半夏瀉心湯對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎影響及作用機制

汪敏，黃亞威，黃然

作者單位：江蘇省中醫院、南京中醫藥大學附屬醫院藥學部，江蘇 南京210029

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease， IBD）是一種全球性的特發性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）［1］。UC 的發病通常從結腸遠端發展到整個結腸，嚴重者甚至可擴散至回腸末端，引起腹瀉、腹痛和便血［2］。 盡管UC 的發病機制尚未明確，但是專家普遍認為氧化還原系統紊亂是UC 發生發展的重要因素［3］。細胞氧化應激存在于炎癥發生和發展過程中，并對炎癥環境產生重要影響［4］。核轉錄因子 E2 相關因子（nuclear factor erythroid 2 Related factor，Nrf2）是一種與細胞動態穩態相關的應激反應轉錄因子［5］，與含有抗氧化反應元件（ARE）序列的基因結合，調控下游多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達，包括血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶-1（NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1）［6］。相關研究利用Nrf2激活劑有效改善了DSS誘導的急性和慢性結腸炎，對結腸炎治療的研究有啟發作用［7-8］。調控Nrf2/HO-1 信號通路介導的氧化應激、抗炎作用可有效治療UC。

半夏瀉心湯（Banxia Xiexindecoction， BXD）出自張仲景的《傷寒雜病論》，由半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、炙甘草、大棗配伍組成，具有辛開苦降、寒溫并用的特點，廣泛用于治療胃腸道疾病，臨床效果較好。半夏瀉心湯治療UC 可明顯減輕病人痛苦、加速癥狀消失、降低復發率［9-10］。藥理研究表明，半夏瀉心湯對腸道具有保護作用，與NLRP3/Caspase-1 細胞焦亡通路［11］、TLRs/NF-κB 通路［12］、腸道菌群［13］等有關。半夏瀉心湯是否作用于Nrf2/HO-1通路緩解UC，尚未見報道。本研究于2023 年1—5月采用小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt， DSS）建立UC 模型，明確半夏瀉心湯對UC 小鼠Nrf2/HO-1 通路的影響，為半夏瀉心湯緩解UC的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、炙甘草、大棗等飲片均購自江蘇省中醫院中藥房，并由黃亞威副主任中藥師鑒定均為真品。有毒藥物半夏以最大劑量9 g為基準，成人每日的用量為半夏9 g、黃芩10.8 g、干姜10.8 g、人參10.8 g、黃連3.6 g、炙甘草10.8 g、大棗7.2 g。依據臨床用藥劑量，根據體表面積法計算得出小鼠給藥量為8.19 g/kg。上述飲片煮沸濃縮后配成含生藥0.4、0.8、1.6 g/mL 藥液，保存于4 ℃冰箱，備用。葡聚糖硫酸鈉（DSS，批號S3045）購自美國MP 公司；美沙拉嗪（批號SS0905CA24）購自上海源葉生物科技有限公司。

活性氧自由基（reactive oxide species， ROS）測試盒（批號20210906）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號20211104）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測 試 盒（ 批 號20211013）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）測試盒（批號20211208）均購自南京建成生物工程研究所； HE 染色試劑盒（批號C0215）、RIPA 組織裂解液（批號P1254）、ECL 發光檢測試劑盒（批號P3258）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號P0147）均購自上海碧云天生物技術有限公司；一抗Nrf2 （批號ab43005）、HO-1 （批號ab44125）和NQO-1（批號ab46732）、β-actin（批號ab45348）均購自Abcam 公司；TRIzol RNA 提取試劑（批號50175111）購自美國Invitrogen 公司；RT-qPCR 試劑盒（批號B31205-127）購自美國Bimake公司。

1.2 儀器顯微鏡 （IX71，日本 Olympus 公司）；組織包埋機（Arcadia，德國Leica 公司）；全自動生化分析儀（AU-5800，美國Beckman Coulter 公司）；酶標儀（SpectraMax 190，美國 MD 公司）；PCR 擴增儀（QuantStudio 3，美國ABI 公司）；凝膠電泳系統（1658033，美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像儀（GelDoc Go，美國Bio-Rad公司）。

1.3 動物C57BL/6J雄性小鼠（20±2）g購自南通大學，合格證號為SCXK（蘇）2019-0001，SPF 級，溫度25 ℃，相對濕度45%，自由攝食飲水。

1.4 造模與給藥60 只C57BL/6J 小鼠適應性飼養1 周后，采用隨機數字表法分為6 組：空白組、模型組、美沙拉嗪組（100 mg/kg）、半夏瀉心湯低劑量組（8.19 g/kg）、中劑量組（16.38 g/kg）、高劑量組（32.76 g/kg），每組10 只。除空白組外，其他各組小鼠自由飲用3% DSS 連續7 d 構建潰瘍性結腸炎模型，各給藥組造模同時灌胃相應藥物治療，每天1 次，連續10 d。末次給藥后，禁食不禁水24 h 后，摘眼球取血，3 000 r/min 離心20 min，分離獲得血清，置于-20 ℃冰箱備用。然后，脫頸椎處死小鼠，取結腸組織，一部分用于病理切片，另一部分保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 疾病活動指數評估根據小鼠體質量、大便性狀和便血情況，計算小鼠疾病活動性指數（disease activity index，DAI），DAI評分標準見表1。

表1 小鼠疾病活動性指數評分標準

1.6 結腸組織HE 染色結腸組織用10%福爾馬林固定24 h，依次經乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切成5 μm厚度薄片后進行HE染色，采用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察結腸組織病理學改變。

1.7 ELISA 法測炎癥因子和氧化指標摘眼球取血后離心得血清，參照ELISA 試劑盒說明書，測定ROS、MDA、SOD、GSH-px水平。

1.8 蛋白質印跡法檢測Nrf2、HO-1 和NQO-1 蛋白表達提取結腸組織蛋白后，采用BCA 法檢測其濃度。取50 μg 蛋白，按1∶4 比例與loadding buffer 混合均勻，煮沸10 min 變性后上樣至12% SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，轉膜，抗原封閉。分別與一抗NRF2 （1∶1 000）、HO-1 （1∶1 000）、NQO-1 （1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min×3 次。與二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜5 min×3 次，加入ECL 顯影液， 采用凝膠成像系統進行拍照，并定量分析蛋白條帶相對灰度值。

1.9 RT-PCR 法檢測Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達取小鼠結腸組織，提取RNA 后采用酶標儀測定其濃度。按照one-step reverse transcription PCR kit 實驗過程進行擴增后檢測NRF2、HO-1 和 NQO-1 mRNA表達，引物序列見表2。

表2 小鼠結腸組織RNA引物序列

1.10 統計學方法采用SPSS 26.0 統計軟件分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），總體有差異進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量、結腸長度改變情況與空白組相比，模型組小鼠體質量在第5、6、7、8、9、10、11 天顯著減輕（P=0.042、0.037、0.028、0.044、0.036、0.032、0.029）；與模型組比較，各給藥組小鼠體質量呈上升趨勢，其中半夏瀉心湯高劑量組在第6、7、8、9、10、11 天差異有統計學意義（P=0.033、0.025、0.034、0.041、0.035、0.027），半夏瀉心湯中劑量組、低劑量組在第8、9、10、11 天差異有統計學意義（P=0.044、0.047、0.035、0.029）。空白組、模型組、美沙拉嗪組、半夏瀉心湯高、中、低劑量組結腸長度分別為（12.53±0.94）、（5.63±0.45）、（10.07±0.98）、（8.97±1.20）、（8.03±0.69）、（7.53±0.69）cm。與空白組相比，模型組小鼠結腸長度明顯縮短（P=0.003）；與模型組相比，半夏瀉心湯低、中、高劑量組小鼠結腸長度明顯延長（P=0.047、0.035、0.025），見圖1。

圖1 小鼠體質量、結腸長度改變：A為小鼠體質量隨時間變化情況；B為小鼠結腸長度比較

2.2 小鼠病理學觀察與疾病活動指數由HE染色結果可知，空白組小鼠結腸黏膜組織結構完整，杯狀細胞排列緊密，未見炎癥細胞浸潤；模型組結腸黏膜組織、隱窩結構被破壞，杯狀細胞大量消失，炎性細胞浸潤，基底漿細胞增加；美沙拉嗪組小鼠結腸組織稍有受損，少量炎性細胞浸潤；半夏瀉心湯高劑量組小鼠結腸組織結構清晰，僅有局部組織受損，少量炎性細胞浸潤；半夏瀉心湯中劑量組小鼠有部分完整的結腸組織結構；半夏瀉心湯低劑量組小鼠結腸組織局部損傷比較嚴重，炎性細胞浸潤程度較高。以上結果說明半夏瀉心湯可改善UC 小鼠病理損傷，且呈現明顯的量效關系。與空白組比較，模型組病理組織學評分顯著提高（P=0.003）。與模型組比較，各給藥組可降低病理組織學評分，其中美沙拉嗪組、半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組的差異有統計學意義（P=0.002、0.027、0.023）。與空白組比較，模型組疾病活動指數明顯增加（P=0.004）。與模型組比較，各給藥組疾病活動指數均呈現降低趨勢，其中美沙拉嗪組、半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組的差異有統計學意義（P=0.003、0.027、0.040），見圖2；表3。

圖2 小鼠結腸黏膜組織（HE×200）：A為空白組；B為模型組；C為美沙拉嗪組；D為半夏瀉心湯高劑量組；E為半夏瀉心湯中劑量組；F為半夏瀉心湯低劑量組

表3 小鼠結腸黏膜組織病理組織學評分和疾病活動指數/± s

表3 小鼠結腸黏膜組織病理組織學評分和疾病活動指數/± s

注：①與空白組比較，P＜0.01。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.3 半夏瀉心湯對UC 小鼠血清中ROS、MDA、SOD 和GSH-px 的影響與空白組比較，模型組小鼠血清中ROS 和MDA 水平顯著升高（P=0.016、0.010），SOD 和GSH-px 活性顯著降低（P=0.001）。半夏瀉心湯高、中劑量組ROS 水平顯著低于模型組（P=0.016、0.012）；與模型組比較，半夏瀉心湯高、中劑量組MDA 水平顯著降低（P=0.011、0.048）；半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組的SOD 含量與模型組的差異有統計學意義（P=0.002、0.049）；半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組、低劑量組的GSH-px 活性與模型組均差異有統計學意義（P=0.003、0.003、0.021）。見表4。

表4 半夏瀉心湯改善UC小鼠的氧化應激/± s

注：UC為潰瘍性結腸炎，ROS為活性氧自由基，MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，GSH-px為谷胱甘肽過氧化物酶。①與空白組比較，P＜0.01。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.4 半夏瀉心湯對UC 小鼠結腸組織中Nrf2、HO-1 和NQO-1 蛋白表達的影響與空白組相比，模型組小鼠結腸組織中Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達顯著降低（P=0.010、0.016、0.004）；與模型組相比，半夏瀉心湯高、中劑量組明顯增加Nrf2 蛋白表達（均P=0.004）；半夏瀉心湯高、中劑量組HO-1 蛋白表達明顯高于模型組（均P=0.011）；與模型組相比，半夏瀉心湯高、中劑量組能夠顯著提高NQO-1 蛋白表達（P=0.002、0.012），見圖3；表5。

圖3 蛋白質印跡法檢測Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表達

表5 半夏瀉心湯對UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表達的影響/± s

表5 半夏瀉心湯對UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表達的影響/± s

注：UC 為潰瘍性結腸炎，Nrf2 為核轉錄因子E2 相關因子，HO-1為血紅素加氧酶-1，NQO-1為醌氧化還原酶-1。①與空白組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.5 半夏瀉心湯對UC 小鼠結腸組織中Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA 表達的影響與空白組相比，模型組小鼠結腸組織中Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達明顯降低（P=0.015、0.026、0.033）；與模型組相比，半夏瀉心湯各給藥組小鼠Nrf2 表達升高，其中半夏瀉心湯高劑量組與模型組的差異有統計學意義（P=0.045）；與模型組相比，半夏瀉心湯各給藥組小鼠HO-1 表達升高，其中半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組相比差異有統計學意義（P=0.023、0.047）；與模型組相比，半夏瀉心湯各給藥組小鼠NQO-1 表達升高，其中半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組相比差異有統計學意義（P=0.017、0.021），見表6。

表6 半夏瀉心湯對UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達的影響/± s

表6 半夏瀉心湯對UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達的影響/± s

注：UC 為潰瘍性結腸炎，Nrf2 為核轉錄因子E2 相關因子，HO-1為血紅素加氧酶-1，NQO-1為醌氧化還原酶-1。①與空白組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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3 討論

目前，UC 是一種全球性疾病，是結直腸癌的危險因素，但UC 的確切病因還不完全清楚。UC 的治療非常復雜，主要是抗炎或免疫抑制劑。但是常用的治療藥物，比如氨基水楊酸、皮質類固醇和硫嘌呤經常導致嚴重的副作用［14］。因此，亟需尋找安全高效的UC 治療藥物。半夏瀉心湯中半夏和胃降逆，消痞散結為君；干姜溫中散寒，黃芩、黃連清泄里熱為臣；人參、炙甘草、大棗益氣健脾，和中補虛為佐。此方中藥味有辛有苦，藥性有寒有溫，辛主升主開，苦主降主泄，寒清熱，溫祛寒，是調和脾胃陰陽的代表方劑。

UC 的炎性環境促使ROS 大量分泌，細胞啟動抗氧化機制控制ROS 含量。過量的ROS 會引起細胞功能紊亂，導致氧化與抗氧化作用失衡［15］。過剩的ROS 引起脂質過氧化、蛋白質變性、致使基因突變，最后引起細胞氧化損傷［16］。因此，氧化應激被認為是UC 誘導和進展的潛在推動力。半夏瀉心湯對UC 有免疫調節、抗炎、調節腸道菌群［13，17］等作用。半夏瀉心湯可通過調節氧化應激治療慢性萎縮性胃炎、糖尿病、膿毒癥胃腸功能障礙等疾病［18-20］。氧化應激失衡是UC 的重要發病原因之一，本研究從抗氧化途徑探討半夏瀉心湯治療UC的作用機制。

Nrf2是一種細胞調控氧化應激反應的重要核轉錄因子，維持氧化還原動態平衡［21］。Nrf2/HO-1是一條最重要的內源性抗氧化信號通路，參與機體腫瘤、炎癥反應、黏膜修復、細胞凋亡等過程［22］。激活Nrf2/HO-1 通路，可增強細胞抗氧化能力［23］。黃芩湯、薏苡附子敗醬散等通過Nrf2 信號通路發揮抗氧化應激作用，從而達到治療UC 的目的［24-25］。本研究發現，DSS 明顯降低模型組中Nrf2、HO-1 和NQO-1蛋白和mRNA 含量；半夏瀉心湯干預后，UC 小鼠結腸組織中Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白和mRNA 表達水平顯著增加。半夏瀉心湯亦能有效逆轉DSS誘導的UC小鼠的氧化應激相關酶指標。

綜上所述，半夏瀉心湯能夠緩解DSS 誘導的UC，降低結腸損傷，可能是通過Nrf2/HO-1抗氧化通路發揮治療作用的。