基于RNA測序探究發(fā)熱對巨噬細(xì)胞吞噬沙門菌極化狀態(tài)的影響

戴婷婷，馬雪寒，詹曄斐，許兆軍

傷寒是由傷寒沙門菌引起的全身性感染性疾病，包括持續(xù)性高熱（40 ～41 ℃）、特殊中毒面容及皮膚玫瑰疹等多種臨床表現(xiàn)，其中持續(xù)性高熱（稽留熱）為其重要的表現(xiàn)之一[1]。傷寒沙門菌通過污染的食物到達(dá)小腸，穿過腸黏膜進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)，并進(jìn)入血液、肝、脾和骨髓中，被巨噬細(xì)胞吞噬并大量繁殖。傷寒沙門菌感染巨噬細(xì)胞初期，細(xì)胞向M1 型分化，導(dǎo)致以M1 型為特征的多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平改變，對機(jī)體啟動急性感染期的炎癥發(fā)應(yīng)和清除病原菌具有重要作用，但過度的M1 型巨噬細(xì)胞反應(yīng)會引發(fā)炎癥瀑布，導(dǎo)致敗血癥[2]。在感染后期，巨噬細(xì)胞由M1 型轉(zhuǎn)變?yōu)橐悦庖咝迯?fù)和調(diào)節(jié)為主的M2型。引起慢性感染的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌也可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞提前向M2 型分化，從而逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)[3-4]。傷寒患者發(fā)熱時體內(nèi)感染沙門菌的巨噬細(xì)胞其極化狀態(tài)如何改變，一直以來并不清楚。因此本研究通過高通量RNA測序技術(shù)探究發(fā)熱溫度對吞噬傷寒沙門菌的巨噬細(xì)胞極化的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 小鼠單核-巨噬細(xì)胞株（J774A.1）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，鼠傷寒沙門菌[CMCC（B）50071]由寧波市疾病預(yù)防控制中心病原微生物實驗室贈送。

1.2 巨噬細(xì)胞處理 在37、38、39 和40 ℃4 種溫度條件下制備巨噬細(xì)胞感染和未感染傷寒沙門菌的模型，共得到8 組分別為M37、M37CK、M38、M38CK、M39、M39CK、M40 和M40CK，其中CK 為對照組。傷寒沙門菌培養(yǎng)和熒光標(biāo)記：采用營養(yǎng)肉湯震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，用PBS（pH 值7.2）制備1×108/ml 菌懸液。將一定細(xì)菌濃度的菌懸液與CFDA-SE染料溶液混合一定時間后，洗掉未結(jié)合的CFDA-SE，在熒光顯微鏡下觀察可明顯看見細(xì)菌發(fā)出綠色熒光。單核-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)并感染傷寒沙門菌：以100∶1 的感染復(fù)數(shù)將熒光標(biāo)記的對數(shù)期傷寒沙門菌加入單核-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，110 g 離心5 min 以促進(jìn)細(xì)胞和細(xì)菌接觸，分別選擇37 ～40℃4 個溫度共孵育30min，再用預(yù)溫（與培養(yǎng)溫度一致，下同）的PBS 洗滌2 次，隨后換成含100g/ml慶大霉素細(xì)胞培養(yǎng)液孵育1h以去除細(xì)胞外細(xì)菌，最后換成含10g/ml 慶大霉素細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)2h。巨噬細(xì)胞吞噬沙門菌率的檢測采用Dx-FLEX流式細(xì)胞儀（美國BeckmanCoulter）進(jìn)行，并使用CytExpert 流式細(xì)胞處理軟件操作分析。

1.3 RNA 文庫構(gòu)建 采用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）依照說明書提取總RNA，使用Nano-Drop 2000 核酸蛋白質(zhì)分析儀（美國Thermo Scientific 公司）測定總RNA 的質(zhì)量和濃度，使用Agilent 2100 生物分析儀（美國安捷倫公司）評估RNA 完整性，使用VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒依照說明書構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫。

1.4 RNA 測序和差異表達(dá)基因分析 采用llumina Novaseq6000 測序平臺對文庫進(jìn)行測序，并生成150bp雙端讀序。采用fastp 軟件對fastq 格式的原始讀序進(jìn)行處理，去除低質(zhì)量讀序后獲得高質(zhì)量讀序用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用HISAT2 軟件進(jìn)行參考基因組比對，并進(jìn)行基因表達(dá)量（FPKM）計算，通過HTSeq-count獲得每個基因的讀序計數(shù)。利用DESeq2 軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，其中符合q值＜0.05 且|log2FC|＞1 閾值的基因被定義為差異表達(dá)基因（DEGs）。

1.5 共同差異表達(dá)基因分析 利用韋恩圖找出不同溫度條件下共同表達(dá)的差異基因，分為上調(diào)和下調(diào)。

1.6 巨噬細(xì)胞M1、M2 極化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄分析和趨勢分析 利用歐易云平臺轉(zhuǎn)錄熱圖和趨勢分析工具，對巨噬細(xì)胞MI、M2 極化相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平熱圖分析和趨勢分析。

2 結(jié)果

2.1 共同差異表達(dá)基因分析 通過不同溫度處理獲得各溫度條件下的共同差異表達(dá)基因2487條，利用韋恩圖找出1256條共同上調(diào)基因，1231條共同下調(diào)基因，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因的共表達(dá)分析

2.2 M1 和M2 極化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析 將共同上調(diào)基因按溫度上升作出其轉(zhuǎn)錄水平變化的熱圖，存在三簇基因?qū)囟鹊奶幚沓尸F(xiàn)規(guī)律變化，基因簇Ⅰ隨溫度升高表達(dá)水平逐漸下調(diào)，而與之相反，基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ隨溫度升高表達(dá)逐漸升高，見圖2。

圖2 不同溫度條件共同上調(diào)和下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄熱圖

將這些基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，基因簇Ⅰ基因參與凋亡、模式識別受體信號通路、NF- B信號正向調(diào)控、免疫反應(yīng)等過程，KEGG分析中主要參與腫瘤壞死因子（TNF）通路、Toll樣受體信號通路等過程。基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ則參與炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程、抗病毒防御反應(yīng)、干擾素IFN- 細(xì)胞反應(yīng)和對LPS的細(xì)胞反應(yīng)等與促炎反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過程。而KEGG 富集顯示這些基因參與調(diào)控細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、NF- B 信號通路和JAK-STAT 通路等與M1 極化相關(guān)的信號通路過程，見圖3。

圖3 共同上調(diào)基因基因簇基因GO 和KEGG 分析

與共同上調(diào)基因不同，共同下調(diào)基因中基因簇Ⅰ基因參與IL-6 的負(fù)調(diào)控過程、B 細(xì)胞的增殖等過程，但主要參與固醇和膽固醇等生物合成及脂質(zhì)代謝過程。KEGG 富集分析主要有HIF-1 缺氧信號通路、脂肪酸代謝與合成信號通路，此外還包括B細(xì)胞受體信號通路、Fcy R 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬過程。而基因簇Ⅱ基因簇則主要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、染色體分離和組裝以及DNA 損傷的細(xì)胞反應(yīng)等過程，見圖4。

圖4 共同下調(diào)基因簇基因GO 和KEGG 分析

通過將促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 極化的信號通路組分以及下游標(biāo)志性分子與以上基因簇比對，發(fā)現(xiàn)與M1 極化有關(guān)的大多數(shù)基因都在共同上調(diào)基因的基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ中富集，只有少數(shù)的基因在基因簇Ⅰ富集，將這些基因作轉(zhuǎn)錄水平隨溫度升高的熱圖，見圖5A，除少數(shù)基因包括TNF- 、IRF1 和CD80/CD86外隨溫度升高呈先升高后逐漸下降或持續(xù)下降趨勢，絕大多數(shù)基因隨溫度升高均逐漸上調(diào)，包括JAKSTAT1/2 信號通路組分、干擾素調(diào)節(jié)因子IRF9、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶Nos2、細(xì)胞因子IL-12b和趨化因子CCL-5、CXCL-9 和CXCL-16。

圖5 與激活巨噬細(xì)胞M1 和M2 極化相關(guān)的基因變化熱圖

IL-4/IL-13-JAK1/JAK3-STAT6 信號通路、IL-10-STAT3-TGF /IL-1Ra/Arg1 和JMJD3-IRF4 通路可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化，并抑制M1 極化。通過比對分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)M2 極化相關(guān)基因存在于共同上調(diào)基因中，而且大多數(shù)存在于基因簇Ⅱ和基因簇Ⅲ中，繪制轉(zhuǎn)錄水平熱圖，見圖5B。

2.3 M1 和M2 極化相關(guān)基因的趨勢分析 M1 極化相關(guān)基因表達(dá)水平隨溫度升高（低于39℃）而逐漸升高，39 ～40℃，其總體表達(dá)水平不再改變，且部分基因發(fā)生下調(diào)。與M2 極化相關(guān)的基因表達(dá)水平隨溫度升高而逐漸升高（39℃），40℃時不再增加，見圖6。

圖6 與M1 和M2 極化相關(guān)基因的顯著模塊趨勢圖

3 討論

傷寒是沙門菌感染引起的一種全身性疾病，巨噬細(xì)胞一方面在清除病原體和特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可或缺的作用，但也容易成為沙門菌免疫逃逸和繁殖的場所。傷寒患者伴隨嚴(yán)重的發(fā)熱癥狀，目前尚不清楚發(fā)熱對于巨噬細(xì)胞極化的影響，探究溫度影響巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的調(diào)控機(jī)理，對于認(rèn)識和處置傷寒熱具有重要意義。本研究通過體外感染沙門菌的小鼠單核巨噬細(xì)胞，利用不同溫度處理模擬體內(nèi)發(fā)熱狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)沙門菌的感染均會誘導(dǎo)各溫度條件下的巨噬細(xì)胞向M1 狀態(tài)極化，且隨著溫度升高（低于39℃），大多數(shù)與M1 極化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，而溫度繼續(xù)升高（40 ℃），這些基因不再發(fā)生上調(diào)，且少數(shù)發(fā)生下調(diào)。此外，溫度升高的同時，也會逐漸誘導(dǎo)與M2 極化相關(guān)基因的表達(dá)。因此，適當(dāng)?shù)陌l(fā)熱（低于39 ℃）有利于巨噬細(xì)胞發(fā)揮病原體清除的能力，而溫度過高則可能造成巨噬細(xì)胞過早向M2極化，抑制巨噬細(xì)胞的促炎功能。

以往研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化為M1 狀態(tài)時，會分泌TNF，作為標(biāo)志性分子發(fā)揮殺傷細(xì)菌功能[5]；同時上調(diào)細(xì)胞表面共刺激分子CD80 和CD86 的表達(dá)，促進(jìn)與T 細(xì)胞的接觸并使之活化[6]。在沙門菌感染巨噬細(xì)胞早期，TNF- 信號通路也會被激活，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 極化，發(fā)揮促炎功能[7]。本研究表明，較低發(fā)熱溫度（37 ～38 ℃）下沙門菌感染早期，TNF 表達(dá)量較未感染組升高，這與之前的研究一致。但隨溫度繼續(xù)升高，其表達(dá)量開始下降，提示巨噬細(xì)胞M1極化被抑制。許多微生物都有利用巨噬細(xì)胞極化過程實現(xiàn)免疫逃逸的能力[8]，其中沙門菌能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 極化，王耀楠等[9]發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌能夠通過促進(jìn)PKM2-JAK2-STAT3-IL10 通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 型極化，同時鼠沙門菌能夠拮抗TNF- 通路而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 極化。本研究中過高的發(fā)熱溫度（39 ～40 ℃）使TNF 轉(zhuǎn)錄水平下降，表明沙門菌可能通過拮抗TNF-通路而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化，從而逃逸免疫殺傷，這與以往的研究一致。此外，巨噬細(xì)胞作為一種抗原遞呈細(xì)胞，其表面的CD80/CD86 共刺激分子是M1 極化的標(biāo)志性分子。本研究結(jié)果顯示隨發(fā)熱溫度上升，也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，與TNF 的變化相似。以上結(jié)果表明，不同的發(fā)熱溫度能夠激活或抑制巨噬細(xì)胞極化信號通路，從而導(dǎo)致不同的巨噬細(xì)胞分化命運(yùn)，而這一過程是否是沙門菌所獨有的，則需要更多的證據(jù)支撐。

在傷寒感染過程中，臨床上對如何處置發(fā)熱癥狀存在一定的爭議。對一些侵襲性細(xì)菌感染，發(fā)熱一般有利于清除病原菌，抑制細(xì)菌生長[10]，也可以誘導(dǎo)淋巴器官中淋巴細(xì)胞動員，特別是IL-6 活化，增強(qiáng)免疫防御[11]，同時也能增強(qiáng)Ⅰ型干擾素反應(yīng)，促進(jìn)殺菌功能[12]。但在目前醫(yī)療實踐中，即使在程度較低的發(fā)熱狀態(tài)下，也常常進(jìn)行退熱干預(yù)治療。但在小鼠膿毒癥模型中，發(fā)熱未干預(yù)組比發(fā)熱干預(yù)組可以獲得更好的呼吸功能、較低的血乳酸濃度和更長的生存期[13]。臨床上存在著“最有利于疾病恢復(fù)的發(fā)熱溫度”等疑問[14]。因此，正確對待和處置發(fā)熱有重要的臨床意義。本研究初步發(fā)現(xiàn)，對于鼠沙門菌感染巨噬細(xì)胞模型，較低的發(fā)熱溫度有利于巨噬細(xì)胞M1 極化，發(fā)揮殺菌能力，而溫度過高則可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化，使沙門菌發(fā)生免疫逃逸。這些進(jìn)一步為臨床上如何處理發(fā)熱癥狀提供有益的參考。

致謝 感謝寧波市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗部對本研究的支持

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 戴婷婷：數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；馬雪寒：數(shù)據(jù)分析、論文修改；詹曄斐：實驗操作、論文修改；許兆軍：實驗設(shè)計、研究指導(dǎo)、經(jīng)費支持