DAPI 孵育5 min，予PBS 清洗3 次，壓片后用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過方差分析對(duì)多組間進(jìn)行比較。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MT 提高了BP-3 暴露小鼠胚胎體外發(fā)育潛能IVC 結(jié)果顯示，0.8 μmol/L BP-3 處理后的囊胚率顯著低于對(duì)照組，而補(bǔ)充不同濃度MT（1 × 10-5mol/L、1 × 10-7mol/L 和1 × 10-9mol/L）均能有效提高BP-3暴露胚胎的發(fā)育能力，其中以1 × 10-7mol/L MT 的挽救效果最為顯著（P＜ 0.05，圖1A、表1），因此本實(shí)驗(yàn)采用的MT 處理濃度為1 × 10-7mol/L。此外，對(duì)照組、BP-3組及MT組間的2細(xì)胞率和囊胚細(xì)胞核數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05，圖1B、表1）。

表1 MT 對(duì)BP-3 暴露小鼠胚胎體外發(fā)育潛力的影響Tab.1 Effect of MT on the developmental potential of BP-3-exposed mouse embryos in vitro±s

注：與對(duì)照組比較，aP > 0.05，bP ＜ 0.05；與BP-3組比較，cP > 0.05，dP ＜ 0.05

組別對(duì)照組BP-3組MT組χ2/F值P值胚胎數(shù)（個(gè)）120 137 121 2細(xì)胞數(shù)（%）117（97.50）128（93.43）a 118（97.52）a,c 0.87 0.47囊胚數(shù)（%）110（91.67）45（32.85）b 96（79.34）a,d 124＜ 0.000 1單個(gè)囊胚中平均細(xì)胞數(shù)（images/BZ_50_1080_2419_1101_2456.png±s）92.50±5.02 87.80±5.31 a 92.10±4.23 a,c 2.86 0.075

注：A，對(duì)照組、BP-3組和MT組的胚胎發(fā)育情況，標(biāo)尺=50 μm；B，對(duì)照組、BP-3組和MT組囊胚的細(xì)胞核染色，標(biāo)尺=50 μm圖1 MT 促進(jìn)BP-3 暴露小鼠早期胚胎體外發(fā)育水平Fig.1 MT promotes the developmental levels of BP-3-exposed mouse embryos in vitro

2.2 囊胚中Gpx1、Bax、Cdx2、Pou5f1 基因的轉(zhuǎn)錄水平qRT-PCR 結(jié)果顯示，MT 組囊胚的Gpx1 的轉(zhuǎn)錄水平是BP-3 組的3 倍（P＜ 0.05，圖2A），Bax 的表達(dá)水平相對(duì)BP-3組約減少了一半（P＜ 0.05，圖2B）。此外，與對(duì)照組相比，BP-3 處理后抑制了囊胚的Pou5f1 和Cdx2 基因轉(zhuǎn)錄，但加入MT 后可恢復(fù)到了正常水平（P＜ 0.05，圖2C、D）。

注：與BP-3 組比較，*P ＜ 0.05圖2 囊胚中氧化應(yīng)激、凋亡以及多能性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平Fig.2 Transcriptional expression levels of oxidative stress， apoptosis and pluripotency related genes in blastocysts

2.3 囊胚中 ATP5A、ATP5B 的蛋白表達(dá)水平Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BP-3 組中ATP5A、ATP5B 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P＜ 0.05），而添加MT 后ATP5B 蛋白恢復(fù)至正常表達(dá)水平，但ATP5A 的表達(dá)仍低于對(duì)照組（P＜ 0.05，圖3）。

注：A、B，Western blot檢測(cè)對(duì)照組、BP-3組和MT組中ATP5A和ATP5B的蛋白表達(dá)；C、D，對(duì)照組、BP-3組和MT組的蛋白表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，與BP-3組比較，*P ＜ 0.05圖3 MT 提高BP-3 暴露小鼠囊胚的ATP5A、ATP5B 蛋白水平Fig.3 MT improves the protein levels of ATP5A and ATP5B in BP-3-exposed mouse blastocysts

2.4 MT 對(duì)BP-3 暴露小鼠胚胎DNA 損傷的影響通過免疫熒光方法檢測(cè)DNA 損傷情況，結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照組相比，BP-3 處理增強(qiáng)了囊胚之中γ-H2AX 信號(hào)強(qiáng)度（P＜ 0.05），而添加MT 可以有效緩解DSBs（P＜ 0.05）。

注：A，免疫熒光檢測(cè)對(duì)照組、BP-3組和MT組中囊胚的γ-H2AX表達(dá)（100 ×），標(biāo)尺=50 μm；B，對(duì)照組、BP-3組和MT組的免疫熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖，與BP-3組比較，*P ＜ 0.05圖4 MT 恢復(fù)BP-3 暴露小鼠囊胚的DNA 損傷程度Fig.4 MT restores the extent of DNA damage in BP-3-exposed mouse blastocysts

3 討論

大量動(dòng)物試驗(yàn)［4，16］指出BP-3 對(duì)生殖系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生毒性。本文的研究結(jié)果也表明了它對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎同樣具有胚胎毒性，引起早期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和異常。MT 由于有著強(qiáng)大的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)活性和清除自由基抗氧化能力，近年來被廣泛研究于ART、動(dòng)物遺傳育種與繁殖等方面。據(jù)報(bào)道［12，17-18］，MT 可以有效改善人、豬、牛及小鼠等哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟和早期胚胎的發(fā)育質(zhì)量。為了進(jìn)一步證實(shí)MT 對(duì)因環(huán)境因素引起的胚胎損傷亦有顯著的保護(hù)作用，我們將0.8 μmol/L BP-3 暴露小鼠胚胎在1 × 10-7mol/L MT 的培養(yǎng)液中進(jìn)行IVC 來檢測(cè)三組囊胚率差異情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MT 處理后體外囊胚形成率達(dá)到了79.34%，約是BP-3 組的兩倍。這提示MT 對(duì)BP-3 損害的胚胎發(fā)育發(fā)揮著保護(hù)作用，該結(jié)果與之前的報(bào)道［6，12，17，19］相一致。

BP-3 處理的胚胎，顯示出Gpx1 下調(diào)、Bax 上調(diào)，ATP5A 和ATP5B 的抑制，γ-H2AX 的熒光信號(hào)增強(qiáng)，均表明了BP-3 引起氧化應(yīng)激加劇，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，線粒體損傷，最終誘導(dǎo)了大量胚胎凋亡。既往相關(guān)研究結(jié)果均表明，MT 添加在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中，可通過降低ROS、增加GSH 和線粒體膜電位來顯著降低氧化應(yīng)激水平，從而提高卵子成熟率和囊胚率［19-21］。CUI等［17］通過在豬胚胎的IVC 中添加魚藤酮和MT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT 通過激活SIRT1/PGC-1α 途徑，增加了線粒體生物發(fā)生和ATP 含量來抑制囊胚細(xì)胞的凋亡。本研究也得到相似的結(jié)果，MT 可恢復(fù)BP-3 暴露小鼠胚胎Gpx1、Bax、ATP5A、ATP5B 及γ-H2AX 的正常表達(dá)水平，其機(jī)制可能是MT 通過增加線粒體生物發(fā)生來挽救因環(huán)境毒素引起的胚胎氧化應(yīng)激加劇和能量不足情況，從而提高胚胎細(xì)胞的活力。

Pou5f1 和Cdx2 是胚胎分化和發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子，雖然在8 細(xì)胞期時(shí)這兩種基因都有表達(dá)，但在囊胚晚期時(shí)兩者呈現(xiàn)相互抑制的表達(dá)模式，即Pou5f1在囊胚腔形成后僅在ICM中高表達(dá)［22］；而Cdx2 局限表達(dá)于TE，成為滋胚層的標(biāo)志因子［23-24］。HUAN 等［25］的研究中發(fā)現(xiàn)，MT 處理鐮刀菌素B1（EB1）暴露的胚胎后，能明顯改善EB1 囊胚中的Pou5f1 和Cdx2 的DNA 去甲基化不完全，增加細(xì)胞的ATP 能量水平，從而恢復(fù)Pou5f1、Cdx2 的表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示MT 組Pou5f1 和Cdx2 的基因表達(dá)量顯著高于BP-3 組，且與對(duì)照組無明顯差異，得到了與HUAN 等研究相似的結(jié)論。這說明MT 在早期胚胎IVC 中對(duì)BP-3 降低小鼠囊胚中多能性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平有著明顯的改善作用，其機(jī)制可能是通過影響細(xì)胞能量代謝及DNA 甲基化重編程水平來維持早期胚胎發(fā)育的TE 和ICM細(xì)胞命運(yùn)分化，從而促進(jìn)優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。

本研究尚有不足之處：首先，需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MT 對(duì)BP-3 暴露小鼠胚胎發(fā)育潛能是否同樣存在改善作用。其次，本實(shí)驗(yàn)具體的分子機(jī)制還不完善，如氧化應(yīng)激、線粒體功能、表觀遺傳等。最后，在后續(xù)的研究中擬結(jié)合臨床廢棄樣本如三原核受精卵，以全面評(píng)估BP-3 暴露對(duì)人類胚胎發(fā)育的危害。

綜上所述，MT 可以通過改善BP-3 暴露引起的早期胚胎氧化還原失衡、多能性下降、ATP 缺乏和細(xì)胞凋亡等情況，進(jìn)而顯著提高小鼠胚胎體外發(fā)育能力及質(zhì)量。因此，本研究闡明了BP-3 暴露通過破壞胞內(nèi)氧化還原平衡致小鼠早期胚胎發(fā)育異常的分子機(jī)理及MT 的挽救作用，為環(huán)境因素引起生育困難患者的臨床診療提供了理論依據(jù)，具有重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

【Author contributions】XIONG Yuying performed the experiments and wrote the article.SHI Ruojin revised the article.ZHU Haiying and JIN Long performed the experiments and designed the study.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.