豬流行性腹瀉疫苗研究進展

吳鈺宸 曹劍 孫彥軍 劉強德 張常鎖 賀筍

摘要：豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和高死亡率為特征，多發生于豬的初生、斷奶、育肥等重要階段。目前，世界各國都已將該病作為豬病的重點防控對象，我國也將其列為重大動物疫病之一，采取了嚴格的免疫程序以控制該病，疫苗是防控本病最重要的手段。本文就近年來豬流行性腹瀉疫苗研究進展進行綜述，以期為該病的防控提供參考。

關鍵詞：豬；豬流行性腹瀉；疫苗；研究進展

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種病毒性疾病[1]。PEDV主要感染豬腸道，引起豬的腹瀉、嘔吐、食欲不振等癥狀。PEDV可通過糞便、呼吸道分泌物等途徑傳播，病毒顆粒在環境中具有較強的穩定性，容易在豬場等集約化養殖場所傳播。PEDV對幼豬的影響尤其嚴重，感染后的幼豬易出現腹瀉、嘔吐等癥狀，病死率較高[2]。

PEDV最初于1971年在英國被發現，后在歐、美、亞洲等地區均有分布。近年來，PEDV在中國大陸等地區暴發流行，給養豬業帶來了嚴重的經濟損失。目前，針對PEDV的疫苗已經開發出來，但是PEDV的變異性較大，疫苗的研發和應用仍面臨一定的挑戰。本文通過對豬流行性腹瀉病毒的病毒學特征、流行病學特點以及疫苗研究最新的研究進展進行詳細綜述，以期能為該病的防控及疫苗研發等工作提供一個理論參考。

1 PEDV

PEDV是一種單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科，α-冠狀病毒屬。其病毒粒子形態呈圓形或多邊形，直徑范圍為90～190 nm，平均直徑130 nm。PEDV的病毒粒子由四個主要結構組成，分別是外膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）和纖突蛋白（S蛋白）。PEDV對于外界的抵抗力相對較弱，對氯仿乙醚等敏感，酸堿、甲醛、脂溶劑等消毒劑都可輕松將其殺滅。

2 流行病學

豬流行性腹瀉主要通過口鼻分泌物、糞便等途徑傳播。最早于1971年在英國被發現，目前已在全球多個地區流行。其主要感染幼豬，成年豬一般不易感染，但對于未感染過的成年豬，也存在一定的感染風險。具有高度的傳染性，病毒顆粒可以通過空氣、食物、水、器具等多種途徑傳播，其中最主要的傳播途徑是直接接觸感染和糞-口傳播。PED發病率和死亡率很高，仔豬病毒感染后，出現急性腹瀉、嘔吐、發熱等癥狀，嚴重者可導致死亡。對豬業造成了很大的經濟損失，因為它不僅會導致豬只死亡，還會導致生長發育受阻、飼料利用率下降等問題，從而影響豬只的生產效益。

3 豬流行性腹瀉病毒疫苗研究相關進展

3.1 傳統疫苗

1）滅活疫苗。通過將病原體滅活后制成的，因此不會引起疾病，但可以刺激豬體內的免疫系統產生抗體，從而在接觸到真正的病原體時提供保護作用。該疫苗通常在豬的幼年時期接種，可以有效地預防豬流行性腹瀉的發生。2016年，利用PEDV韓國流行毒株KNU-141112生產制造的滅活疫苗，通過妊娠母豬產前6周、3周進行肌肉注射免疫后，利用強毒毒株進行激發后，仔豬的存活率達到92%，仔豬腹瀉減少[3]。鄭培等[4]研究表明，采取在母豬產前30和15d進行免疫后，母豬的血清及初乳中可以產生高水平且穩定的IgG、IgA特異性抗體以及中和抗體，對于仔豬的保護效果顯著。

2）減毒活疫苗。該疫苗是通過將豬流行性腹瀉病毒進行減毒處理，制成的一種活疫苗。通過將豬流行性腹瀉病毒進行體外培養和多次傳代，減弱其病原性，使其仍然能夠在宿主體內產生免疫效應，但不會引起嚴重的疾病反應。減毒活疫苗接種后，病毒能夠在豬體內復制，引起一定的免疫反應，從而使豬體內產生針對病毒的特異性免疫反應，形成免疫保護，預防豬流行性腹瀉的發生和傳播。其具有高效保護、安全性高、經濟性強、方便易用等優勢。Deng等[5]通過誘導干擾素早期I型和Ⅲ型的轉錄激活過程，將PEDV EndoU中226點位上的組氨酸（H）突變為丙氨酸（A），其病毒的毒力明顯削弱。

3.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗與傳統的滅活疫苗和減毒活疫苗比較，其最大的優點就是安全性較高，抗原成分清晰、沒有引起機體不良反應的其他抗原，其還有生產成本低廉、產量高等優點。但是缺點也同樣明顯，疫苗抗體水平較低、免疫原性較弱，保護期較短[6]。亞單位疫苗免疫原性水平較低的問題可通過與佐劑或者免疫增強劑聯合使用提高免疫原性水平[7]。

Hou等[8]利用乳酸桿菌表達PEDV-N蛋白，結果表明，能夠刺激仔豬腸道黏膜產生高水平的黏膜IgA和循環IgG對PEDV抗原N的免疫反應。Zhao等[9]利用不同表達系統表達了部分PEDV S蛋白，通過口服、肌肉注射等不同免疫方式給小鼠或豬進行免疫，均能表達出高水平的抗體。郭濤[10]構建重組表達菌株，通過包涵體形式表達出大小約為35 kDa的重組PEDV COE蛋白，通過口服的方式免疫仔豬后，在糞便和唾液中只能檢測到低水平的特異性sIgA抗體，但是通過肌肉注射的方式進行免疫，能夠刺激仔豬血清中的IgG明顯升高。

3.3 核酸疫苗

目前各種疫苗都有其優缺點，滅活疫苗的研發周期相對較短，但疫苗的免疫原性較差。減毒活疫苗的免疫原性良好，但研發周期較長。然而，PEDV的基因組一直在發生著變異，此時就需要一種安全性高、成本低、研發周期短以及設計簡單的疫苗。核酸疫苗應運而生，其中包括DNA疫苗和mRNA疫苗。根據Naik[11]書中所寫，疫苗研制平臺一旦建立，其相互通用，只需要將有效的中和抗原基因序列合成并插入到適當的表達載體中，就有可能在短時間內開發出針對新暴發、大規模流行性傳染病的疫苗。Yin等[12]構建了共表達PoRV VP7蛋白和PEDV S蛋白的DNA疫苗，小鼠經過免疫后，出現高水平的免疫應答。目前，核酸疫苗在新冠疫情的過程中大規模應用，其抗體產生快、保護率高、對變異毒株也能有效保護等優勢已經顯現，相信隨著技術的不斷發展，mRNA技術的進步，核酸疫苗在獸用疫苗領域的應用指日可待。

3.4 轉基因植物疫苗

轉基因植物疫苗是利用轉基因技術將特定病原體的抗原基因導入植物細胞中，使植物細胞能夠表達出相應的抗原蛋白，從而制造出具有免疫作用的疫苗。相比傳統疫苗制造方法，轉基因植物疫苗具有生產成本低、易于大規模生產、保存和運輸等優勢。其不僅可以單獨使用引起機體的免疫反應，也可以與常規疫苗聯用，達到加強免疫的效果[13]。Tien等[14]利用PEDV核心中和表位（COE）制作一種的PEDV候選疫苗，將COE連接到聚合免疫球蛋白G支架（PIG）上，并在煙草植物中得到表達。小鼠免疫試驗證明可誘導全身和黏膜抗原特異性免疫反應。Egelkrout等[15]表達了含有PEDV S1纖突蛋白的玉米，并與載體蛋白大腸桿菌熱不穩定亞基（LTB）和樹突狀細胞（DC）結合肽融合，抗原水平高于20 mg/kg。豬口服給藥可誘導血清中和抗體，可用于飼料中。

4 總結與展望

近年來，隨著分子生物學技術的快速發展，人們對PEDV的認識不斷深入，也使PEDV疫苗的研發取得了很大的進展。隨著基因工程技術的不斷發展，將會有更多新型疫苗在動物上進行試驗研究。但是由于PEDV在世界范圍內流行時間較長，已有的疫苗在不同地區或國家的適應性、保護效果和安全性等方面存在差異，所以對于PEDV的研究仍然具有很大的挑戰性。另外，病毒感染后機體免疫應答系統變化很大，因此單一蛋白或者單一基因工程亞單位疫苗無法解決所有問題。在今后的研究中，將會結合基因工程、蛋白質工程和納米生物技術等手段對病毒蛋白或基因進行改造和優化，進一步提高疫苗免疫效果和安全性。另外，滅活疫苗雖然有較好的安全性、有效性和免疫原性，但是它仍然存在一些缺陷和不足之處。因此，研究開發新型疫苗將成為今后PEDV研究的熱點。目前，PEDV滅活疫苗仍存在以下問題：①由于目前的滅活苗沒有針對病毒變異株的新型佐劑，所以保護效果較差；②滅活苗制備過程中，會有較多的毒素和雜質進入疫苗中，導致疫苗質量不穩定；③滅活苗不能誘導動物產生保護性抗體，這是因為滅活苗的抗原含量太少，無法刺激動物產生足夠的抗體；④滅活苗只能提供細胞免疫應答，而細胞免疫應答往往不足以抵抗病毒感染。

此外，PEDV疫苗研制應考慮以下問題：①豬只接種疫苗后產生抗體需要一定時間，所以應根據豬只不同生長階段制定合理的免疫程序；②接種疫苗后產生抗體是機體產生免疫保護的基礎，因此需要加強對抗體水平的監測和對抗體消長規律的研究；③PEDV病毒株變異較快，所以疫苗需要定期更換；④現有疫苗都是滅活疫苗，所以需要開發和研究新型的佐劑及佐劑載體以提高疫苗免疫效果；⑤滅活苗需要在低溫環境下保存和運輸，而疫苗穩定性對于動物來說非常重要，因此需要對疫苗保存條件進行研究。

總之，隨著分子生物學技術和分子生物學理論在PEDV研究中的不斷深入應用，PEDV研究也必將會取得更多更好的進展。相信在不久的將來，在大家共同努力下PEDV一定會被有效控制。但由于PEDV的復雜性和多樣性以及人們對其認識上的局限性，還需要更多高質量、安全有效、低成本和易推廣應用的PEDV疫苗。

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