鼠性成熟前期睪丸扭轉對性成熟期健側睪丸C-kit、PI3K表達的影響研究

李剛龍 馬洪 林金鳳 趙鵬 劉紅 楊遠貴 陳進

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院小兒外科,貴州 遵義 563003;2.廣東省婦幼保健院,廣東 廣州 510010;3.貴州省人民醫(yī)院,貴州 貴陽 550002)

睪丸扭轉也稱精索扭轉,是泌尿外科常見的陰囊急診,可發(fā)生在各個年齡階段,但以小兒和青少年多見,可影響成年后男性的生殖功能[1]。睪丸扭轉后精索內的動靜脈血液循環(huán)產(chǎn)生障礙,從而出現(xiàn)睪丸缺血,細胞發(fā)生凋亡壞死等組織病理學改變[2]。國內外學者對兒童期睪丸扭轉的研究、大多集中在短期內患側睪丸方面,如扭轉睪丸的病理、病理生理以及分子生物學等改變[3]。兒童期睪丸扭轉后,對成年期健側睪丸生精功能的影響鮮有報道。目前一側睪丸扭轉,對側睪丸是否受損仍存爭議。文獻[4-5]報道睪丸精原干細胞因子受體(C-kit)、磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)在睪丸生殖細胞增殖及凋亡中發(fā)揮重要調節(jié)作用,機制可能是SCF/C-kit系統(tǒng)激活PI3K→AKT→mTOR→P70S6K→CyclinD3→Rb p42/p94完成細胞DNA合成信號傳遞,調控生殖細胞增殖分化。鑒于C-kit、PI3K在生殖細胞增殖、分化及凋亡中的調控作用,本研究制作性成熟前期睪丸扭轉的動物模型,待性成熟期后檢查健側睪丸生精上皮C-kit、PI3K的表達水平,用以初步判定健側睪丸的生精功能是否受到損害。

1 材料與方法

1.1 材料選用SPF級3周齡雄性SD鼠,體重(85±15)g,由陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(渝)2012-0005。實驗動物56只,隨機分成7組,每組8只。實驗動物放在帶有氣溫控制和光線調節(jié)的環(huán)境內飼養(yǎng),溫度(21±2)℃,濕度(50±20)%,并可以自由覓食、飲水。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制作本篇論文與《貴州醫(yī)藥》2023年1月第47卷第1期發(fā)表的論文《幼鼠睪丸扭轉對成年期健側睪丸及性激素的影響》的研究系同一批動物,動物模型制作、扭轉睪丸處于不同狀態(tài)判定標準、以及動物術后的處理、不同狀態(tài)的扭轉睪丸圖片見已發(fā)表的論文[6]。本課題組前期發(fā)表論文已成功制作鼠睪丸扭轉動物模型[6]:即對照組(CG)、扭轉未壞死睪丸復位組(NNTR)/切除組(NNTO)、扭轉疑似壞死睪丸復位組(SNTR)/切除組(SNTO)和扭轉壞死睪丸復位組(NTR)/切除組(NTO)。

1.2.2 SP免疫組化檢測C-kit及PI3K的表達術后飼養(yǎng)6周至性成熟期、脫頸法處死大鼠,切取健側睪丸做成石蠟標本,連續(xù)切片3～5 μm,應用免疫組化SP法檢測C-kit、PI3K的表達。(1)檢測方法:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫浸泡10 min,消除內源性過氧化氫酶活性;在微波爐中進行抗原修復,滴加山羊血清封閉液,滴加一抗(稀釋度為1∶300),37 ℃恒溫箱中復溫30 min;滴加二抗,DAB顯色液進行顯色,蘇木素復染,自來水沖洗后1%鹽酸酒精分化,脫水、透明、封片。(2)結果判斷:光學顯微鏡下精原細胞胞膜或胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,采用Image-pro plus 6.0圖像采集系統(tǒng)進行圖像分析,每張切片隨機選取3個互不重復交叉的視野(×400),檢測各切片生精細胞C-kit、PI3K的積分光密度(IOD),IOD值越大表示陽性表達越強,C-kit、PI3K含量越高。

2 結 果

2.1 性成熟期健側睪丸組織C-kit、PI3K的表達CG組PBS代一抗空白對照,各級生精細胞、間質細胞均無C-kit陽性表達(圖1);CG組睪丸組織C-kit蛋白在各級生精細胞、間質細胞的胞膜與胞漿呈陽性表達(圖2)。NNTR和NNTO組:各級生精細胞、間質細胞的胞膜及胞漿C-kit蛋白表達豐富(圖3～4)。SNTR和SNTO組:生精細胞、間質細胞的胞膜及胞漿呈黃褐色,C-kit陽性表達(圖5～6)。NTR和NTO組:前者生精細胞、間質細胞的胞膜及胞漿呈弱陽性表達(圖7),后者生精細胞、間質細胞的胞膜及胞漿呈深染黃褐色,C-kit蛋白表達富集(圖8)。PI3K在各組中的表達與C-kit一致,不同之處在于PI3K只在胞漿表達、包膜無表達(圖9～16)。

圖1 CG組,PBS代一抗,曲細精管精原細胞、間質細胞無C-kit表達(×400)

圖2 CG組,曲細精管精原細胞、間質細胞C-kit表達富集(×400)

圖5 SNTR組,C-kit在精原細胞、間質細胞的胞膜、胞漿陽性表達(×400)

圖6 SNTO組,C-kit在精原細胞、間質細胞的胞膜、胞漿陽性表達(×400)

圖7 NTR組,C-kit在精原細胞、間質細胞的胞膜、胞漿弱陽性表達(×400)

圖8 NTO組,C-kit在精原細胞、間質細胞的胞膜、胞漿強陽性表達(×400)

圖9 CG組,PBS代一抗,曲細精管精原細胞、間質細胞無PI3K表達(×400)

圖10 CG組,曲細精管精原細胞、間質細胞的胞漿PI3K表達富裕(×400)

圖11 NNTR組,PI3K在精原細胞、間質細胞的胞漿表達豐富(X400)

圖12 NNTO組,PI3K在精原細胞、間質細胞的胞漿表達豐富(X400)

圖13 SNTR組,PI3K在精原細胞、間質細胞的胞漿陽性表達(×400)

圖14 SNTO組,PI3K在精原細胞、間質細胞的胞漿陽性表達(×400)

圖15 NTR組,PI3K在精原細胞、間質細胞的胞漿弱陽性表達(×400)

圖16 NTO組,PI3K在精原細胞、間質細胞的胞漿表達富集(×400)

2.2 性成熟期健側睪丸組織C-kit、PI3K表達的IOD值采用Image-pro plus 6.0軟件分析各組睪丸生精細胞和間質細胞C-kit、PI3K的IOD值。C-kit、PI3K分別在NNTR與NNTO組間比較、以及SNTR與SNTO組間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);但NTR與NTO組間比較,NTO組C-kit、PI3K的IOD值明顯高于NTR(P<0.05)。與假手術對照CG組C-kit、PI3K的IOD值比較,NNTR、NNTO以及NTO組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);與假手術對照CG組比較,SNTR、SNTO以及NTR組C-kit、PI3K的IOD值均顯著降低(P<0.05)。見表1

表1 各組C-kit、PI3K的IOD值比較

3 討 論

睪丸扭轉在小兒和青少年中常見,睪丸扭轉后需手術探查,且依據(jù)術中情況決定睪丸的取舍,但在臨床實踐中,一些疑似壞死的睪丸在未進行病理活檢的情況下,很難判斷睪丸的生機,而且患兒家屬大多不能接受切除睪丸。有文獻[7]報道,單側睪丸扭轉后,健側睪丸大多會受到不同程度的影響。Z.Xia等[8]通過鼠動物實驗發(fā)現(xiàn)一側睪丸發(fā)生扭轉壞死后,對側睪丸、附睪及輸精管均受到一定程度損傷。劉子明等[9]研究發(fā)現(xiàn)實驗性的睪丸扭轉誘導對側睪丸組織受損,表現(xiàn)為曲細精管萎縮,生殖細胞脫落于管腔,生精細胞發(fā)生凋亡,體液免疫和細胞免疫可能參與了這一過程。然而,也有學者通過一系列研究[10]發(fā)現(xiàn),青春前期一側睪丸扭轉后,對側睪丸生精功能并未受到明顯影響。H.Ahmadnia等[11]研究表明睪丸扭轉不會引起對側睪丸的長期損害,多為一過性損害,為保護對側睪丸受損傷而行扭轉側睪丸切除并不必要。上述研究,有的扭轉睪丸已壞死,有的扭轉睪丸未壞死,有的是睪丸扭轉后短期觀察,有的是長期觀察。因此,有必要對處于不同狀態(tài)的扭轉睪丸(扭轉未壞死、扭轉疑似壞死、扭轉壞死),做一全面系統(tǒng)的研究。

干細胞因子SCF/C-kit系統(tǒng)通過PI3K信號通路:PI3K→AKT→mTOR→P70S6K→CyclinD3→Rb p42/p94完成細胞DNA合成信號的傳遞,介導精原細胞增殖[12]。與此同時,相關研究[13]還表明,在多種細胞系的增殖體系中PI3K/AKT途徑是細胞存活并分化的主要途徑,C-kit/PI3K/AKT細胞信號途徑的正常表達對精原細胞增殖、分化具有不可替代的作用。本研究結果顯示,性成熟前期扭轉未壞死睪丸無論復位抑或切除,以及扭轉壞死睪丸切除,對性成熟期健側睪丸無損害;而扭轉疑似壞死睪丸不論復位、還是切除,以及扭轉壞死睪丸復位,對健側睪丸均有損害,致使C-kit、PI3K在生精細胞、間質細胞的胞膜及胞漿中表達降低。進一步研究表明扭轉壞死的睪丸切除,對健側睪丸有保護作用,其原因可能是睪丸發(fā)生扭轉后,一方面睪丸的血睪屏障被破壞,產(chǎn)生的抗精子抗體逸出,引起自身免疫反應,殺傷生精細胞;另一方面,由于睪丸扭轉后產(chǎn)生缺血再灌注損傷,機體抵御過氧化物損傷的關鍵保護因子如核因子E2相關因子(Nrf2)表達減弱,加重生精細胞損傷[14]。從而出現(xiàn)C-kit蛋白表達降低,進一步通過SCF/C-kit通路影響PI3K的表達,導致SNTR、SNTO以及NTR組中C-kit、PI3K表達均降低。

綜上所述,鼠性成熟前期扭轉未壞死睪丸的復位與切除,對性成熟期健側睪丸無損傷;扭轉疑似壞死睪丸無論切除與復位,對性成熟期健側睪丸均有輕微損害,應予以保留;扭轉壞死睪丸的切除,對性成熟期健側睪丸具有保護作用,應盡可能切除。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,動物實驗不涉及知情同意。