基于鐵死亡相關長鏈非編碼RNA 的卵巢癌預后模型的構建及分析

鄭 朗，洪 瀾，王圣坦，成 潔，莊珩之，葉克潤

（海南省人民醫院，海南醫學院附屬海南醫院婦科，海南 海口 570311）

卵巢癌（OV）是女性常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有25 萬人被診斷為OV，其中約有15 萬人因此疾病死亡[1]。年齡、遺傳因素、家族史、肥胖、乳腺癌、吸煙、酗酒等與OV 的發生風險相關[2-3]。OV 細胞具有高度侵襲性和耐藥性，導致治療效果不佳[4]。鐵死亡是由細胞內鐵離子過載和氧化應激引起的細胞死亡方式[5]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，可以通過多種機制調控基因的表達[6-7]，影響細胞增殖、轉移、凋亡等生物學行為[8-9]。lncRNA在腫瘤中扮演著多種重要角色，與腫瘤的發生、發展和治療密切相關。目前關于OV 中鐵死亡的作用和機制尚不清楚。因此，本文旨在構建并分析鐵死亡相關的OV預后模型，從而探討鐵死亡在OV 發病和預后中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 研究數據

從TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov）公共數據平臺中篩選2015 年6 月至2017 年6 月收錄并具有完整隨訪信息的OV 患者正常樣本及腫瘤樣本的RNA 測序等數據及臨床相關數據。從FerrDb v2 網站（http://www.zhounan.org/FerrDb/）獲取鐵死亡相關基因。

1.1.1 與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 篩選 以共表達分析方法篩選鐵死亡相關差異表達的lncRNA，其篩選條件為|log FC|≥1.0，P＜0.05。合并鐵死亡相關差異表達lncRNA 和TCGA 數據庫中生存時間、生存狀態等臨床相關信息行Cox 單因素回歸分析，以P＜0.05 回歸因素信息進行篩選。

1.1.2 差異lncRNA 功能富集及蛋白質-蛋白質互作網絡分析 采用DAVID 數據庫對與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 基因進行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。GO 分析主要包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）三部分。采用GO seq 和KOBAS 對篩選出的差異表達RNA 進行GO 富集和KEGG 通路分析，篩選條件均為P＜0.05。采用相互作用基因庫檢索工具（STRING）（https://string-db.org/）數據庫預測蛋白質之間的相互作用，設置篩選閾值為：結合分值＞0.4。用顏色的深淺表示 Degree 算法預測的評分高低。

1.1.3 OV 預后風險模型構建及驗證 依據Cox 回歸分析方法篩選與鐵死亡和OV 預后相關lncRNA，并構建基于OV 預后風險模型，基于模型計算出各個樣本風險評分，依據截斷值將樣本患者分為高風險組和低風險組。比較高風險組和低風險組的生存情況并繪制Kaplan-Meier 生存曲線，采用單多因素Cox 回歸分析方法和受試者工作特征曲線（ROC）對模型性能進行分析。

1.2 統計學方法

差異lncRNA 比較采用t檢驗進行，用Kaplan-Meier方法繪制OV 患者生存曲線，并使用對數秩檢驗對結果進行分析。

2 結果

2.1 與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA

與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 篩選結果如圖1所示，依據FDR 和logFC ＞1 篩選得到與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 差異表達基因共48 個。見圖1。

圖1 與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA

與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 基因GO 分析結果如圖2 所示，這些基因在生物學過程（BP）中的主要作用與蛋白質ADP 核糖基化、基因表達的負調控、內質網未折疊蛋白質應激反應、鐵離子轉運、蛋白質穩定性調控等過程相關（見圖2A）。在細胞組分（CC）方面主要與核膜、細胞核、細胞質溶液、大分子復合物線粒體、核質、細胞外囊泡等組分相關（見圖2B）；在分子功能方面主要與蛋白ADP 核苷酸糖基化、核苷酸轉移、轉錄共抑制因子、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶激活因子、受體DNA 結合、鈉離子通道抑制等過程相關（見圖2C）。

圖2 差異lncRNA 的GO 功能富集圖

與OV預后和鐵死亡相關lncRNA 基因主要參與的生物通路分析結果如圖3 所示，主要包括：鐵死亡、堿基切除修復、煙酸和煙酰胺代謝、AMPK 信號通路、細胞凋亡、HIF-1 信號通路、代謝途徑等。

圖3 與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 基因的KEEG 富集圖

2.2 PPI 互作網絡分析

差異lncRNA 基因編碼蛋白PPI 網絡如圖4 所示，差異lncRNA 基因編碼蛋白PPI 網絡圖節點數為60，邊數為138，平均節點度為4.6，平均局部聚類系數為0.51，預期的邊數為46。

圖4 PPI 互作網絡圖

2.3 Cox 回歸結果分析

將與OV 預后和鐵死亡相關lncRNA 與臨床指標中的生存時間及生存狀態進行合并，將其作為影響因素進行單因素Cox 回歸分析，以P＜0.05 篩選符合條件的lncRNA，結果發現共有35 個lncRNA 與OV 患者生存預后顯著相關。進一步經過多因素Cox 回歸分析，最終獲得了10 個lncRNA（見表1）。

表1 OV 預后影響lncRNA 多因素Cox 回歸

2.4 OV 預后模型構建結果分析

依據多因素Cox 回歸分析后獲得的10 個lncRNA構建OV 預后模型。采用OV 預后風險評分（Risk score）對模型進行表示，則本研究構建的預后模型可表示為下式：

2.5 預后模型生存狀況分析

根據OV 預后模型計算各樣本的風險值，并將計算得到的中位數作為截斷值，將納入OV 樣本分為高風險組和低風險組，每組35 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析結果顯示，高風險組的平均生存時間為（2.38±1.06）年，低風險組的平均生存時間為（4.78±1.62）年，高風險組的平均生存時間顯著低于低風險組（P＜0.001）（見圖5）。

圖5 OV 不同風險生存狀態分析

2.6 OV 預后模型ROC 曲線分析

ROC 分析結果顯示，模型預測OV 患者3 年生存率ROC 曲線下面積為0.781（見圖6）。

圖6 OV 預后模型預測ROC 曲線

3 討論

OV的高死亡率主要歸因于其隱匿性和缺乏特異性的早期癥狀，導致大多數患者在就診時病情已處于晚期[10]。OV 的早期癥狀不明顯，往往被忽視或誤診，導致大部分患者在確診時已經進入晚期。此時，OV 已經擴散到其他器官，難以進行手術切除，從而嚴重影響患者的生存率和生活質量。在正常條件下，細胞會通過抗氧化系統來維持鐵離子平衡，以防止氧化應激對細胞的損傷[11-12]。然而，在某些情況下，細胞無法有效清除過多的鐵離子，導致細胞內產生大量的有害自由基，進而引發細胞膜的氧化破壞、線粒體功能障礙等細胞結構和功能的紊亂，最終導致細胞死亡[13]。腫瘤細胞內鐵離子過載時，鐵死亡機制可以被激活，從而導致腫瘤細胞的死亡。lncRNA 可以與染色質相互作用，參與染色質三維結構的調整和染色質修飾的介導。這些作用可以影響染色質的開放狀態，進而影響基因的表達[14]。在腫瘤中，異常的染色質結構和修飾往往伴隨著癌基因的激活和抑癌基因的失活，從而促進腫瘤的發展。一些lncRNA 被發現參與細胞凋亡信號通路的調控，影響腫瘤細胞的生存和死亡決策。此外，lncRNA 也可以通過調節腫瘤微環境中的免疫細胞和免疫因子的表達，影響腫瘤對免疫系統的識別和攻擊[15]。本文中的結果發現，高風險組生存時間顯著低于低風險組（P＜0.001），ROC 曲線下面積大于0.7，提示該模型特異性和敏感性較好。

4 結論

文中基于TCGA 數據庫構建了OV 預后模型，最終篩選了10 個相關的lncRNA，并基于這些lncRNA 構建了敏感度和特異度較高的預測模型。在今后的工作中，我們將進一步對研究中涉及的lncRNA 進行分子實驗驗證，以明確其在OV 發生中的具體作用機制。總之本研究結果為OV 治療及預后干預方案制定提供了一定的參考依據。