替格瑞洛通過akt/AMPK/eNOS信號通路調節(jié)AMI后小鼠血管新生及其機制研究

何尤夫 劉微△ 劉德斌 李玲 向仕菊 姚奇

(1.貴州省人民醫(yī)院心血管內科,貴州 貴陽 550000;2.貴州省心血管疾病臨床醫(yī)學研究中心,貴州 貴陽 550000;3.廣東省汕頭市第二人民醫(yī)院,廣東 汕頭 515000;4.遵義市正安縣人民醫(yī)院,貴州 遵義 563100)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于各種原因導致冠脈急性缺血,進而引起的心肌細胞缺血壞死,具有很高的發(fā)病率和死亡率,并對健康構成嚴重威脅[1]。即使AMI患者及時接受介入治療,心肌細胞的死亡仍不可避免,嚴重影響患者的預后[2]。替格瑞洛作為一種新型P2Y12-ADP受體拮抗劑,無須經肝臟代謝激活即可直接起效,可逆地與血小板P2Y12-ADP受體結合發(fā)揮抑制血小板的作用[3]。另有研究[4]顯示替格瑞洛通過腺苷依賴的機制發(fā)揮增加冠脈血流量、減少心肌梗死面積等作用,但是替格瑞洛是否具有促進AMI后血管生成的作用尚不清楚。腺苷是一種重要的生物活性物質,具有介導血管生成的作用。已有試驗證實替格瑞洛能過腺苷依賴的機制促進蛋白激酶B(akt)、AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)及內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)磷酸化。但是,替格瑞洛是否通過腺苷依賴的akt/AMPK/eNOS信號通路發(fā)揮促進心肌梗死后血管生成的作用尚無研究報道。本研究就替格瑞洛通過腺苷依賴的 akt/AMPK/eNOS信號通路調節(jié)AMI后血管新生這一問題展開深入的探討,旨在為替格瑞洛促進AMI后血管新生尋找新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物c57BL/6純系清潔級小鼠全部購自遼寧省長生生物技術有限公司。實驗動物使用許可證號:SYXK(黔)2021-0005。實驗動物的處理符合相關動物實驗要求。

1.2 藥品試劑及儀器血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體(武漢三鷹,19003-1-AP)、β-actin抗體(武漢三鷹,81115-1-RR)、akt抗體(武漢三鷹,10176-2-AP)、P-akt抗體(武漢三鷹,28731-1-AP)、MAPK抗體(武漢三鷹,10176-2-AP),p-MAPK抗體(武漢三鷹,28796-1-AP)、eNOS抗體(武漢三鷹,27120-1-AP)、p-ENOS抗體(武漢三鷹,28939-1-AP)、CD31抗體(武漢三鷹,28083-1-AP),逆轉錄試劑盒(日本takara),SYBR 綠色熒光 PCR 預混液(日本takara),Perifosine(美國MCE,157716-52-4),Dorsomorphin(美國MCE,866405-64-3),MRS1523(美國MCE,HY-121119),腺苷檢測試劑盒(上海初態(tài)生物,CT68427),免疫組化試劑盒(中杉金橋,PV-9000),血栓彈力圖分析儀(上海繼圣,CFMS LEPU-8880),血小板功能分析儀(上海索慮,Sonoclot SCP2),小動物呼吸機(中國玉研儀器,V-1000),小動物心電圖儀(中國玉研儀器,3306B)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立急性心肌梗死小鼠模型將小鼠使用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后固定于手術臺,同時連接小動物心電圖儀,在小動物呼吸機輔助通氣下開胸,并結扎左前降支冠脈,結扎后可見心臟由暗紫色變?yōu)樯n白色,在確認心電圖出現明確心肌缺血改變后即為模型建立成功。

1.3.2 實驗分組及小鼠飼養(yǎng)實驗分為五組,假手術組(Sham組)、心肌梗死即刻組(AMI 0 h組)、心肌梗死48 h組(AMI 48 h組)、心肌梗死1周組(AMI 1 W組)、心肌梗死4周組(AMI 4 W組)、心肌梗死并服用氯吡格雷組(CLOP組)、心肌梗死并服用替格瑞洛組(TIC組)、心肌梗死并服用替格瑞洛且使用Dorsomorphin組(Dorsomorphin組)、心肌梗死并服用替格瑞洛且使用Perifosine組(Perifosine組)、心肌梗死并服用替格瑞洛且使用MRS1523組(MRS1523組)。隨后根據不同分組,分別使用替格瑞洛(灌胃,300 mg/d,劑量根據氯吡格雷說明書及專家共識[5])、氯吡格雷(灌胃,90 mg/d,劑量根據氯吡格雷說明書及專家共識[5])Dorsomorphin(腹腔注射,1 mg/kg·d[6])、Perifosine (腹腔注射,20 mg/kg·d[7])、MRS1523(腹腔注射,0.1 μM/d[8])。所有小鼠在特定時間點取眼球血,并開胸取心臟備用。

1.3.3 酶標法測定小鼠血清腺苷含量取小鼠眼球血,離心后得血清,并根據試劑盒說明書,使用酶標法檢測腺苷含量。

1.3.4 免疫組織化學取小鼠心臟,4%多聚甲醛固定72 h,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋、切片,隨后操作步驟按中杉金橋( PV-9000) 試劑盒說明進行。

1.3.5 HE染色小鼠心臟標本石蠟包埋后切片,常規(guī)脫蠟至水。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水,蘇木素染色 10 min,0.7%鹽酸乙醇分化3～5 s,流水洗滌后,伊紅液浸染 3 min。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察分析。

1.3.6 Masson染色小鼠心臟標本石蠟包埋后切片,常規(guī)脫蠟至水,重鉻酸鉀染色,鐵蘇木素染色,麗春紅酸性品紅染色,磷鉬酸染色,苯胺藍染色,1%冰醋酸分化,常規(guī)脫水、透明、封片,光學顯微鏡下觀察分析。

1.3.7 Western blot檢測組織細胞中相關蛋白表達通過使用混合有1%蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的RIPA(碧云天,中國)從心臟組織細胞中分離蛋白質,并通過BCA蛋白質測定試劑盒(碧云天,中國)檢測蛋白質濃度。將裂解液與5份SDS樣品緩沖液混合并煮沸10 min。將裂解液樣品在6%和12%SDS-PAGE上分離,并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%牛奶封閉溶液封閉印跡1 h,然后用合適的一抗孵育過夜。用TBST多次洗滌后,將膜與HRP標記的二抗進一步孵育1 h。用ECL Western blot檢測試劑(碧云天,中國)對印跡進行可視化顯影,并用GEL成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)進行成像。通過軟件Image J分析蛋白質的定量。

1.3.8 RT-PCR檢測組織/細胞中相關基因表達各組心肌組織或細胞均使用Trizol法提取總RNA,根據說明書,使用逆轉錄試劑盒將對應RNA進行逆轉錄;用不同基因的特異性引物對cDNA進行qRT-PCR,使用SYBR試劑盒在Eppendorf MasterCycler RealPlex4(Eppendor,Wesseling Berzdorf,德國)上進行PCR反應,ΔΔCt法計算相對表達水平;使用β-actin對靶基因的表達進行標準化。VEGF:正義鏈為5’-GCA GAC TAT TCA GCG GAC TCA-3’,反義鏈為5’-CCG TTG GCA CGA TTT AAG AGG-3’;β-actin引物序列見生工試劑盒說明書。

2 結 果

2.1 AMI模型中VEGF存在差異性表達圖1A所示為各組心電圖情況,心肌梗死后各組的ST段明顯上抬,提示造模成功;圖1B所示,AMI 1 W和AMI 4 W組可見明顯的局部心肌損害、肌纖維碎裂;而在Masson染色的檢測中,圖1C～D所示,AMI 4 W組可見明顯的膠原沉積,提示纖維化形成;與之對應的,在AMI 4 W組中,VEGF的蛋白水平(圖1E～F)和mRNA水平(圖1G)表達也明顯下降。故而我們選擇4周作為評估時間點進行后續(xù)研究。

注:A.各組AMI模型心電圖;B.各組AMI大鼠心臟HE染色;C.各組AMI大鼠心臟Masson染色;D.通過Masson染色評估膠原沉積的統(tǒng)計圖;E.Western bolt評估各組大鼠心肌內VEGF的蛋白表達水平;F.圖E中VEGF蛋白水平相對值統(tǒng)計圖;G.RT-PCR評估各組大鼠心肌內VEGF的mRNA表達水平。與Sham組相比,aP<0.05;AMI 0 h組相比,bP<0.05;與AMI 48 h組相比,cP<0.05;與AMI 1 W組相比,dP<0.05。

2.2 替格瑞洛對AMI模型小鼠的心肌保護作用為了解替格瑞洛在AMI后對梗死心肌內對血管生成的影響,我們選取了目前國內外較為公認的氯吡格雷作為陽性對照組。如圖2A所示,在HE染色中,與AMI組相比,氯吡格雷組(CLOP組)和替格瑞洛組(TIC組)的局部心肌損害、肌纖維碎裂有所減輕。如圖2B～C所示,在Masson染色中,與AMI組相比,CLOP組和TIC組的膠原蛋白沉積率明顯下降(P<0.05)。在更進一步的腺苷表達檢測(圖2D)中,CLOP組和TIC組表達均相對比AMI組明顯上升(P<0.05);而在血栓彈力圖檢測(圖2E)和血小板聚集率檢測(圖2F)中,CLOP組和TIC組表達均相對比AMI組明顯下降(P<0.05)。結果提示替格瑞洛和氯吡格雷均可改善AMI后的心肌纖維化,或與其可抑制腺苷表達有關,并同時還可調節(jié)血小板活性及血栓形成。

注:A.建立各組模型后取心肌組織行HE染色;B.各組Masson染色;C.Masson染色評估膠原沉積的統(tǒng)計圖;D.各組中腺苷值統(tǒng)計圖;E.各組中血栓彈力的統(tǒng)計圖;F.各組中血小板活性率的統(tǒng)計圖。Sham表示假手術組;AMI表示AMI后4周組;CLOP表示AMI并使用氯吡格雷灌胃治療4周組;TIC表示AMI并使用替格瑞洛灌胃治療4周組。與Sham組相比,aP<0.05;與AMI組相比,bP<0.05;與CLOP組相比,cP<0.05。

2.3 替格瑞洛可促進VEGF表達在進一步的研究中,我們還評估了替格瑞洛和氯吡格雷對于AMI后局部心肌細胞中VEGF表達的影響。如圖3A-B所示,在免疫組化檢測局部心肌細胞中VEGF表達里,與AMI組相比,CLOP組和TIC組中的VEGF表達均明顯上調(P<0.05)。通過Western blot檢測各組中VEGF蛋白水平表達情況(圖3C～D),結果也與免疫組化結果基本一致。而在VEGF的mRNA水平表達檢測中,RT-PCR結果也證實,與AMI組相比,CLOP組和TIC組中的VEGF的mRNA表達也明顯上調(P<0.05)。我們的結果證實,在AMI中,替格瑞洛可明顯促進VEGF的蛋白和mRNA水平表達。

注:A.免疫組化檢測各組大鼠模型中心肌組織內VEGF表達;B.免疫組化中VEGF陽性值統(tǒng)計圖;C.Western blot檢測各組中VEGF蛋白水平表達情況;D.Western blot結果中VEGF相對表達量統(tǒng)計圖;E.RT-PCR檢測各組中VEGF mRNA表達情況統(tǒng)計圖。Sham表示假手術組;AMI表示急性心肌梗死后4周組;CLOP表示急性心肌梗死并使用氯吡格雷90 mg/d灌胃治療4周組;TIC表示急性心肌梗死并使用替格瑞洛300 mg/d灌胃治療4周組。與Sham組相比,aP<0.05;與AMI組相比,bP<0.05;與CLOP組相比,cP<0.05。

2.4 替格瑞洛通過調節(jié)VEGF表達保護心肌為了解替格瑞洛促進AMI后VEGF表達,進而調節(jié)局部心肌內血管新生的機制,我們初步評估了AMPK/AKT軸對心肌梗死后血栓彈力、血小板活性及腺苷濃度表達的調節(jié)作用。在HE染色結果中(圖4A)我們發(fā)現無論抑制AMPK活性、AKT活性,還是抑制腺苷受體表達,均會減少替格瑞洛對于心肌損害的保護作用。在Masson染色中(圖4B～C),與TIC組相比,Perifosine組(akt抑制劑)、Dorsomorphin組(AMPK抑制劑)和MRS1523組(腺苷受體抑制劑)的膠原沉積均明顯上調(P<0.05),提示無論抑制akt、AMPK還是腺苷受體,均會減少替格瑞洛對于AMI后心肌纖維化的保護作用。在腺苷的檢測中(圖4D),與TIC組相比,Perifosine組、Dorsomorphin組和MRS1523組的腺苷濃度均明顯上調(P<0.05)。在血栓彈力圖檢測(圖4E)、血小板活性檢測(圖4F)中,與TIC組相比,Perifosine組、Dorsomorphin組和MRS1523組的血栓彈力圖數值、血小板活性均明顯下降(P<0.05)。

注:A.各組大鼠模型中心肌組織的HE染色;B.各組大鼠模型中心肌組織的Masson染色;C.Masson染色評估膠原沉積的統(tǒng)計圖;D.各組中腺苷值統(tǒng)計圖;E.各組中血栓彈力的統(tǒng)計圖;F.各組中血小板活性率的統(tǒng)計圖。Sham表示假手術組;AMI表示急性心肌梗死后4周組;TIC表示急性心肌梗死并使用替格瑞洛300 mg/d灌胃治療4周組;Perifosine表示急性心肌梗死后同時使用300 mg/d替格瑞洛及akt抑制劑Perifosine20 mg/kg·d灌胃治療4周組;Dorsomorphin表示急性心肌梗死后同時使用300 mg/d替格瑞洛及AMPK抑制劑Dorsomorphin 1 mg/kd·d灌胃治療4周組;MRS1523表示急性心肌梗死后同時使用300 mg/d替格瑞洛及腺苷受體抑制劑MRS1523 0.1μM /kg·d灌胃治療4周組。與Sham組相比,aP<0.05;與AMI組相比,bP<0.05;與TIC組相比,cP<0.05;與Perifosine組相比,cP<0.05;與Dorsomorphine組相比,dP<0.05。

2.5 替格瑞洛可通過akt/AMPK/eNOS信號通路調節(jié)VEGF表達我們檢測了akt/AMPK /eNOS軸對心肌梗死后局部心肌VEGF表達的調節(jié)作用。通過免疫組化(圖5A～B)和Western blot(圖5C～D)檢測了各組中VEGF蛋白水平表達情況。與TIC組相比,Perifosine組、Dorsomorphin組和MRS1523組的VEGF蛋白水平表達均明顯上調(P<0.05)。與AMI組相比,替格瑞洛可明顯上調p-AKT/AKT(圖5E)和p-eNOS/eNOS(圖5G)比值(P<0.05),下降p-AMPK/AMPK(圖5F)比值(P<0.05),提示替格瑞洛可明顯改善由AMI導致的局部心肌細胞內AMPK/AKT/eNOS軸的活化。另外在VEGF的mRNA水平表達中,我們也得出了和蛋白水平一致的結果。結果表明,替格瑞洛可通過調節(jié)AMPK/AKT/eNOS軸,進而調節(jié)心肌梗死后局部心肌細胞內VEGF的表達。

3 討 論

既往的研究[1]顯示,AMI患者良好的側支循環(huán)提供的殘余血流能夠有效減少梗死面積、改善左心收縮功能,側支循環(huán)的缺失與心肌梗死后早期心源性休克密切相關。而AMI早期側支循環(huán)的建立,能夠進一步降低心肌梗死面積和心肌缺血面積,從而改善心肌梗死患者的預后[2]。PLATO試驗[3]證實,與氯吡格雷(另一種P2Y12-ADP受體拮抗劑)相比,替格瑞洛在不增加主要出血的情況下,進一步降低急性冠脈綜合征患者的心血管死亡/心肌梗死/卒中復合終點事件風險達16%,同時顯著降低心血管死亡達21%。而另一項體外試驗[4]進一步顯示替格瑞洛能夠抑制人紅細胞對腺苷的吸收,其可能的機制是抑制了平衡型核苷轉運蛋白1的活性。腺苷是人體內的一種重要生物活性物質,發(fā)揮著重要的病理生理調節(jié)功能,具有擴張冠狀動脈[9]、抑制血小板聚集[10]、抑制炎癥反應[11]、改善冠狀動脈缺血再灌注損傷[12]等作用。在血管損傷后血管修復過程中腺苷引起內皮祖細胞的遷移與數量增加,而且這種效應呈濃度依懶性(腺苷濃度在1 nM/L至10 μM/L)[13]。內皮細胞的增殖和遷移是血管生成過程中的關鍵步驟。腺苷能夠誘導心肌血管平滑肌細胞和心肌成肌細胞的VEGF mRNA的表達,增加VEGF蛋白濃度,從而介導了血管生成[13]。此外,有研究[14]發(fā)現細胞內腺苷可以通過調節(jié)表觀遺傳編程來促進血管生成。因此,替格瑞洛具有潛在的通過增加腺苷濃度促進血管生成的能力。但目前尚無研究證實替格瑞洛能否促進心肌梗死后血管生成,其作用機制也有待進一步研究。2013年一項基于健康成人的研究[15]顯示,與氯吡格雷相比,替格瑞洛顯著增加腺苷誘導的冠脈血流速度。此外,有研究[16]顯示冠心病患者服用替格瑞洛21 d后血管功能和內皮功能得到改善。近期,研究者在豬動物模型上的研究[17]結果發(fā)現,替格瑞洛通過腺苷依賴的機制降低心肌梗死后的心肌損傷及水腫形成。以上這些研究表明,替格瑞洛可能通過腺苷依賴的機制發(fā)揮了更大的心臟保護作用。本研究在基于前述研究理論的基礎上證實,替格瑞洛可促進AMI后小鼠心肌組織細胞內的VEGF蛋白水平和mRNA水平表達,而在使用腺苷受體抑制劑MRS1523后可明顯抑制替格瑞洛對于VEGF的上調作用。本研究同時還初步探討了替格瑞洛可通過促進AMI后小鼠體內腺苷濃度,進而促進心肌組織內VEGF的表達,這或許與其促進血管新生,并進一步調節(jié)AMI后的心肌組織修復有關。

血管新生是一個多信號介導、多細胞參與調控的過程。akt/AMPK/eNOS信號通路在細胞的增殖、遷移、蛋白合成及血管生成等過程中起著十分重要的作用[18]。在心肌梗死再灌注損傷小鼠動物模型實驗中,研究者發(fā)現腺苷及其受體通過akt信號通路發(fā)揮減少心肌再灌注損傷[19]。而替格瑞洛則可通過腺苷依賴的機制促進akt、AMPK及eNOS磷酸化[20]。但是替格瑞洛是否通過akt/AMPK/eNOS信號通路促進心肌梗死后血管生成從而發(fā)揮更大的心臟保護作用尚不清楚。本研究通過akt抑制劑Perifosine和AMPK抑制劑Dorsomorphin,初步探討了akt/AMPK在AMI后小鼠心肌組織細胞中對于VEGF表達的影響。本研究證實akt/AMPK/eNOS軸的磷酸化水平與AMI后小鼠體內腺苷水平密切相關,并進一步影響后AMI后小鼠心肌組織中VEGF蛋白水平和mRNA水平表達。

綜上所述,本研究證實替格瑞洛可通過調節(jié)AMI后小鼠體內腺苷表達,進而調節(jié)心肌組織細胞內VEGF的表達,與受損心肌的恢復與血管狀態(tài)密切相關,對于促進血管新生、恢復AMI梗死區(qū)域的血供和挽救病理性損害的心肌細胞具有極其重要的意義。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會審批[倫理號:倫審(動物)2022-018],動物實驗不涉及知情同意。

作者貢獻/Author Contributions

何尤夫、劉微提出主要研究目標,負責研究的構思與設計,研究的實施,撰寫論文,并對文章整體負責,監(jiān)督管理;劉德斌、向世菊進行數據的收集與整理;李玲、姚琦進行統(tǒng)計學處理,圖、表的繪制與展示;劉微進行論文的修訂、文章的質量控制與審查。