隱丹參酮通過TLR4/NF-κB/JNK信號通路減輕脂多糖對肺泡上皮細(xì)胞炎性損傷的作用研究

張兆林 趙慧真 王國明 張涵 于娜 張晶晶 張淑鳳

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種危及生命的臨床綜合征,其特征是肺泡上皮損傷和肺水腫液大量聚集引起的呼吸衰竭和頑固性低氧血癥[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種重成分,可導(dǎo)致機(jī)體釋放大量炎性因子,還能夠引起機(jī)體發(fā)熱、微循環(huán)障礙以及多器官炎癥。隱丹參酮(cryptotanshinone, CTS)是從丹參植物中提取的主要生物活性分子之一,丹參是中醫(yī)公認(rèn)的治療多種疾病的植物[2]。CTS具有抗炎[3-4]、抗氧化[5-6]、抗凋亡[6-7]、抗腫瘤[8-9]等多種藥理活性。有研究表明,CTS可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/NF-κB信號通路來改善卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)[10]。但是,CTS對肺泡上皮細(xì)胞的研究尚未見相關(guān)報(bào)道,因此本研究通過用LPS誘導(dǎo)小鼠肺泡上皮細(xì)胞MLE-12建立炎性損傷模型,探討CTS對LPS誘導(dǎo)下對MLE-12細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制。

資料與方法

一、試驗(yàn)材料

1.試驗(yàn)細(xì)胞

小鼠肺泡上皮細(xì)胞(MLE-12)購自美國ATCC(貨號:CRL-2110)。所有實(shí)驗(yàn)過程均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

2.試驗(yàn)試劑與儀器

隱丹參酮(Cryptotanshinone,CTS,純度≥98%)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)購自美國Sigma-Aldrich公司;胰酶、胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素和鏈霉素)、高糖DMEM購自Gibco公司;6、12、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Thermo Fisher公司;CCK-8試劑盒購自Biosharp公司;小鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒均購自Thermo Fisher公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TransGen Biotech公司;兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗TLR4、兔抗p-p65、兔抗p-JNK和β-actin抗體購自 Proteintech公司;山羊抗兔抗體購自Proteintech公司;臺式高速冷凍離心、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司;Western Bloting 轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。

3.引物

引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成(見表1)。

表1 引物序列

二、試驗(yàn)方法

1.不同濃度LPS對MLE-12細(xì)胞活力的影響

將LPS用DMEM稀釋成0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的工作液濃度。試驗(yàn)分對照組和7個(gè)LPS組,每組3個(gè)重復(fù);將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,除對照組加入DMEM, LPS組分別加入上述不同濃度LPS刺激細(xì)胞24 h,隨后加入10 μL/孔CCK-8溶液,并設(shè)置空白組,孵育1 h 后在酶標(biāo)儀中于450 nm處檢測吸光值。

2.MLE-12細(xì)胞炎性損傷模型的構(gòu)建

試驗(yàn)分對照組和3個(gè)LPS組,每組3個(gè)重復(fù);將細(xì)胞以5×105個(gè)/mL孔接種于12孔板,待細(xì)胞貼壁后,除對照組加入DMEM,3個(gè)LPS組分別加入1.0、2.0、5.0 μg/mL LPS,24 h后收集各組細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。同時(shí),用PBS潤洗細(xì)胞1～2次,每孔加入0.5 mL Trizol試劑,根據(jù)Trizol法操作步驟提取細(xì)胞總RNA,檢測合格后用于反轉(zhuǎn)cDNA,然后根據(jù)qPCR試劑盒說明操作,反應(yīng)程序(兩步法)如下: 94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 60s,95 ℃ 1s。

3.不同濃度CTS對MLE-12細(xì)胞活力的影響

將CTS用DMEM稀釋成0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μM的工作液濃度。試驗(yàn)分為對照組和7個(gè)藥物組,每組3個(gè)重復(fù);將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,除對照組加入DMEM,7個(gè)藥物組分別加入上述不同濃度CTS孵育24 h,隨后加入10 μL/孔CCK-8溶液,并設(shè)置空白組,孵育1 h 后在酶標(biāo)儀中于450 nm處檢測吸光值。

4.CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響

試驗(yàn)分為對照組、LPS組和CTS+LPS組3個(gè)組,每組3個(gè)重復(fù);將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL孔接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后,對照組和LPS組加入DMEM,CTS+LPS組加入5.0 μM CTS孵育24 h;隨后除對照組加入DMEM,LPS組和CTS+LPS組加入5.0 μg/mL的LPS;24 h后收集各組細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。同時(shí),用PBS潤洗細(xì)胞1～2次,每孔加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,其他操作同試驗(yàn)方法2。

5.CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

細(xì)胞分組處理同試驗(yàn)方法4。每孔加入120 μL蛋白裂解液,置于冰上充分接觸裂解30 min;收集蛋白裂解液,于4 ℃ 12000 rpm離心機(jī)中離心30 min,取上清;通過 BCA 法測定各組總蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液,并于金屬浴中以100 ℃條件變性 8～10 min;經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜等過程,隨后加入一抗,按以下比例 4 ℃孵育過夜:Bax (1 ∶3000)、Bcl-2(1 ∶2000) 和β-actin(1 ∶3000);第2 d用 TBST 溶液漂洗 3 次,加入對應(yīng)二抗(1 ∶5000),室溫于搖床孵育2 h;TBST 溶液漂洗 3 次;顯影;利用 Image J 軟件分析各組條帶的灰度值。細(xì)胞分組處理同試驗(yàn)方法4,用PBS潤洗細(xì)胞1～2次,每孔加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,其他操作同試驗(yàn)方法2。

6.CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞TLR4/NF-κB/JNK信號通路的影響

細(xì)胞分組處理同試驗(yàn)方法4,一抗按以下比例 4 ℃孵育過夜:TLR4(1 ∶2000)、p-p65(1 ∶2000)、p-JNK(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶3000),其他操作同試驗(yàn)方法5。細(xì)胞分組處理同試驗(yàn)方法4,用PBS潤洗細(xì)胞1～2次,每孔加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,其他操作同試驗(yàn)方法2。

三、數(shù)據(jù)處理

結(jié) 果

一、不同濃度LPS對MLE-12細(xì)胞活力的影響

MLE-12細(xì)胞活力與 LPS 濃度呈劑量依賴關(guān)系,即隨著 LPS 濃度升高,細(xì)胞活力呈下降趨勢。與對照組相比,當(dāng)LPS濃度為0.1和0.5 μg/mL時(shí),細(xì)胞活力無顯著變化(P>0.05); 當(dāng)LPS濃度≥1.0 μg/mL時(shí),細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01),且10.0和20.0 μg/mL LPS組的細(xì)胞活力相較對照組下降20%～30%(見圖1)。因此,可選用1.0、2.0和5.0 μg/mL的LPS 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)炎癥造模指標(biāo)的檢測。

圖1 不同濃度LPS對細(xì)胞活力的影響(n=3)與對照組比較,**P<0.01

二、不同濃度LPS對MLE-12細(xì)胞炎癥指標(biāo)的影響

與對照組相比,1.0 μg/mL LPS組IL-1β、TNF-α含量均顯著上升(P<0.01),而IL-6含量無顯著變化(P>0.05);2.0和5.0 μg/mL LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著上升(P均<0.05)(見圖2A)。與對照組相比,1.0 μg/mL LPS 組TNF-α表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),而IL-1β、IL-6表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05);2.0和5.0 μg/mL LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)(見圖2B)。

圖2 LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞炎癥指標(biāo)的變化情況(n=3)與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

三、不同濃度CTS對MLE-12細(xì)胞活力的影響

與對照組相比,當(dāng)CTS濃度為0～5.0 μM時(shí),細(xì)胞活力無顯著變化(P>0.05);當(dāng)CTS濃度高于10 μM時(shí),細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。因而,可選用5.0 μM CTS用于后續(xù)試驗(yàn)(見圖3)。

圖3 不同濃度CTS對細(xì)胞活力的影響(n=3)與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

四、CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響

與對照組相比,LPS 組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著上升(P<0.01);與LPS組相比,CTS+LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著下降(P均<0.05)(見圖4A)。與對照組相比,LPS 組IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著上升(P<0.01);與LPS組相比,CTS+LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著下降(P均<0.05)(見圖4B)。

圖4 CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞炎癥指標(biāo)的影響(n=3)與對照組比較,**P<0.01;與LPS組比較,#P<0.05,##P<0.01

五、CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

與對照組相比,LPS 組Bax蛋白水平顯著上升(P<0.01)、Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.01);與LPS組相比,CTS+LPS組Bax蛋白水平顯著下降(P<0.01)、Bcl-2蛋白水平顯著上升(P<0.05)(見圖5A)。與對照組相比,LPS 組Bax表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)、Bcl-2表達(dá)水平顯著下降(P<0.01);與LPS組相比,CTS+LPS組Bax表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)、Bcl-2表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)(見圖5B)。

圖5 CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞凋亡指標(biāo)的影響(n=3)與對照組比較,**P<0.01;與LPS組比較,#P<0.05,##P<0.01

六、CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞TLR4/NF-κB/JNK信號通路的影響

與對照組相比,LPS 組TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平顯著上升(P<0.01);與LPS組相比,CTS+LPS組TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平顯著下降(P<0.01)(見圖6)。

圖6 CTS對LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞TLR4/NF-κB/JNK信號通路的影響(n=3)與對照組比較,**P<0.01;與LPS組比較,##P<0.01

討 論

ALI曾被認(rèn)為是ARDS的早期階段,是一種以發(fā)病率、死亡率很高的呼吸窘迫為特征的急性進(jìn)展的呼吸衰竭,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,嚴(yán)重威脅人們的健康[11]。ALI的發(fā)病機(jī)制是由活化的血小板介導(dǎo)的,血小板促進(jìn)先天免疫反應(yīng),包括肺中性粒細(xì)胞募集、蛋白酶和毒性介質(zhì)的產(chǎn)生和分泌[12-13],其臨床特征包括炎癥細(xì)胞組織浸潤、肺水腫和動脈低氧血癥,損傷血管內(nèi)皮和肺泡上皮,從而降低肺功能[14-16]。許多研究發(fā)現(xiàn),肺泡上皮細(xì)胞( alveolar epithelial cells, AEC) 的炎癥和凋亡反應(yīng)在ALI的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[17-19]。在ALI 中,機(jī)體炎癥可以通過觸發(fā)細(xì)胞表面受體從而激活細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)信號通路,進(jìn)一步釋放促炎因子,加重病情[20]。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分,已被廣泛用于誘發(fā)炎癥反應(yīng)。在本研究中,選用小鼠MLE-12細(xì)胞作為研究對象,首先用一系列不同濃度LPS孵育細(xì)胞24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,當(dāng)LPS濃度≥1.0 μg/mL時(shí),細(xì)胞活力發(fā)生顯著下降。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是一種促炎性極強(qiáng)的細(xì)胞因子[21],能誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集和激活,對炎癥起著促進(jìn)作用[22]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)主要細(xì)胞來源是單核細(xì)胞和T細(xì)胞,可以強(qiáng)烈激活免疫系統(tǒng)并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子[23]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子,在炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[24]。細(xì)菌脂多糖長期以來被認(rèn)為是觸發(fā)TNF-α產(chǎn)生的主要刺激物之一[25]。Lu等發(fā)現(xiàn)0.5 μg/mL LPS 孵育MLE-12細(xì)胞24 h,可引起促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量上升[26]。然后,選用1.0、2.0和5.0 μg/mL LPS組孵育細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,2.0和5.0 μg/mL LPS組的IL-1β、IL-6和TNF-α含量及基因表達(dá)水平顯著上升,與前人研究結(jié)果相似,表明LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞炎性損傷模型構(gòu)建成功,且5.0 μg/mL LPS組造模效果好于2.0 μg/mL LPS組,因此,可選用濃度為5.0 μg/mL LPS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CTS具有抗炎[3-4]、抗氧化[5-6]、抗凋亡[6-7]、抗腫瘤[8-9]等多種藥理活性。在本研究中,首先用一系列不同濃度CTS孵育細(xì)胞24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,當(dāng)CTS為0～5.0 μM時(shí),細(xì)胞活力無顯著變化;而CTS濃度高于10.0 μM時(shí),細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降,表明CTS的非毒性范圍為0～5.0 μM。研究發(fā)現(xiàn),CTS可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/NF-κB信號通路來改善卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)[10];CTS還能抑制氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α 基因表達(dá)水平的升高,并且能抑制促凋亡因子Bax蛋白水平的上升和抗凋亡因子Bcl-2蛋白水平的下降[27]。在本研究中,先用5.0 μM CTS孵育細(xì)胞24 h,再用5.0 μg/mL LPS刺激細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)與LPS組相比,CTS+LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α含量及基因表達(dá)水平顯著下降,Bax蛋白及基因表達(dá)水平顯著下降和Bcl-2蛋白及基因表達(dá)水平顯著上升,表明CTS可以減輕LPS對MLE-12細(xì)胞的炎性損傷作用。

TLR4作為一種典型的跨膜蛋白,橫跨整個(gè)細(xì)胞膜,可以與細(xì)胞表面的脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合,同時(shí)與細(xì)胞膜外的CD14分子識別并結(jié)合形成三聚體,并以該方式活化TLR4蛋白分子[28],接著活化下游NF-κB和JNK信號通路,使得特定基因的表達(dá)增強(qiáng),如IL-1β、IL-6、IL-8等[29]。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比,LPS 組TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平顯著上升;與LPS組相比,CTS+LPS組TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平顯著下降,表明CTS可能通過抑制TLR4/NF-κB/JNK信號通路的活化發(fā)揮抗炎抗損傷作用。

綜上所述,隱丹參酮可能通過抑制TLR4/NF-κB/JNK信號通路的活化,降低LPS誘導(dǎo)下MLE-12細(xì)胞中促炎因子的釋放,從而減輕LPS對MLE-12細(xì)胞造成的炎性損傷,但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的探索分析。