PI3K/AKT 信號通路與乳腺病變彈性特征的相關性

姜瑩，王博，李詩雨，牛瑞蘭，李俊康，王知力*

1.南開大學醫學院，天津 300071；2.解放軍總醫院第一醫學中心超聲診斷科，北京 100853；*通信作者 王知力wzllg@sina.com

乳腺癌是185個國家女性人群中最常見的癌癥類型，是女性患者死亡的主要原因[1]。I期乳腺癌患者5年生存率接近100%，但IV期乳腺癌的5年生存率下降至28%[2]。因此，乳腺癌的早期診斷是臨床亟待解決的問題。剪切波彈性成像以量化的形式顯示組織硬度以獲得病變的生物學信息，在鑒別乳腺良、惡性病變方面具有良好的診斷準確性[3-4]。細胞外基質的降解不僅是觸發癌癥轉移的關鍵，還會伴隨不同腫瘤特異性細胞外基質沉積導致密度及硬度增加。本課題組前期研究表明，細胞外基質成分的變化與乳腺病變彈性特征密切相關[5]。乳腺癌組織中的異常磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）信號通路激活可以引起細胞骨架的變化，導致細胞蛋白質重排和腫瘤間質重塑，進而使組織硬化和增強，在乳腺癌的侵襲和轉移中發揮重要作用[6-9]。但PI3K/AKT信號通路與乳腺病變的彈性特征是否具有相關性目前鮮有報道。本研究擬探討PI3K/AKT信號通路與乳腺病變彈性特征的相關性，為進一步闡明乳腺病變剪切波彈性模量改變的機制打下基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 前瞻性分析2021年5月—2022年5月于解放軍總醫院接受手術切除的114例女性患者共115個乳腺病變，以手術病理結果為“金標準”。納入標準：①病理診斷明確；②臨床、病理及預后隨訪信息完整。排除標準：①接受活檢或新輔助化療；②缺少重要的組織病理學結果，如缺少術后腋窩淋巴結病理。患者年齡18～71歲，平均（45±10）歲；病灶最大直徑0.56～7.30 cm，平均（2.20±0.89）cm。手術前進行常規超聲和剪切波彈性成像檢查。本研究經解放軍總醫院倫理委員會批準（S2021-683-01），所有患者均簽訂知情同意書。

1.2 儀器與方法 采用SuperSonic Imagine AixPlorer實時剪切波彈性成像超聲診斷儀，L15-4線陣探頭，頻率4～15 MHz。患者取仰臥位，充分暴露雙側乳房及腋窩，常規超聲檢查記錄乳房病變的圖像特征后轉換為剪切波彈性成像模式，不施壓的情況下固定探頭，囑患者屏氣，圖像穩定3 s后凍結儲存圖像。使用機器自配的定量測量軟件選取感興趣區測量彈性值。為了與組織病理學數據進行比較，選擇乳腺病變最大成像切面測量乳房病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值，并測量取樣框所置病灶處與周圍同等深度正常乳腺組織的彈性模量比值，重復3次取平均值，并記錄病變邊緣有無出現“硬環征”。

1.3 PI3K/AKT表達的測定 采用4%多聚甲醛對乳腺病變組織進行固定、石蠟包埋，切成厚度為4 μm的石蠟切片。脫蠟水化后，在Tris-EDTA抗原修復液（Solarbio）中煮沸15 min進行抗原修復。室溫下采用過氧化酶阻斷溶液處理切片10 min以消除內源性過氧化物酶。室溫下用山羊血清工作液（中山金橋）封閉30 min后，用鼠單克隆抗PI3K、兔多克隆抗體p-PI3K（Thermo Fisher Scientific）、兔單克隆抗體AKT（Cell Signaling Technology）、兔單克隆抗體p-AKT（Cell Signaling Technology）等分別孵育，4℃過夜。第1天用辣根過氧化物酶偶聯的兔二抗或鼠二抗（Signalway antibody）室溫孵育1 h。采用DAB底物試劑盒（中山金橋）進行顯色，蘇木精反染，密封閱片。染色結果由2名病理學專家獨立評估。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化染色結果。從每個切片中選取5個感興趣區（×200）并拍照。用平均光密度（AOD=IOD/area）評價PI3K/AKT的表達。

1.4 統計學方法 應用SPSS 25.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗；計數資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以病理結果為“金標準”，分別繪制各因素的受試者工作特征（ROC）曲線，采用曲線下面積評價療效。采用Spearman相關分析PI3K/AKT表達水平與乳腺病變彈性參數的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺病變病理結果 115個乳腺病變中，病理結果顯示良性病變50個，包括纖維腺瘤28個、硬化性腺瘤10個、炎性病變6個（急性化膿性乳腺炎5個、肉芽腫性小葉性乳腺炎1個）、導管內乳頭狀瘤5個、良性葉狀瘤1個；惡性病變65個，包括浸潤性癌60個（浸潤性導管癌46個、浸潤性小葉癌6個、浸潤性導管及小葉癌4個、黏液癌4個）、導管原位癌5個。根據術后病理判斷惡性病變是否伴腋窩淋巴結轉移（axillary lymph node metastasis，LNM），分為LNM組25例和無LNM組40例。

2.2 乳腺病變剪切波彈性成像定量參數分析 乳腺病變惡性組的最大彈性模量值、平均彈性模量值以及與周圍組織彈性比值顯著高于良性組。LNM組的最大彈性模量值、平均彈性模量值以及與周圍組織彈性比值顯著高于無LNM組。58.5%的乳腺惡性病變具有“硬環征”表現，顯著高于良性組。92%的LNM具有“硬環征”表現，顯著高于無LNM組（P均＜0.001；圖1，表1）。

圖1 乳腺病變剪切波彈性成像。A.良性乳腺病變（箭），最大彈性模量值為21.5 kPa，平均彈性模量值為18.6 kPa，病變與周圍組織彈性比值為2.3；B.乳腺癌不伴LNM（箭），最大彈性模量值為109.2 kPa，平均彈性模量值為64.7 kPa，病變與周圍組織彈性比值為4.0；C.乳腺癌伴LNM（箭），最大彈性模量值為136.3 kPa，平均彈性模量值為73.8 kPa，病變與周圍組織彈性比值為5.7

2.3 PI3K/AKT表達水平及與彈性特征的相關性 乳腺良性病變、無LNM組及LNM組PI3K表達水平差異有統計學意義（F=15.19，P＜0.001），其中良性病變組與無LNM組、LNM組PI3K表達水平兩兩比較，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。PI3K表達水平與乳腺病變與最大彈性模量值、平均彈性模量值、周圍組織彈性比值呈正相關（r=0.475、0.475、0.451，P＜0.001）。乳腺良性病變、無LNM組、LNM組p-PI3K表達水平比較，差異有統計學意義（F=58.95，P＜0.001）。其中良性病變組與無LNM組、LNM組p-PI3K表達水平兩兩比較，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。p-PI3K表達水平與乳腺病變最大彈性模量值、平均彈性模量值、周圍組織彈性比值呈正相關（r=0.533、0.540、0.542，P＜0.001）。乳腺良性病變、無LNM組、LNM組AKT表達水平差異有統計學意義（F=46.94，P＜0.001）。其中良性病變組與無LNM組、良性病變組與LNM組AKT表達水平差異均有統計學意義（P均＜0.05），LNM組與無LNM組AKT表達水平差異無統計學意義（P=0.343）。AKT表達水平與乳腺病變最大彈性模量值、平均彈性模量值、周圍組織彈性比值呈正相關（r=0.371、0.402、0.445，P＜0.001）。乳腺良性病變、無LNM組、p-AKT表達水平差異有統計學意義（F=74.21，P＜0.001）。其中良性病變組與無LNM組、良性病變組與LNM組p-AKT表達水平差異均有統計學意義（P均＜0.05），LNM組與無LNM組p-AKT表達水平差異無統計學意義（P=0.867）。p-AKT表達水平與乳腺病變最大彈性模量值、平均彈性模量值、周圍組織彈性比值呈正相關（r=0.482、0.455、0.545，P＜0.001）。見表1及圖2。

圖2 免疫組化染色結果（×200）。A.良性乳腺病變PI3K表達；B.乳腺癌不伴LNM的PI3K表達；C.乳腺癌伴LNM的PI3K表達；D.良性乳腺病變p-PI3K表達；E.乳腺癌不伴LNM的p-PI3K表達；F.乳腺癌伴LNM的p-PI3K表達；G.良性乳腺病變AKT表達；H.乳腺癌不伴LNM的AKT表達；I.乳腺癌伴LNM的AKT表達；J.良性乳腺病變p-AKT表達；K.乳腺癌不伴LNM的p-AKT表達、L.乳腺癌伴LNM的p-AKT表達

2.4 PI3K/AKT表達及乳腺病變彈性特征對乳腺病變的診斷效能 周圍組織彈性比值、最大彈性模量值、平均彈性模量值、“硬環征”、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表達水平診斷乳腺病變良惡性的ROC曲線見圖3A，其曲線下面積分別為0.910（0.857～0.963）、0.870（0.807～0.933）、0.857（0.790～0.924）、0.772（0.686～0.859）、0.860（0.774～0.947）、0.897（0.832～0.963）、0.898（0.839～0.958）、0.896（0.822～0.971）；周圍組織彈性比值、最大彈性模量值、平均彈性模量值、“硬環征”、PI3K、p-PI3K預測乳腺癌是否伴淋巴結轉移的ROC曲線見圖3B，其曲線下面積分別為0.824（0.726～0.922）、0.710（0.578～0.841）、0.788（0.669～0.906）、0.773（0.657～0.888）、0.736（0.616～0.855）、0.724（0.589～0.858）。AKT及p-AKT表達預測乳腺癌是否伴淋巴結轉移差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 PI3K/AKT表達及乳腺病變彈性特征對乳腺病變的診斷效能。A.病變的彈性特征及PI3K/AKT鑒別診斷乳腺良、惡性病變的ROC曲線；B.病變的彈性特征及PI3K/AKT預測乳腺癌是否伴淋巴結轉移的ROC曲線

3 討論

3.1 剪切波彈性成像對乳腺病變的診斷價值 乳腺癌的發病率和死亡率始終在女性患者中居高位[10-11]，其治療策略的選擇取決于腋窩淋巴結狀態[12-13]。乳腺癌組織學分級、淋巴血管浸潤等與乳腺癌的硬度密切相關[14-16]。剪切波彈性成像可以量化組織的硬度信息，本研究發現，最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值及“硬環征”鑒別良、惡性病變均具有很好的效能，其預測乳腺癌LNM同樣具有重要價值，與既往研究一致[17-19]。

3.2 PI3K/AKT信號通路蛋白在乳腺病變中的表達PI3K/AKT信號通路是一條重要的細胞內信號傳導途徑，其中約60%的乳腺癌會過度激活PI3K/AKT通路，在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等病理過程中具有重要作用[20-22]。本研究采用免疫組化方法檢測良性乳腺病變、無LNM以及LNM組織中PI3K、磷酸化p-PI3K與AKT、磷酸化p-AKT表達，結果顯示，乳腺惡性病變組織中PI3K、磷酸化p-PI3K與AKT、磷酸化p-AKT表達均顯著高于良性病變，與既往研究結果一致[23-24]。但與以上研究不同，本研究發現在預測LNM中PI3K、磷酸化p-PI3K具有較好的臨床價值，但AKT、磷酸化p-AKT表達無顯著差異，其原因可能與樣本量小、標本處理、抗體使用有關。

3.3 PI3K/AKT信號通路蛋白表達水平與乳腺病變彈性特征的相關性 PI3K/AKT信號通路的異常激活還可以影響組織的生理特性，其中之一是導致組織僵硬[25]。這種組織僵硬可能會影響癌癥的發展和進展，包括腫瘤細胞增殖、轉移和治療抵抗等。乳腺癌組織中的異常PI3K/AKT信號通路激活可以引起細胞骨架的變化，導致細胞蛋白質重排和腫瘤間質重塑，進而導致組織硬化和增強[9,21]。但目前乳腺病變中PI3K/AKT信號通路的表達與剪切波彈性參數是否具有相關性尚未明確。本研究表明，乳腺病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值與PI3K、p-PI3K 與AKT、p-AKT 表達水平呈正相關，提示PI3K/AKT對乳腺病變的彈性有一定調控作用。

3.4 本研究的局限性 入組患者未考慮分子分型、組織學分級等因素；樣本量較小，存在一定的選擇偏倚，需要后續納入更大樣本量進一步細化研究和驗證。

總之，乳腺病變的PI3K/AKT表達水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值等均具有相關性，提示其在乳腺病變彈性特征的調控中發揮重要作用。