萊陽地區(qū)雞場沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

萬惠愚

摘要：為了分析萊陽地區(qū)雞場中沙門菌的流行情況和耐藥性情況，2022-2023年采集萊陽地區(qū)中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份，采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化試驗鑒定及PCR擴(kuò)增鑒定等多種方法進(jìn)行沙門菌分離鑒定。采用人工感染試驗動物和K-B藥敏紙片法對分別檢測分離的沙門菌的致病性及對常用藥物的耐藥性。結(jié)果表明，從萊陽地區(qū)中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份中分離得到119株沙門菌，其中82株菌可以引起雛雞的發(fā)病與死亡，對雛雞的死亡率在40%之間；82株致病性沙門菌對磺胺間甲氧嘧啶、多西環(huán)素、新霉素等8種藥物耐藥率在58.5%～100.0%之間，對其他藥物存在不同程度耐藥性。結(jié)果表明，從萊陽地區(qū)雞場中得到92株致病性沙門菌對常用的抗菌藥產(chǎn)生不同的耐藥性。本研究為萊陽地區(qū)雞場中沙門菌的流行病調(diào)查及指導(dǎo)臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞；沙門菌；分離鑒定；致病性；耐藥性

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，我國的蛋雞和肉雞的養(yǎng)殖數(shù)量呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，蛋雞和肉雞的養(yǎng)殖模式已經(jīng)形成規(guī)模化、集約化的養(yǎng)殖模式，我國成為蛋雞和肉雞生產(chǎn)與消費大國，在蛋雞和肉雞的養(yǎng)殖過程中，沙門菌成為危害我國蛋雞和肉雞的主要細(xì)菌性疾病之一[1]。國內(nèi)外許多相關(guān)研究表明，不同血清型的沙門菌在世界各個國家不同地區(qū)的雞場中廣泛流行，尤其是不同血清型的沙門菌在不同地區(qū)中蛋雞和肉雞的種雞場中流行，主要由于該菌可以通過水平傳播和垂直傳播，目前沒有有效的沙門菌疫苗對種雞場進(jìn)行免疫，也是導(dǎo)致不同血清型沙門菌在不同地區(qū)蛋雞和肉雞的種雞場中流行的主要因素之一[2]。沙門菌不僅可以引起豬、雞、鴨、鵝、牛、羊等多種動物發(fā)病，同時也是臨床中常見的食源性病原菌之一，該菌可以作為主要的食源性病原菌引起人的感染，人通過食源性感染沙門菌，該菌感染人后臨床中主要以腸炎、腹瀉為主，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致其死亡，因此，沙門菌成為臨床中重要的人畜共患的病原菌[3-4]。相關(guān)研究表明，雞、鴨、鵝等家禽是沙門菌主要的攜帶宿主之一，該菌在不同地區(qū)不同雞場中廣泛流行，尤其是對蛋雞和肉雞的種雞場中沙門菌的凈化與防控具有重要的意義[5]。在蛋雞和肉雞的養(yǎng)殖過程中由于沒有有效的疫苗，主要通過抗菌藥物進(jìn)行治療，由于抗菌藥物的不合理使用，大部分從蛋雞和肉雞場中分離得到的沙門菌對常用的抗菌藥物產(chǎn)生很強的耐藥性，且出現(xiàn)對臨床中常用的藥物出現(xiàn)多重耐藥性[6]。因此，對蛋雞和肉雞場中沙門菌的監(jiān)測具有重要的意義。本研究以萊陽地區(qū)中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份中分離的沙門菌為研究對象，對其致病性、抗菌藥物的耐藥情況檢測，為減少耐藥性傳播和指導(dǎo)臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源

2022—2023年采集萊陽地區(qū)中56個雞場中疑似沙門菌感染的雞的肛拭子、糞便、肝臟、脾臟及腎臟病料組織樣品213份。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的病料組織樣品經(jīng)過處理后，無菌的條件下接種于沙門菌顯色培養(yǎng)基中進(jìn)行沙門菌鑒別培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～18 h后，挑取優(yōu)勢的單個菌落按照說明書進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其分離菌株的形態(tài)學(xué)。

1.3 細(xì)菌生化鑒定

無菌的條件下，將沙門菌顯色培養(yǎng)基上典型菌落接種于普通營養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8～12 h，按照梅里埃革蘭陰性菌鑒定試紙條說明書，將純化培養(yǎng)的菌株在無菌的條件下接種到梅里埃革蘭陰性菌鑒定試紙條中，37 ℃培養(yǎng)12～18 h后，進(jìn)行比對確定其生化特性。

1.4 細(xì)菌的PCR鑒定

參考文獻(xiàn)[7]報道的，采用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成細(xì)菌通用引物16SrRNA基因序列，F(xiàn)1：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；F2：5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTTG-3'；目的條帶為1 500 b。采用細(xì)菌通用引物以提取的分離菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定。將分離菌株檢測為陽性的PCR產(chǎn)物回收送華大基因公司測序與比對。

1.5 致病性試驗

將分離的沙門菌在無菌的條件下普通營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌的營養(yǎng)肉湯調(diào)整分離菌株的菌液濃度為108 cfu/mL，攻毒組每1株分離菌株通過腹腔注射攻毒5只1日齡雛雞，每1只雛雞的攻毒劑量為0.2 mL，對照組的雛雞給予等量的無菌PBS。在致病性試驗期間（7 d）觀察雛雞的發(fā)病死亡情況。

1.6 藥敏試驗

無菌的條件下將沙門菌顯色培養(yǎng)基長出的典型菌落接種于普通營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整分離菌株菌液濃度為108 cfu/mL，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2013年推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗法進(jìn)行操作和試驗結(jié)果判斷[8]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

疑似沙門菌分離菌株在沙門菌顯色培養(yǎng)基上長出淺綠色的大小一致的菌落，對純化的菌株經(jīng)革蘭氏染色顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)可見單個或者聚在一起的兩頭鈍圓的革蘭氏陰性的桿菌（圖1）。與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中報道的沙門菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)基本上一致。

2.2 細(xì)菌生化試驗鑒定

通過梅里埃革蘭陰性菌鑒定試紙條對分離菌株進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果顯示，119株臨床分離菌株的生化特性與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中報道的沙門菌的生化特性基本上一致。分離的119株臨床分離株初步鑒定為沙門菌。

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

對臨床中分離的菌株用細(xì)菌通用引物16S rRNA進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定結(jié)果顯示，119株沙門菌分離菌株均擴(kuò)增出大約為1 500 bp的目條帶（部分菌株見圖2）。通過測序臨床中分離的119株菌株的基因序列與GenBank中登錄沙門菌的同源性高達(dá)98%以上，其臨床分離菌株鑒定為沙門菌。

2.4 致病性試驗

攻毒組的雛雞在攻毒后2～6 d出現(xiàn)不同的發(fā)病與死亡情況，個別的雛雞未表現(xiàn)任何臨床癥狀出現(xiàn)死亡。從死亡的雛雞體內(nèi)分離得到沙門菌，在整個攻毒試驗期間對照組的雛雞健康的存活。不同的分離菌株對雛雞的致死率在40%～100%之間，經(jīng)過統(tǒng)計82株為致病性沙門菌。

2.5 耐藥性分析結(jié)果

結(jié)果由表1可知，臨床中分離的82株致病性沙門菌對磺胺間甲氧嘧啶、多西環(huán)素、新霉素等8種藥物耐藥性較強，耐藥率在58.5%～100.0%之間；對頭孢噻呋、頭孢噻肟、氟苯尼考等8種藥物的耐藥率在3.7%～30.5%之間。

3 討論

雞沙門菌病是由不同血清型致病性沙門菌引起的一種雞的細(xì)菌性傳染病，該菌主要分為雞白痢、禽傷寒及副傷寒等，該菌可以感染不同階段的雞，其中以雛雞最易感，臨床中以敗血癥、腸炎、腹瀉為多見，該菌對雛雞的感染率和死亡率均較高，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。近幾年，國內(nèi)關(guān)于雞場中沙門菌的流行報道的越來越多。本試驗研究表明，從采集的56個雞場中213份樣品中分離得到82株致病性沙門菌，說明該地雞場中沙門菌在廣泛流行，應(yīng)該注意雞場中沙門菌的凈化與綜合防控。國內(nèi)相關(guān)研究表明，雞場中流行的沙門菌的耐藥性也逐年增加，存在多重耐藥現(xiàn)象，給該菌的防治帶來一定困難[10]。本試驗研究表明，臨床中分離的82株致病性沙門菌對常用的抗菌藥物產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性。許多相關(guān)研究表明雞場中流行的沙門菌的耐藥性很普遍，在臨床中應(yīng)該引起重視，合理使用抗菌藥物，減少耐藥性的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)：

[1] 杜海霞，朱平軍，婁福麗，等.河南焦作地區(qū)肉種雞場沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2022，58（8）：55-58.

[2] 王廣澤，沈欣悅，李建梅，等.江蘇某種雞場雞白痢沙門菌藥物敏感性及其與耐藥基因相關(guān)性分析[J].揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2021，42（2）：73-78.

[3] 崔鶴馨，王楠，呼延含蓉，等.吉林省規(guī)模化種雞場沙門菌血清型鑒定與毒力基因及耐藥性檢測[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（11）：58-61.

[4] 宋艷.山東省部分種雞場死胚中沙門氏菌的鑒定及耐藥特性研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[5] 羊揚，張欣，楊斌，等.廣西欽州地區(qū)黃羽肉雞場種雞死胚沙門菌分離鑒定與耐藥性分析[J].中國家禽，2019，41（17）：68-71.

[6] 晏玲，向勇，劉鵬，等.黃羽肉種雞場死胚中雞白痢沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國家禽，2019，41（8）：49-52.

[7] 羅薇，黃翠穎，王洋，等.某規(guī)模化種雞場沙門菌流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性分析[J].中國家禽，2019，41（2）：49-52.

[8] 徐耀輝，齊亞如，周俊豪，等.河南省種雞場雞白痢沙門菌的耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2018，54（7）：69-73.

[9] 徐耀輝，齊亞如，韓文龍，等.種雞場孵化死胚中沙門菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2018，38（7）：1321-1326.

[10] 徐耀輝，鄧同煒，齊亞如，等.三黃種雞場孵化死胚中沙門菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2018，49（5）：1081-1088.