烏梢蛇和金錢白花蛇中43種無機元素含量差異及判別分析

洪家順 鄒藝榮 王裕成 李道成 彭思思

江西省道地藥材質量評價研究中心，南昌 330029

烏梢蛇為游蛇科動物烏梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）的干燥體；金錢白花蛇為眼鏡蛇科動物銀環蛇Bungarus multicinctusBlyth 的幼蛇干燥體[1]，藥理研究表明，二者具有祛風、通絡、止痙[2]、抗炎鎮痛功效[3,4]，用于治療早期類風濕關節炎[5]、麻木拘攣、中風口眼 斜、半身不遂、抽搐痙攣、破傷風、麻風、皮膚瘙癢癥的治療[6]。由于療效明顯，且資源非常有限，以至于蛇藥材價格昂貴，此外，蛇藥材常以干燥體或粉末入藥，失去原本形狀，僅憑肉眼難以辨別真假，導致不法分子以假亂真現象層出不窮，嚴重影響藥物的有效性和安全性。為了有效區分金錢白花蛇和烏梢蛇與其它偽冒產品，學者們進行了大量研究，建立了鑒別烏梢蛇的方法有PCR 法、鱗片微形態、微性狀、HPCE指紋圖譜[7-11]。鑒別金錢白花蛇的方法有PCR 法、HPCE 指紋圖譜和DNA 條形碼技術[7,12，13]，但以無機元素為指標的研究很少。

根據無機元素含量的差異，可以有效辨別中藥材的種類和產地，已被廣泛應用于谷物、大米、大豆、甜瓜、西瓜、蜂蜜、牛奶、馬鈴薯、蕓豆，水產品，茶葉，中藥材等[14-18]。然而對研究烏梢蛇和金錢白花蛇中無機元素以及利用無機元素辨別蛇藥品的研究鮮有報道。實驗以金錢白花蛇、烏梢蛇及其炮制品為研究對象，利用ICP-MS 和ICP 測定了樣品中43 種無機元素含量，比較分析不同蛇種類及炮制后樣品的元素含量特征，結合主成分分析、正交偏最小二乘判別分析、線性判別分析，建立蛇樣品的無機元素指紋圖譜和樣品種類判別模型，以期為金錢白花蛇和烏梢蛇的識別、質量安全控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料試劑

（Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn）多元素標準溶液（批號：GSB04-1767-2004，100μg∕mL）,Rb（批號：GSB 04-2836-2011，1000μg∕mL），Mo（批號：GSB G 62035-90，1000μg∕mL），Cs〔批號：GSB 04-1724-2004（b）〕單元素標準溶液；Mg 標準溶液〔批號：GSB 04-1735-2004（b）,1000μg∕mL〕；Fe 標準溶液（批號：GSB 04-1726-2004,1000μg∕mL）；Al 標準溶液（批號：GSB 04-1713-2004,1000μg∕mL）；Zn 標準溶液（批號：GSB 04-1761-2004,1000μg∕mL）；采購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；Se（批號：22101835，1000μg∕mL）、Ge（批 號：22072635,1000μg ∕mL）、In（批 號：21122035,1000μg∕mL）采購于國家鋼鐵材料測試中心；UP 級硝酸（蘇州晶銳化學試劑公司），實驗用水為一級水。

金錢白花蛇和烏梢蛇藥材信息詳見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

1.2 主要設備

ETHOS UP微波消解儀和趕酸器（北京萊伯泰科）及趕酸器VB48 UP；ICAP RQ 電感耦合等離子體質譜（美國賽默飛）；ICAP 7400 型全譜直讀電感耦合等離子體發射光譜儀（美國賽默飛）；XSR205DU∕A 型電子天平（梅特勒-托利多），DHG-9240A 型臺式電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒），Pulverisette 11 刀式研磨儀（德國Fritsch）。

2 分析方法

2.1 實驗方法

準確稱取0.5g（精確至0.1mg）烘干2h的蛇樣品粉末于聚四氟乙烯消解罐中，緩緩加入5mL硝酸后，預消解過夜，根據預先設定的程序進行微波消解。試樣消解完成后，自然冷卻至室溫后取出，將消解液轉入50mL容量瓶中，用少量水潤洗消解罐3次，洗滌液合并于容量瓶中,超純水定容至刻度,搖勻，即得（如有少量沉淀，必要時離心分取上清液）。同法制備試劑空白溶液。

2.2 方法的線性與檢出限

在儀器狀態穩定下測定制備好的混合標準溶液，Mg、Fe、Al、Zn采用ICP測定，其他元素采用ICP-MS測定,結果見表2，各元素相關系數在0.997～1.000，表明線性關系良好。

表2 各元素線性方程、相關系數及檢出限Table 2 Linear equation,correlation coefficient and detection limit of each element

2.3 精密度和加標回收實驗

2.3.1 精密度試驗。按照設定的檢測方法進行測定，平行測試6 次，計算42 種無機元素峰強度的RSD 為0.8%～5.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗。取同一批蛇供試品進行6次平行測定，計算得到42種無機元素峰強度的RSD 為2.9%～8.1%，表明該方法重復性良好。

2.4 數據分析

采用EXCEL 2010 軟件對不同蛇樣品無機元素含量的原始數據進行分析，采用Origin 2022、SPSS 27.0和TBtools軟件進行統計分析和繪圖。

3 分析結果

3.1 元素含量特征

將處理好的烏梢蛇和金錢白花蛇樣品，按照預先建立的檢測方法進行測試，結果見表3。

由表3 可知，所測無機元素中，Be 在金錢白花蛇和烏梢蛇中均未檢出；金錢白花蛇及酒炒金錢白花蛇中元素含量較高的為Mg（1378.8～1474.5mg∕L），Zn（131.9～143.3 mg∕L），Ti（98.2～115.6 mg∕L），Fe（48.8～372.7mg∕L），Sr（36.4～39.9 mg∕L），Al（19.6～36.7 mg∕L），Rb（11.9～13.8 mg∕L）；烏梢蛇及酒烏梢蛇中元素含量較高的為Mg（1530.1～2100.8mg ∕L），Zn（126.3～169.8mg∕L），Ti（179.4～297.7 mg∕L），Fe（59.0～171.2 mg∕L），Sr（45.036～78.3 mg∕L），Al（19.0～26.2 mg∕L），Rb（2.8～5.7 mg∕L）；酒炒金錢白花蛇中Fe（均值319.5mg∕L）含量較金錢白花蛇中Fe 含量（均值56.7mg∕L）明顯增加，酒烏梢蛇中Ti（均值174.3mg∕L）含量較烏梢蛇中Ti（均值272.7mg∕L）含量明顯降低。

3.2 無機元素圖譜

由于蛇樣品中42 種無機元素（Be 未檢出，以下分析中除去）含量數量級差別較大，為了比較直觀準確地繪制質量分數分布無機元素圖譜，將不同元素的含量擴大或縮小至同一數量級，其中Cd、Ga、Tl、Bi 擴大1000倍，Li、Ni、Zr、V、Mo、Sn、Cs、Co、Mo、Sb、Co、Fe、Al擴大100 倍，Cr、Tb、Ho、Tm、Yb、Zn、Eu、Er、Lu 擴大10倍，Ba縮小10倍，Ti縮小100倍，然后以元素種類為橫坐標，相對含量為縱坐標，得到42 種元素相對質量分數分布曲線圖（見圖1）。17 批蛇樣品峰形相似，因種類和炮制的因素，相對含量有差異，但其譜線的形狀及走勢具有較高的相似性。

圖1 無機元素圖譜Figure 1 Inorganic element map

3.3 主成分分析

主成分分析是多元統計中一種數據挖掘技術，它能在不丟失主要變量信息的條件下選擇位數較少的新變量代替數量較多的原始變量，排除眾多化學信息共存中相互重疊的信息，降低了繁瑣數據的維數[19]。為研究無機元素與蛇樣品之間的相關性，采用SPSS 27.0 進行主成分分析。結果顯示，第1 主成分的方差貢獻率是40.29%，其它四個主成分的方差貢獻率分別是20.25%、11.49%、8.08%和4.27%，累計方差貢獻率為84.38%，表明前5個主成分代表了原始指標大部分的信息。如圖2 所示，第一主成分主要綜合了Rb、Cs、Se 的信息，第二主成分La、Y、Nd、Pr、Gd、Sm 的信息，第三主成分主要綜合了Mo、V的信息，第四主成分主要綜合了Lu、Tm 的信息，第五主成分主要綜合了Ni、As 的信息。為了較為直觀的分析，以前三個主成分得分繪制了3D 散點圖（見圖3），從圖中可知，除S2和S4 外，金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇聚集在一起，而烏梢蛇和酒烏梢蛇均有各自的聚類趨勢。這與聚類熱圖分析的結果一致。結果說明烏梢蛇、酒烏梢蛇可以完全區分，而對于金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇的區別需要進一步判別。

圖2 主成分的特征向量雷達圖Figure 2 Eigenvector Radar Diagram of Principal Components

圖3 PCA得分三維圖Figure 3 Three-dimensional plot of PCA score

3.4 正交偏最小二乘判別分析

運用SIMCA-P 14.1 軟件對17 批蛇樣品無機元素含量進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），建立的模型R2X=0.641，R2Y=0.843，Q2=0.668，均大于0.5，表明該模型穩定、可靠。為了進一步驗證該判別模型的可預測性，進行了200 次模型置換交叉檢驗（圖4B）。置換檢驗的R2=0.336，Q2=-0.521，表明該模型沒有過擬合現象（R2＜0.5，Q2＜0），具有統計學意義。利用OPLS-DA 模型的第1、2主成分得分繪制散點圖，如圖4A 所示，17 批蛇樣品聚為三簇。金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇處于第一；四象限、烏梢蛇處于第二象限；酒烏梢蛇處于第三象限。結果表明，從蛇的種類來說，OPLS-DA法可以很好的區分金錢白花蛇和烏梢蛇。經過炮制后，烏梢蛇和酒烏梢蛇聚集明顯且樣品點沒有重疊，仍然有較好的區分；金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇雖然沒有重疊但較為聚集，不能有效辨別，這與主成分分析結果一致。各元素VIP分值和荷載圖如圖4C和圖4D，各元素VIP 分值和荷載圖如圖4C和圖4D，VIP值對組間差異的影響大，可以作為篩選組間特征性成分的指標。以VIP＞1 為標準，得到24種元素（Fe、V、Lu、Cd、Co、Yb、Tm、Eu、Ba、Cu、Al、Cs、Zn、Mo、Rb、Sr、Mg、Ti、Bi、Ga、Se、As、Ho、Tb）在不同批次蛇中具有顯著差異。由荷載圖可知，以上24種元均距離遠點距離較遠，表明這24種元素可以作為區分金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇、烏梢蛇和酒烏梢蛇的特征元素。

圖4 不同批次蛇偏最小二乘判別分析，（A）得分圖；（B）排列實驗驗證結果；（C）無機元素VIP值分布圖；（D）荷載散點圖Figure 4 OPLS-DA of different batches of snakes,(A)Score plot;(B)The results of permutation experiments;(C)Distribution of VIP values for mineral elemental;(D)Loading scatter plot

3.5 線性判別分析

線性判別分析屬于有監督的判別分析方法，以投影后類內方差最小，類間方差最大的原則對數據進行降維，從而實現樣品的分類[19]。為了進一步考察各無機元素含量對四類蛇樣品的判別情況，以42種無機元素作為判別分析的自變量，對蛇樣品進行進行逐步判別分析，篩選出Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm共11種對蛇種類判別顯著的元素被引入到判別模型，構建了3個典型判別函數。Willks'Lambda 的檢驗結果進一步證實，在α=0.05 的顯著性水平下，3 個判別函數對分類效果均為顯著，表明判別模型擬合率可接受。判別函數F1、F2 和F3 解釋了100%變異（F1、F2 和F3 分別解釋了變異的96.9%、2.7%和0.4%），典型相關系數均在0.99 以上，其中函數F1 對蛇的分類占主要貢獻作用。判別函數如下所示：

式中ωMo、ωSb、ωFe、ωCo、ωRb、ωMg、ωCs、ωTl、ωLa、ωGd、ωTm代表蛇中Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm的質量分數。

以F1、F2 和F3 得分值繪制散點圖（見圖5），由圖5 可知，金錢白花蛇、酒炒金錢白花蛇、烏梢蛇和酒烏梢蛇有獨特的空間分布特征，4種蛇樣品無重疊現象，能夠有效的區分。利用回代檢驗和留一交叉驗證兩種方法對LDA判別模型進行驗證，判別分析結果如表4 所示，不同種類蛇樣品回代檢驗和留一法交叉檢驗的總體判別正確率均為100%，說明以Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm 11 種無機元素構建的判別模型可以有效的區別出不同品種的蛇類。4 種蛇的Fisher線性判別函數如下所示：

圖5 4種蛇樣品LDA得分散點Figure 5 Scatter points of LDA scores for four snake samples

表4 4種蛇樣品判別分析分類結果Table 4 Discriminant analysis and classification results of four snake samples

4 結論

通過分析蛇樣品中43種無機元素的含量，發現金錢白花蛇、酒炒金錢白花蛇、烏梢蛇及酒烏梢蛇中元素含量較高的均為Mg，Zn，Ti，Fe，Sr，Al，Rb；烏梢蛇中Cu、Ti 含量高，Zn 含量低，酒烏梢蛇中V、As、Mo、Cd、Sb、Co、Sr、Ba 含量高；金錢白花蛇中Lu 含量高，酒炒金錢白花蛇中Ga、Fe、Al 含量高；不同蛇樣品無機元素含量具有各自的特征。運用無機元素指紋圖譜、主成分分析、正交偏最小二乘判別分析和線性判別分析對4種蛇樣品進行判別分析。主成分分析可以完全區分烏梢蛇和金錢白花蛇，烏梢蛇和酒烏梢蛇，無法完全區分金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇。OPLS-DA 模型可以完全區分金錢白花蛇和烏梢蛇，烏梢蛇和酒烏梢蛇，而對金錢白花蛇和酒炒金錢白花蛇辨別度低；基于Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm 11 種無機元素的線性判別模型有效的區分4 種蛇樣品，回代檢驗和留一叉法交叉檢驗的整體正確判別率均為100%。實驗僅對金錢白花蛇、酒炒金錢白花蛇、烏梢蛇和酒烏梢蛇進行了初步研究，研究結果的普適性任然需要多批次種類樣本的支撐，從而建立更加精準、穩定、實用的蛇分類判別模型，為蛇的真偽、分類判別提供基礎數據和技術支撐。