肺缺血再灌注細胞模型的建立及Bag-1表達

王成 彭興男 李澤明 王越 李洋 呂紀玲

肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)是臨床中較為常見的病理過程,許多疾病如心肺復蘇后、肺移植、創傷、心臟手術、失血性休克、肺栓塞等均可導致該過程[1,2]。 LIRI帶來嚴重的經濟和社會負擔,患者合并該過程后往往需要氣管插管、機械通氣以及入住重癥監護室,從而導致住院時間延長、住院費用增加及死亡率升高。

自20世紀80年代中期以來,已有廣泛關于中性粒細胞、游離自由基和其他炎癥介導LIRI的研究[3]。90年代末,科學家們認識到LIRI可通過激活不同的炎癥途徑導致肺上皮細胞壞死或凋亡,進而引起肺損傷[4]。其中Bag-1是Takayama等在1995年發現的一種多功能抗凋亡基因,為Bag家族中的一員,可通過結合BCL-2(B淋巴細胞瘤-2基因)抑制細胞凋亡,促進細胞存活[5],Bag-1在腫瘤中的促進作用已較為明確[6],但在LIRI中的作用少有研究。本實驗通過建立缺血再灌注細胞模型,研究Bag-1在LIRI中的表達規律,以期為未來研究Bag-1作用提供實驗依據。

資料與方法

一、實驗材料

本實驗以A549細胞為研究模型,由青島大學生理學教研室提供,由青島大學機構審查委員會批準使用。 A549細胞用DMEM培養基:10%胎牛血清FBS,88%DMEM培養液及2%雙抗(100 U/mL 青霉 素+100 mg/L 鏈霉素)混合液培養,每2～3天更換一次培養基。置于 37 ℃、含5% CO2的培養箱內培養,每2～3天更換一次培養基。

二、方法

1.實驗分組

將A549細胞給予不同缺氧時間:0 h、6 h、12 h、18 h、24 h缺氧,再復氧24 h處理后,通過低溫、低氧、葡萄糖剝奪建立缺血再灌注細胞模型。

將處于對數生長期的A549細胞,以一5×103細胞/孔的密度接種于相應的細胞培養板中,每孔加DMEM培養基(含10%胎牛血清),置于 37℃、含5% CO2、95% O2的培養箱內培養使細胞充分貼壁于培養板中。當細胞匯合度達80%時,實驗組棄上清,用PBS清洗細胞后,換為不含血清的低糖細胞培養液,置于4℃缺氧裝置中使其分別缺氧不同時間來模擬缺血、缺氧過程,處理相應時間后,實驗組吸去不含血清的低糖細胞培養液,對照組吸去含10%胎牛血清的 DMEM 培養基,棄上清,更換為10%胎牛血清DMEM培養基,置于含5% CO2、37 ℃的培養箱內培養24小時,模擬再灌注過程。

2.細胞活性測定

處于對數生長期的A549細胞,以5×103細胞/孔的密度接種于96孔板中,每組設2個復孔,置37℃,5% CO2培養箱中培養24 h,模擬缺血再灌注過程,分別缺氧0、6、12、18、24小時后再復氧24小時,棄去DMEM培養基,加入10μL CCK-8試劑,90μL DMEM培養基,孵育2小時。以100μL DMEM培養基為空白。用酶標檢測儀檢測每組細胞在450nm波長處的吸光度。

3.乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase ,LDH)測定

將處于對數生長期的A549細胞按5×103細胞/孔的密度接種于96孔板中,每組設2個復孔,置37℃,5% CO2培養箱中培養24小時,模擬缺血再灌注細胞過程,再復氧24 h,收集各組培養液上清。按南京建成生物工程研究所LDH檢測試劑盒說明書進行。

4.活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)測定

用無血清培養液稀釋DCFH-DA為1 ∶1000,使終濃度為10μmol/L,將處于對數生長期的A549細胞接種到24孔板(密度),每組設2個復孔,置37℃,5% CO2培養箱中培養24小時,模擬缺血再灌注過程,再復氧24 h,棄去DMEM培養基,無血清細胞培養液洗滌細胞三次。將細胞收集,懸浮于1 ∶1000的DCFH-DA中,制備成濃度為107個/mL的細胞,放于37℃細胞培養箱內孵育20 min。每3～5 min顛倒混勻一次,使探針和細胞充分接觸。無血清細胞培養液洗滌細胞三次,充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。流式細胞儀檢測及分析數據。

5.蛋白質免疫印跡試驗(Western Blot,WB)

收集處理好的A549細胞,用冰冷的PBS洗滌三次。用冰冷的200μL放射免疫沉淀分析裂解物(RIPA)緩沖液提取細胞蛋白,然后加入2μL冰冷的苯基甲基磺酰氟(PMSF)裂解緩沖液和2 μL的冰冷磷酸酶抑制劑,作用30 min。將混合物以12000 rpm離心15 min,收集上清液部分。使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度,蛋白質在100°C下變性5 min。配膠、加樣、電泳、切膠、轉膜,加入相應一抗、二抗,用Fusion FX成像系統進行顯影分析。

三、統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析,符合正態分布的資料,用平均數±標準差表示,兩組以上比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-Q檢驗。P<0.05為具有統計學意義。

結 果

一、不同缺氧時間處理后A549細胞的CCK-8細胞活性測定

將A549細胞給予不同缺氧時間:0 h、6 h、12 h、18 h、24 h缺氧,再復氧24 h處理后,各組細胞活性結果顯示:缺氧組細胞活性均較對照組的細胞活性降低,并隨缺氧時間延長,細胞活性下降,各時間點間細胞活性存在顯著差異(F=85.03,P<0.001)(見圖1)。

圖1 A549細胞活性的變化注:與0 h組相比,*P<0.01;與6 h組相比,&P<0.01;與12 h組相比,▲P<0.01;與18 h組相比,$P<0.01

二、不同缺氧時間處理后A549細胞LDH及ROS濃度變化

將A549細胞給予不同缺氧時間:0 h、6 h、12 h、18 h、24 h缺氧,再復氧24 h處理后,各組細胞LDH及ROS濃度結果顯示:缺氧組LDH、ROS水平均較對照組明顯升高,各時間點間LDH(F=107.67,P<0.001)、ROS(F=42.61,P<0.001)水平差異存在顯著性,并隨缺氧時間延長,LDH、ROS濃度逐漸升高,組間相比有統計學差異(見表1)。

表1 A549細胞LDH及ROS濃度變化

三、Bag-1在肺缺血再灌注中的表達

將A549細胞給予不同缺氧時間:0 h、6 h、12 h、18 h、24 h缺氧,再復氧24 h處理后, WB 檢 測 Bag-1蛋白表達水平,結果顯示:Bag-1在肺缺血再灌注中6 h表達最高,后隨時間延長呈進行性下降(見圖2)。

圖2 不同缺血時間Bag-1的表達Western Blotting 檢測Bag-1蛋白表達注:a:Western Blotting 檢測 Bag-1蛋白表達;b:Bag-1 蛋白相對表達量(灰度值)。與0 h組比較,*P<0.01 ;與6 h組比較,#P<0.01

討 論

細胞模型能夠模擬活體細胞,用培養的細胞造成細胞損傷模型可觀察細胞的結構和形態功能變化,是與整體動物互補的一種基礎研究手段。缺血是一個低溫低氧過程,而再灌注是含氧血的再次供應。早在2000年,Cardella等人[7]利用人肺上皮細胞A549細胞模擬臨床肺移植的I/R細胞培養模型,在該模型中將細胞保存在有氧(100%氧濃度)和4°C低溫且低鉀的右旋糖酐葡萄糖溶液中不同時期以模擬缺血,隨后引入 37°C含10%胎牛血清的DMEM模擬缺血再灌注,培養并測定細胞附著和活力,證明A549細胞模型可用于研究肺缺血再灌注損傷在細胞和分子水平上相關的機制。氧葡萄糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)實驗模型,即細胞置于無血清培養基中,并放入含1% O2、5% CO2、94% N2的培養箱內培養,可使細胞活力下降到30%,模擬體內缺血/缺氧狀態[8]。OGD是一種體外缺血模型,可誘導多種形式如凋亡在內的細胞死亡。本實驗聯合Cardella的設計方法和OGD模型設計方法,將實驗組細胞培養在無血清低糖培養基中,將體外培養細胞置于4℃ N2、CO2等混合氣體的密閉容器形成低溫環境,物理性缺氧,比較好的模擬了體內缺血損傷中低溫缺血、缺氧狀態。然后應用37 ℃、含 5% CO2、95% O2的培養箱模擬細胞再灌注過程,成功建立了LIRI的細胞模型。

氧自由基、組織中性粒細胞的聚集、細胞內鈣(Ca2+)超載、細胞凋亡等是介導LIRI的主要病理生理機制[2]。LDH是廣泛存在于細胞內的一種糖酵解酶,缺氧/復氧可導致糖酵解增強,從而增加細胞內LDH,而且缺血再灌注可致使細胞生理功能破壞,進而發生一系列病理生化改變,如細胞膜通透性增高,受損細胞釋放出LDH進入細胞外,是反映細胞活性功能較敏感的生化指標。在缺血損傷過程中,LDH釋放到血液中,會增加乳酸的積累,乳酸的累積可導致缺血性損傷中的酸中毒,從而增加自由基并減少葡萄糖的使用,最終導致氧化應激和ATP(三磷酸腺苷)水平的降低。故培養液LDH濃度可以間接評價細胞損傷程度和壞死程度,本實驗證明,缺氧時間越長,LDH在細胞中積累量越多。

ROS是氧化應激產物,在大多數器官中,缺氧意味著缺乏電子受體,終止了氧化磷酸化和ATP的產生[9]。ATP的快速消耗導致線粒體膜電位的降低,由于膜電位的變化而產生ROS[10]。ROS通過脂質過氧化、損傷DNA和使許多蛋白質失活而產生損傷。ROS作用是雙重的[11],它的作用效果與其量具有明顯的劑量-效應關系:低劑量時發揮信號轉導作用,可促進細胞增殖;中劑量誘導細胞凋亡;高劑量則殺傷細胞。缺血再灌注導致ROS在細胞內大量積聚,ROS的爆發壓倒肺的抗氧化防御系統尤其是內皮細胞和肺泡巨噬細胞的線粒體,損害細胞代謝功能和信號傳導,ROS水平顯著增加可通過破壞微血管完整性而導致出血和水腫[12-14],另外,氧化應激增強了多種基因的轉錄,這些基因啟動白細胞上細胞表面粘附分子的翻譯和延長表達,以及細胞因子的釋放,以進一步促進缺血再灌注后中性粒細胞向肺的募集[15]。最終,由于中性粒細胞的活化和ROS的大量產生導致組織的損傷。本實驗證明,ROS在缺血缺氧的細胞中是一個逐漸積累的過程,提示細胞隨缺血缺氧時間延長,損傷逐漸加重。

Bag-1是Bag家族中的一員,主要包括三種亞型,即 Bag-1L,Bag-1S,Bag-1M。Bag-1 作為 BCL-2 結合蛋白,與 BCL-2 結合可增強 BCL-2 的抗凋亡作用。另外,Bag-1亦可通過 HSC70/HSP70 介導的 Bag 結構域與 BCL-2 結合發揮抗凋亡作用[16]。如肝缺血再灌注時,BCL-2 水平較非缺血時明顯升高,且共轉染實驗發現 Bag-1 可增強 BCL-2 的表達,說明高表達 BAG-1 可誘導 BCL-2 的表達增加,形成 Bag-1 和 BCL-2 的功能復合物來抑制 I/R 誘導的肝細胞凋亡[17]。研究發現,Bag-1在多種器官損傷中均有抗凋亡作用,如 Paul A.Townsend 等[18]發現 Bag 可以保護心肌細胞免受缺血/再灌注誘導的細胞凋亡,Bag-1S 和 Bag-1M 亞型的過度表達顯著降低缺血再灌注 (Ischemia-reperfusion,I/R)后心肌細胞的凋亡。Yanada S.等通過體外腺病毒基因轉錄高表達 Bag-1 可顯著改善大鼠肝臟 I/R 損傷后的門靜脈血流量,增加膽汁生成量,改善肝功能,改善肝臟移植的成功率[17]。Wang Y.等人發現Bag-1L 高表達也可保護 SH-SH5Y 細胞免受缺氧/復氧的損傷,提示 Bag-1L 在缺血性腦病中有一定保護作用[19]。另外,研究證明,Bag-1在多種惡性腫瘤中均具有抗凋亡作用[20, 21],表明Bag-1在多種組織損傷中都可作為靶向治療的目標分子。目前 Bag-1 在肺缺血再灌注細胞凋亡中的作用研究尚未見報道。本實驗證明,Bag-1 在肺缺血再灌注細胞中的表達呈現先升高,再降低趨勢,為后續研究Bag-1奠定了實驗基礎。

綜上所述,以上實驗結果表明,采用無糖、無血漿培養基,并嚴格控制氧濃度、溫度的物理性缺氧合并的方法,建立體外低溫、氧糖剝奪、復氧復溫模型,可成功模擬體內缺血缺氧再灌注過程,另外,通過檢測LHD、ROS、細胞活性以及Bag-1表達規律,為后續研究LIRI在分子與細胞水平的機制奠定實驗基礎。