基于全自動免疫磁珠凈化技術(shù)快速測定中藥材中4種黃曲霉毒素

黃曉靜，陳素云，周 恒*，王 江，果 旗，王 雄，胡 青，季 申*

（1.上海市食品藥品檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，上海 201203；2.北京中檢維康生物技術(shù)有限公司，北京 100044）

黃曲霉毒素（AFs）是一類二氫呋喃香豆素的衍生物，主要由黃曲霉（A. flavus）和寄生曲霉（A.paraciticus）代謝產(chǎn)生，極易污染糧油食品和中藥［1］。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）列為一級致癌物，其具有顯著的肝毒性［2-4］。目前，全球各主要國家均出臺了針對該4 種黃曲霉毒素的限量法規(guī)，以降低潛在的安全風險［5-7］。

目前在不同類型的中藥材（CMM）中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素污染情況［6］，如桃仁、柏子仁等種子類藥材［8］，延胡索、遠志等根莖類藥材［9-10］，土鱉蟲、僵蠶等動物類藥材［11］，以及神曲、淡豆豉等發(fā)酵類藥材［6，12］，中藥材及飲片中黃曲霉毒素的污染情況不容樂觀。然而，中藥材中黃曲霉毒素檢測存在諸多挑戰(zhàn)和難點。相比于食品，中藥材為干性物質(zhì)，初級和次級代謝產(chǎn)物較多，含有不同類型干擾成分，給黃曲霉毒素的痕量分析帶來了極大挑戰(zhàn)［6］。

因此，對于中藥中黃曲霉毒素的檢測，樣品前處理顯得至關(guān)重要，直接影響結(jié)果的靈敏度、準確性及重現(xiàn)性。目前，AFs 的前處理方法主要包括直接提取［13］、液液微萃取（LLE）［14］、固相萃取（SPE）［15］、QuEChERS［16］和免疫親和柱法（IAC）等［5，17-18］。其中IAC 具有高特異性、高選擇性和穩(wěn)定性，是目前測定食品、中藥中黃曲霉毒素較為常用的前處理方法。中國藥典、美國藥典等官方標準以及國際標準化組織（ISO）等官方組織均推薦采用IAC 法對黃曲霉毒素進行富集凈化［18］。然而，IAC 存在操作步驟繁瑣、耗時長、成本高等缺點，亟需開發(fā)耗時短、成本低及適合批量檢測的樣品提取凈化新方案。

近年來，免疫親和磁珠（IMB）作為一種新型的分離材料，逐步應用于免疫檢測、分子生物學等領域。IMB 是一種具有磁性的免疫微球［19］，可依靠外界磁力實現(xiàn)快速分離，避免了繁瑣的過濾或離心過程，消耗溶劑少，操作簡單，大大縮短了前處理時間［3］。IMB 具有較大的比表面積和較好的分散特性，大大縮短了平衡時間，增強了抗原抗體間的相互作用，從而提高了吸附量和檢測靈敏度；同時規(guī)避了IAC存在的阻塞問題［20］。近年來，IMB逐漸被應用于食品與糧油中各種真菌毒素的檢測［21-23］。然而，其在中藥中真菌毒素的檢測研究相對較少。

本研究將黃曲霉毒素免疫磁珠試劑盒與自動化前處理程序相結(jié)合，基于中藥基質(zhì)特性和黃曲霉毒素特點，建立了一種適用于不同類型中藥基質(zhì)中黃曲霉毒素快速批量分析的高效液相色譜方法。該方法具有良好的線性、靈敏度、準確性和重現(xiàn)性；大大縮短了前處理時間，降低了人力和實驗成本，有效減少了操作誤差，克服了傳統(tǒng)柱式凈化方法的缺點，具有廣闊的應用前景。

圖1 4種黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of 4 aflatoxins

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Mettler Toledo XS204電子天平（美國Mettler Toledo公司）；IKA KS260平式振蕩儀（德國IKA公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore 公司）；Fisher STD 迷你渦旋混合器（美國Fisher Scientific 公司）；5415R型高速離心機、移液槍（德國Eppendorf公司）。

IMB-103A 20T 黃曲霉毒素總量免疫磁珠（IMB，北京中檢維康生物技術(shù)有限公司）；CNtest 黃曲霉毒素總量親和柱-中藥專用（北京中檢維康生物技術(shù)有限公司）；Inertsil ODS-3C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Shimadzu公司）；Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司）；0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜（PTFE濾膜，美國Agilent公司） 。

標準物質(zhì)：AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的混合標準溶液（質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；黃曲霉毒素總量免疫磁珠試劑盒（北京中檢維康生物技術(shù)有限公司）；乙腈（ACN）、甲醇（色譜純，德國Merck公司）。

樣品：蓮子、檳榔、薏苡仁、土鱉蟲、延胡索5 種藥材樣品均為國家或地方抽檢樣品，均由上海市食品藥品檢驗研究院中藥天然藥物/保健食品所楊新華主管藥師鑒定為正品。

1.2 溶液制備

標準儲備液：精密量取黃曲霉毒素混合標準溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的質(zhì)量濃度分別為100、30、100、30 ng·mL-1）；混合對照品溶液（1）：精密量取標準儲備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻即得；混合對照品溶液（2）：精密吸取對照品溶液（1）1.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀和0.2 g氯化鉀，加入990 mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水稀釋至1 000 mL，即得。

0.5%吐溫20-磷酸鹽緩沖液（0.5% PBST）：吸取5 mL 吐溫20，加入995 mL 磷酸鹽緩沖液，混勻即得。

1.3 全自動免疫磁珠自動凈化-高效液相色譜測定系統(tǒng)

自動凈化富集系統(tǒng)：使用Auto IMB-24T 型真菌毒素全自動凈化儀（北京中檢維康生物技術(shù)有限公司）內(nèi)置的黃曲霉毒素凈化富集程序。

液相色譜系統(tǒng)：LC-20AD 型高效液相色譜儀（Shimadzu 公司），搭載CT0-20AC 柱溫箱、PR-1000光化學衍生儀及RF-20AXS檢測器。

1.4 色譜條件

Inertsil ODS-3C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-甲醇-水（33∶11∶56）為流動相，等度洗脫，流速為1.0 mL·min-1；經(jīng)光化學衍生，熒光檢測器：激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為450 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

1.5 樣品前處理

將樣品粉碎（過2 號篩），精密稱取5.0 g，加入1.0 g 氯化鈉置于50 mL 離心管中，精密加入20 mL乙腈-水（9∶1），置于平板振蕩儀（490 r/min）中振蕩提取30 min，以3900 r/min 離心5 min；精密吸取1 mL上清液加入免疫磁珠試劑盒的結(jié)合孔中（孔中加入5 mL 0.5%吐溫20-PBS結(jié)合液，2個淋洗孔中加入2 mL水，洗脫孔中加入0.5 mL 0.5%乙酸甲醇），在磁棒外部套上一次性磁棒套。設置黃曲霉毒素自動凈化程序：結(jié)合時間5 min，洗脫時間5 min，開啟凈化程序，待結(jié)束后吸取洗脫液，加水定容至1 mL，渦旋混勻后過0.22 μm PTFE濾膜。全自動免疫磁珠凈化檢測流程如圖2所示。

圖2 全自動免疫磁珠凈化檢測流程圖Fig.2 Flow chart of automatic purification based on immunomagnetic beads

圖3 檳榔中不同提取溶劑條件下4種黃曲霉毒素的回收率Fig.3 Recoveries of 4 aflatoxins in different extraction solvents in Arecae semen

2 結(jié)果與討論

2.1 中藥研究品種的選擇

《中國藥典》2020年版一部中收錄黃曲霉毒素限量要求的中藥品種增至24種［24］。為保證分析方法的適用性，本研究以藥典中有黃曲霉毒素限量要求且日常監(jiān)測中黃曲霉毒素檢出頻次較高的品種為主要對象，盡可能涵蓋不同藥用部位和不同大類成分的藥材基質(zhì)，最終選擇5 種易污染黃曲霉毒素的中藥材，分別為果實種子類藥材蓮子、檳榔與薏苡仁，動物類藥材土鱉蟲及根莖類藥材延胡索。

因檳榔的初級和次級代謝產(chǎn)物種類較多，色素含量高，且易污染黃曲霉毒素，是典型的果實種子類中藥材，故主要以檳榔基質(zhì)為代表進行方法優(yōu)化，然后將建立的方法應用于其余4 種基質(zhì)進行方法學驗證，考察其適用性。

2.2 提取條件的優(yōu)化

黃曲霉毒素的極性較大，常采用不同比例的甲醇或乙腈水溶液作為提取溶劑。《中國藥典》2020年版四部＜2351真菌毒素測定法＞中采用70%甲醇作為提取溶劑［25］，而文獻表明，乙腈相比甲醇提取體系可獲得更高的提取效率［2，13］。在1.5 μg·kg-1（以AFB1計）水平下進行加標實驗（n=3），比較了不同比例的甲醇-水和乙腈-水作為提取溶劑時的效果。實驗發(fā)現(xiàn)以乙腈-水（8∶2）、乙腈-水（9∶1）為提取溶劑時，4 種黃曲霉毒素的提取效率最高，回收率均能達到80%以上（見圖2），且雜質(zhì)提取最少。以乙腈-水為提取溶劑時的提取效率高于甲醇-水，而減少水相的比例，可更大程度減少基質(zhì)中極性干擾成分的共提取，提高后續(xù)凈化時免疫親和的效率，因此選擇乙腈-水（9∶1）為提取溶劑。

進一步考察了樣品提取步驟中添加氯化鈉的必要性，實驗發(fā)現(xiàn)添加氯化鈉的供試品溶液相對澄清，而不添加氯化鈉的供試品溶液則較為渾濁，且4 種黃曲霉毒素的提取效率也受到較大影響。推測引入氯化鈉可增加蛋白質(zhì)的析出，同時能有效減少樣品中雜質(zhì)的提取，進而提高了黃曲霉毒素的提取效率，最終確定添加1 g氯化鈉。

2.3 全自動免疫磁珠凈化儀參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 結(jié)合液種類與體積的優(yōu)化不同類型中藥材基質(zhì)的提取液pH 值存在差異，且提取液中某些干擾成分會占據(jù)抗體結(jié)合位點，影響免疫磁珠的抗體活性，造成黃曲霉毒素的加標回收率偏低。因此，針對樣品結(jié)合液種類及體積（即樣品稀釋比）進行了優(yōu)化。吸取1 mL 樣品上清液，加至裝有5 mL不同結(jié)合液的結(jié)合孔中，使用200 μL 磁珠進行凈化，0.5 mL 甲醇洗脫，結(jié)合時間與洗脫時間均設為10 min。實驗發(fā)現(xiàn)樣品結(jié)合液采用0.5%吐溫20-PBS 時，4 種黃曲霉毒素均能獲得較高的回收率（見圖4）。

圖4 檳榔中不同結(jié)合液條件下4種黃曲霉毒素的回收率Fig.4 Recoveries of 4 aflatoxins in different capture solvents in Arecae semen

進一步考察了吐溫20的添加比例，發(fā)現(xiàn)以0.5%吐溫20-PBS 作為結(jié)合液時，對檳榔基質(zhì)的富集凈化效果達到最佳，且其它基質(zhì)在此條件下的富集凈化效果均較好，回收率均較高。

由于樣品提取溶劑為乙腈-水（9∶1），有機相比例高會導致免疫抗體失活而影響凈化效率。對結(jié)合液體積進行了考察，發(fā)現(xiàn)在樣品液-結(jié)合液的體積比為1∶5條件下，4種黃曲霉毒素的回收率均達到最高，增大結(jié)合液的體積并未展現(xiàn)出更多優(yōu)勢。可見采用5 倍的結(jié)合液體積稀釋，能獲得最佳的富集凈化效果。綜上，實驗選擇結(jié)合液為0.5%吐溫20-PBS，結(jié)合液體積為5 mL。

2.3.2 免疫磁珠的載量及使用量確認免疫磁珠的載量將直接影響黃曲霉毒素的分析容量，為保證免疫磁珠對黃曲霉毒素的吸附量達到市售免疫親和柱的同等載量，需對免疫磁珠的載量進行確認。分別將50、100、200、250 μL的免疫磁珠與陽性檳榔樣品提取液1 mL（上樣黃曲霉毒素總量約為200 ng）在5 mL 0.5%吐溫20-PBS 結(jié)合液中充分混合，進行富集凈化，結(jié)合時間與洗脫時間均設為10 min，采用0.5 mL 甲醇洗脫。如表1 所示，免疫磁珠的用量不低于200 μL 時的測定結(jié)果與免疫親和柱基本一致。最終確認免疫磁珠用量為200 μL，以達到市售3 mL規(guī)格免疫親和柱的分析容量。

表1 不同免疫磁珠用量下陽性檳榔樣品中的黃曲霉毒素含量Table 1 Aflatoxin contents of positive Arecae Semen sample under different dosage of IMBs

2.3.3 富集凈化時間的優(yōu)化在0.5%吐溫20-PBS 結(jié)合液及室溫條件下，考察了不同富集凈化時間下免疫磁珠對4種黃曲霉毒素的富集凈化效果。添加黃曲霉毒素混合對照品總量260 ng（即1.0 mL標準儲備液）于結(jié)合液中，分別在不同結(jié)合時間下進行富集凈化后，吸出免疫磁珠，取出結(jié)合液上清液，直接檢測剩余黃曲霉毒素量。結(jié)果表明，免疫磁珠對4 種黃曲霉毒素的富集量在4 min 后基本達到飽和，最終確定富集凈化時間為5 min。

2.3.4 洗脫溶劑與洗脫時間的優(yōu)化考察了不同洗脫溶劑和洗脫時間對黃曲霉毒素洗脫效果的影響。取1 mL樣品上清液，采用5 mL 0.5%吐溫20-PBS結(jié)合液稀釋，使用200 μL磁珠凈化，結(jié)合時間設為5 min，分別采用0.5 mL 甲醇和0.5%乙酸甲醇為洗脫溶劑，分別測定洗脫時間為2、4、5、6、8 min 時洗脫液中的黃曲霉毒素量。研究發(fā)現(xiàn)，0.5%乙酸甲醇的洗脫效率與甲醇相近，但所需洗脫時間更短，甲醇完全洗脫需要6 min，而0.5%乙酸甲醇僅需4 min。為保證不同基質(zhì)洗脫完全，最終選定0.5%乙酸甲醇為洗脫溶劑，洗脫時間為5 min。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性對5 種中藥材基質(zhì)進行專屬性驗證，發(fā)現(xiàn)本方法的專屬性良好，5 種藥材基質(zhì)中雜質(zhì)的色譜峰均不干擾4種黃曲霉毒素的測定，分離度良好。

2.4.2 線性關(guān)系取黃曲霉毒素混合對照品溶液（2）分別進樣2、5、10 μL，另取黃曲霉毒素混合對照品溶液（1）分別進樣5、10、20 μL，記錄色譜圖，以黃曲霉毒素的質(zhì)量（X，pg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。該方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均達到0.9999（見表2）。

表2 4種黃曲霉毒素的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 2 Linear relationship，limits of detection and limits of quantitation of 4 aflatoxins

2.4.3 檢出限與定量下限在5 種陰性中藥基質(zhì)樣品中分別進行0.2、0.4μg·kg-1（以AFB1計）2 個水平的加標實驗，按建立的方法進行樣品前處理和測定。分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到4種黃曲霉毒素的檢出限為0.06～0.2 μg·kg-1，定量下限為0.12～0.40μg·kg-1（見表2）。

2.4.4 精密度取黃曲霉毒素混合對照溶液（2），進樣10 μL，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。計算AFG2、AFG1、AFB2、AFB1的相對標準偏差（RSD）分別為0.20%、0.90%、0.20%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性取5 種中藥材基質(zhì)的陰性樣品，在5μg·kg-1（以AFB1計）的水平下添加黃曲霉毒素混合對照品儲備溶液，按建立的方法制備供試品溶液，于制備后0、4、8、12、24 h進樣分析，記錄峰面積。蓮子、檳榔、薏苡仁、土鱉蟲和延胡索中4 種黃曲霉毒素峰面積的RSD分別不大于1.9%、1.6%、1.4%、1.9%和1.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加標回收率及相對標準偏差取5 種中藥材基質(zhì)的陰性樣品，進行0.4、5、25μg·kg-1（以AFB1計）3 個水平的加標回收實驗，每個水平下按“1.5”方法分別制備6 份樣品，采用“1.4”色譜條件進行測定。結(jié)果表明，5 種中藥材基質(zhì)中4 種黃曲霉毒素的平均回收率為71.9%～116% ，RSD 為0.10%～6.9%（表3），能夠滿足《中國藥典》的方法學驗證要求［25］。

表3 5種中藥基質(zhì)中4種黃曲霉毒素的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 4 aflatoxins in 5 CMMs（n=6）

2.5 方法對比

2.5.1 實際樣品測定采用免疫磁珠凈化方法和傳統(tǒng)免疫親和柱凈化方法分別測定了20 批檳榔及蓮子陽性樣品中4種黃曲霉毒素的含量。結(jié)果表明，兩種方法測定的含量基本一致。以AFB1為例，兩者測定結(jié)果擬合曲線的r2為0.997（圖5）。

圖5 20批陽性樣本中IMB和IAC方法測定AFB1的結(jié)果對比Fig.5 Comparison of IMB and IAC methods for the determination of AFB1 in 20 batches positive samples

2.5.2 加樣平行性對比以檳榔、土鱉蟲和延胡索為基質(zhì)樣品，在5μg·kg-1（以AFB1計）加標水平下，分別采用本方法及IAC 測定法（n=6）進行回收率對比實驗。結(jié)果表明，本方法的準確性和平行性更優(yōu)，相比IAC 法RSD 降低2～3 倍（見表4）。特別是對于延胡索中AFG2的加標回收率可提高約10%～20%，這可能與磁珠具有更大的比表面積及結(jié)合效率有關(guān)。

表4 不同基質(zhì)中IMB和IAC方法重復性的比較Table 4 Comparison of IMB and IAC methods for the repeatabilities in different matrices

表 5 IMB和IAC方法對比Table 5 Comparison of IMB and IAC methods

2.5.3 其他指標對比如表5 所示，基于自動化程序，免疫磁珠凈化方法可同時處理24 份樣品，前處理時間僅需18 min，而傳統(tǒng)IAC 方法約需2 h，前處理效率提高了近85%，特別適用于通量高、時間短的快速定量分析場景。此外，免疫磁珠前處理過程中消耗試劑、產(chǎn)生廢液均大幅減少，更符合綠色環(huán)保的分析要求。

3 結(jié) 論

本研究基于全自動免疫磁珠凈化前處理技術(shù)，通過優(yōu)化提取溶劑、IMB 用量、結(jié)合液種類與體積等參數(shù)，建立了中藥材中4種黃曲霉毒素的快速測定方法，并應用于5 種中藥材基質(zhì)進行方法學驗證。結(jié)果表明，所建方法具有良好的線性、檢出限、定量下限、準確性和重現(xiàn)性。未來，隨著免疫磁珠可搭載抗體種類的逐漸豐富以及抗干擾能力的提升，全自動免疫磁珠技術(shù)將在中藥材、飲片及中成藥的單類或多類真菌毒素快速分析領域發(fā)揮更為重要的作用。