TLR-7 對阿爾茨海默病細胞模型β 淀粉樣蛋白表達及炎癥反應的調控作用及機制

李 娟 蔡 萃 聶 晶 吳宇婧 張東陽

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種起病隱匿的進行性發展的中樞神經系統退行性疾病，臨床表現為認知、記憶、語言、活動能力等障礙，可改變患者人格及行為等[1]。研究[2]發現，AD 的發病具有明顯的家庭聚集性，其中β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）基因多個位點的突變與AD 的發病密切相關。APP 是在多種細胞和組織中表達的內在膜蛋白，在β 淀粉樣前體蛋白裂解酶1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）等蛋白酶的作用下水解成為β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ），并在神經細胞中沉積產生神經毒性，導致神經細胞功能損傷，引起AD 的發生[3]。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLRs）同源分子是典型的跨膜模式識別受體，可以響應多種細胞內外信號的刺激，調控細胞炎癥因子的表達和分泌，引發炎癥反應及促進抗原提呈細胞的成熟，誘導機體的獲得性免疫反應[4]。其中，Toll 樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR-7）可以識別微小RNA（microRNA，miRNA），并通過與miRNA 的結合參與多種細胞生理活動的調節[5]。研究發現，TLR-7 可能在神經炎癥反應中發揮了重要作用[6]，但其在AD 中的功能仍不清楚。本研究顯示，在AD 模型人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）中，沉默TLR-7 通過靶向微小RNA-15b（miR-15b）介導核因子κB（NF-κB）信號傳導及與BACE1 的表達，抑制神經細胞Aβ 的異常積累和炎癥因子分泌，緩解了APP 突變引起的神經細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 試 劑 DMEM 高糖培養基（貨號11965095）、胎牛血清（貨號10091148）、胰酶消化液（貨號25200072）、Lipofectamine 2000 轉染試劑（貨號11668019）購自美國賽默飛世爾科技公司；總RNA提取試劑盒（貨號DP451）、逆轉錄試劑盒（貨號KR116）、實時熒光定量PCR 試劑（貨號FP201）購自北京天根生物科技公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號E1910）購自美國普洛麥格公司；Aβ、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附試劑盒（貨號DAB142、MLB00C、D6050、DTA00D）購自美國R&D 公司；兔抗APP 抗體、β-肌動蛋白、山羊抗兔二抗（貨號ab32136、ab8653、ab6721）購自美國Abcam 公司。

1.2 儀 器 CO2培養箱（3111-GP，Thermo 公司）；酶標儀（800Ts，Bio-Rad 公司）；流式細胞儀（Novo-Cyte，Aceabio 公司）；熒光PCR 儀（QuantStudioTM5，Thermo 公司）。

1.3 AD 細胞模型的建立 人胚腎細胞系HEK293T（貨號ZQ0033，中喬新舟）和人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y（貨號YS3685C，上海雅吉生物）在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中傳代培養。APP 瑞典家系突變（APP695 KM670/671NL，APPswe）慢病毒包裝質粒pLenti-APPswe 由本研究室構建，pLenti-APPswe 質粒與慢病毒包裝輔助質粒共同轉染HEK293T 細胞，轉染48 h 后，收集培養基上清液，用0.45 μm 一次性濾器過濾后，加入SH-SY5Y 細胞培養基中，孵育24 h 后，加入含1.5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養基繼續培養48 h，最終得到APP 瑞典家系突變人神經母細胞瘤細胞系（SH-SY5Y/APPswe）。

1.4 細胞轉染和分組 以上述獲得的SH-SY5Y/APPswe 和SH-SY5Y 細胞為研究對象，按照1.3 中的轉染方法，將TLR-7 敲低質粒（sh-TLR-7）、對照質粒（sh-NC）、miR-15b 抑制質粒（miR-15b inhibitor）和對照質粒（inhibitor NC）分別轉染至SH-SY5Y/APPswe 細胞中。將細胞分為SH-SY5Y 組、SHSY5Y/APPswe 組、TLR-7 敲 低SH-SY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7）組、敲低對照SHSY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-NC）組、TLR-7敲低+miR-15b 抑制SH-SY5Y/APPswe（SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor）組和TLR-7敲低+miR-15b 抑制對照SH-SY5Y/APPswe（SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC）組。各組轉染細胞系培養24 h 后收集細胞進行檢測。

1.5 實時熒光定量PCR 離心收集各組細胞，加入1 mL 預冷的Trizol 裂解液室溫放置5 min；加入200 μL 氯仿，充分混勻后經12000 g 4 ℃離心10 min，取上層水相500 μL，加入等體積異丙醇，12000 g 4 ℃離心10 min，棄去上清；加入1 mL 75%乙醇漂洗2次，加入無RNA 酶的焦磷酸二乙酯（DEPC）水30 μL使沉淀充分溶解總RNA。取1 μg 總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再行PCR 擴增目標基因。將所得cDNA 加至PCR 反應體系中擴增目標片段，PCR 反應體系為20 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性15 min 后，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環。最后一次循環后做溶解曲線，并采用β肌動蛋白（β-actin）做標準曲線作為參考值，所需引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.6 酶聯免疫吸附實驗 用無菌管收集各組細胞培養基，1000 r/min 離心10 min，加入預先包被抗體的酶標板中，并設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔中加入待測樣本50 μL。4 ℃孵育2 h，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，4 ℃孵育2 h，隨后用漂洗液充分漂洗5 次。最后在每孔加入顯色底物50 μL，室溫避光孵育15 min 后，加入終止液50 μL，立即酶標儀讀取450 nm 波長處測定各孔的OD 值。根據標準品孔實驗數據繪制Aβ、IL-1β、IL-6 和TNF-α 標準曲線，并計算各樣本孔待測樣品濃度。

1.7 蛋白質印跡實驗 離心收集SH-SY5Y 細胞和SY-SY5Y/APPswe 細胞，加入200 μL 4 ℃預冷的放射免疫沉淀法裂解緩沖（RIPA）細胞裂解液，冰上裂解20 min，離心后取其上清液；采取BCA 法測定蛋白濃度，并調整蛋白提取液的濃度，加入5×SDS 上樣緩沖液，煮沸加熱5 min。在100 V 恒壓條件下進行SDS-PAGE 凝膠電泳90 min，結束后，繼續在100 V恒壓條件下轉膜2 h，后將帶有蛋白樣品的PVDF 膜于5%脫脂奶粉中封閉1 h，隨后分別用兔抗APP 抗體（1∶3000 稀釋）、β-肌動蛋白（1∶4000 稀釋）和HRP山羊抗兔二抗（1∶8000 稀釋），室溫各孵育2 h。充分漂洗后，在膜上滴加化學發光底物，用凝膠成像儀獲取蛋白印跡圖片。

1.8 熒光素酶報告基因實驗 用Lipofectamine 2000 轉染試劑轉染，將NF-κB 熒光素酶報告基因質粒pNF-κB-Luc 和對照質粒pRL-TK 轉染各組細胞24 h，棄掉上清，在細胞培養板中加入500 μL 細胞裂解液，室溫靜置5 min，隨后取20 μL 細胞裂解液加入白色不透光96 孔板，每組設置3 個復孔。先后在孔中加入螢火蟲熒光素酶底物和海參熒光素底物，用酶標儀讀取300～700 nm 波長自發光信號。

1.9 統計學方法 應用SPSS 18.0 軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 SH-SY5Y 細胞AD 模型的建立 蛋白質印跡實驗結果表明，與正常SH-SY5Y 細胞相比，慢病毒穩定轉染的SH-SY5Y/APPswe 細胞APP 695 亞型表達水平上調，表明穩定細胞系構建成功，見圖1。

圖1 蛋白質印跡實驗檢測APP 的表達

2.2 敲低TLR-7 對miR-15b 和BACE1 mRNA 表達及Aβ42 分泌的影響 實時熒光定量PCR 實驗檢測各組細胞中TLR-7、BACE1 mRNA 和miR-15b 的表達水平。酶聯免疫吸附實驗檢測Aβ 分泌水平。與SH-SY5Y 組細胞比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe組細胞TLR-7、BACE1 mRNA 和miR-15b 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），而分泌到培養基中的Aβ42 水平則顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組細胞TLR-7、BACE1 mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.01），miR-15b 表達水平顯著升高（P＜0.01），Aβ42分泌水平明顯降低（P＜0.01），見表2。

表2 敲低TLR-7 對BACE1 mRNA、miR-15b 表達和Aβ42 分泌的影響（±s）

表2 敲低TLR-7 對BACE1 mRNA、miR-15b 表達和Aβ42 分泌的影響（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經母細胞瘤細胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉染SH-SY5Y；TLR-7 為Toll 樣受體7；BACE1 為β 淀粉樣前體蛋白裂解酶1；miR-15b 為微小RNA-15b；Aβ42 為β 淀粉樣蛋白42；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組孔數3333 TLR-7 mRNA 1.00±0.00 0.97±0.03 0.98±0.07 0.15±0.02b BACE1 mRNA 1.00±0.00 0.94±0.06 1.02±0.03 0.72±0.06b miR-15b 1.00±0.00 1.08±0.06 1.10±0.05 2.98±0.21b Aβ42（ng/mL）2.09±0.17 11.24±0.76a 10.52±0.67 6.09±0.42b

2.3 TLR-7 通過miR-15b 調控BACE1 的表達及Aβ42 分泌 實時熒光定量PCR 和酶聯免疫吸附實驗顯示，與SY-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組BACE1 mRNA 表達和Aβ42 分泌顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），miR-15b 表達明顯升高（P＜0.01）；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組比較，同時敲低TLR-7 和miR-15b的SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor組BACE1 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05），Aβ42 分泌水平明顯升高（P＜0.01），miR-15b 表達水平下降（P＜0.01），見表3。

表3 敲低TLR-7 與抑制miR-15b 對BACE1 mRNA、miR-15b 表達和Aβ42 分泌的影響（±s）

表3 敲低TLR-7 與抑制miR-15b 對BACE1 mRNA、miR-15b 表達和Aβ42 分泌的影響（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經母細胞瘤細胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉染SH-SY5Y；BACE1 為β 淀粉樣前體蛋白裂解酶1；miR-15b為微小RNA-15b；Aβ42 為β 淀粉樣蛋白42；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+shTLR-7+inhibitor NC 組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數333333 BACE1 mRNA 1.00±0.00 1.02±0.04 1.10±0.06 0.69±0.07b 0.71±0.05 1.39±0.42c miR-15b 1.00±0.00 0.95±0.11 1.03±0.07 3.32±0.19b 2.96±0.35 0.67±0.13d Aβ42（ng/mL）2.32±0.68 13.65±1.98 14.77±2.74 6.99±1.85a 7.47±1.58 19.54±3.01d

2.4 TLR-7 通過miR-15b 調控炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 的表達和分泌 實時熒光定量PCR 實驗結果表明，與SH-SY5Y 組細胞比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 組細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組細胞比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組 細 胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01），見表4。

表4 各組細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達比較（±s）

表4 各組細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達比較（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經母細胞瘤細胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉染SH-SY5Y；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC組比較，cP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數333333 IL-1β 1.00±0.00 4.95±0.28a 4.62±0.41 3.34±0.25b 3.55±0.33 6.07±0.43c IL-6 1.00±0.00 5.90±0.47a 5.43±0.31 3.75±0.34b 4.02±0.22 5.98±0.28c TNF-α 1.00±0.00 1.98±0.14a 2.07±0.18 1.25±0.11b 1.36±0.20 1.88±0.21c

酶聯免疫吸附實驗結果表明，與SH-SY5Y 組比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著下降（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平顯著升高（P＜0.05），見表5。

表5 各組細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平比較（pg/mL，±s）

注：SH-SY5Y 為人神經母細胞瘤細胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉染SH-SY5Y；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC組比較，cP＜0.05

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數333333 IL-1β 57.20±4.95 112.43±10.89a 101.76±7.95 61.40±7.76b 68.62±5.41 155.32±13.67c IL-6 117.62±19.57 982.42±78.84a 893.35±101.43 547.29±39.11b 439.73±60.01 1255.49±119.79c TNF-α 137.89±21.37 356.17±29.08a 375.28±33.99 256.17±24.32b 227.82±26.53 423.66±34.32c

2.5 TLR-7 通過miR-15b 調控NF-κB 信號通路的激活 熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與SHSY5Y 組比較，AD 模型SH-SY5Y/APPswe 組NF-κB熒光素酶活性顯著升高（P＜0.01）。與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組NF-κB 熒光素酶活性顯著下降（P＜0.01）。與SHSY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組比較，SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組NFκB 熒光素酶活性顯著升高（P＜0.01），見表6。

表6 各組細胞NF-κB 相對熒光素酶活性（±s）

表6 各組細胞NF-κB 相對熒光素酶活性（±s）

注：SH-SY5Y 為人神經母細胞瘤細胞；SH-SY5Y/APPswe 為APP 瑞典家系突變轉染SH-SY5Y；NF-κB 為核因子κB；與SH-SY5Y 組比較，aP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組比較，bP＜0.01；與SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組比較，cP＜0.01

組別SH-SY5Y 組SH-SY5Y/APPswe 組SH-SY5Y/APPswe+sh-NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+inhibitor NC 組SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR-7+miR-15b inhibitor 組孔數333333相對熒光素酶活性1.00±0.00 5.27±0.44a 5.01±0.52 3.25±0.31b 3.58±0.27 5.91±0.66c

3 討 論

盡管AD 是一類多因素疾病，但Aβ 的異常積累被認為是誘發AD 的最主要因素，APP 蛋白在以BACE1 為主的水解酶作用下分解產生Aβ，并伴隨自由基釋放，引發細胞氧化損傷，誘發慢性炎癥，進而影響神經細胞膜結構與功能[7]。研究[8]發現，BACE1 在AD 患者大腦中的表達和活性水平均呈現明顯的增強，因而BACE1 一直被作為AD 治療和藥物開發的重要靶點。此外，研究BACE1 在AD 疾病進展中的調控機制，也是該領域的熱點問題。神經系統慢性炎癥反應伴隨了AD 的整個發病過程，在正常的生理狀態下，神經炎癥有助于神經系統損傷的修復，而當炎癥反應過度時則會造成細胞損傷，加速AD 惡化，因此，炎癥反應在AD 中極其重要，適度調控炎癥反應將對AD 的治療大有裨益[9]。TLR-7 受體及其下游信號通路在炎癥反應的調控中發揮了重要作用。Mottas 等[10]研究發現，TLR-7 可以誘導Aβ 攝取及炎癥反應，從而在AD 發病過程中發揮作用，而Ren 等[11]研究發現，TLR-7 的激活可以下調B 淋巴細胞miR-15b 的表達。本研究發現，在過表達APPswe 的AD 模型SH-SY5Y 細胞中，敲低TLR-7 可導致miR-15b表達水平的上調和BCAE1 表達水平下調，并抑制了Aβ42 的分泌（P＜0.01）。為了進一步研究TLR-7 是否通過miR-15b 調控BACE1 的表達，本研究通過miR-15b inhibitor 在TLR-7 敲低的細胞中進一步抑制miR-15b 的表達，結果證實了抑制miR-15b 可以恢復SH-SY5Y/APPswe 細胞BCAE1 mRNA 的表達和Aβ42 的分泌（P＜0.05，P＜0.01）。

有研究[12]發現，NF-κB 的激活在包括AD 在內的神經炎癥性疾病中扮演著重要的角色，在AD 發病過程中，Aβ 誘導的NF-κB 激活上調了促炎細胞如IL-1β、IL-6 等的表達，也有研究[13]表明，NF-κB 活化可刺激BACE1 和APP 的表達。本研究也發現，在SH-SY5Y/APPswe 細胞中，TLR-7 可以通過miR-15b 調控NF-κB 的轉錄活性及IL-1β、TNF-α 和IL-6 等炎癥因子的分泌，這提示TLR-7/miR-15b 對BACE1 和Aβ 分泌的影響可能是通過對NF-κB 信號調節實現的。

綜上所述，本研究揭示了TLR-7/miR-15b 對AD 模型SH-SY5Y/APPswe 細胞的Aβ 分泌和炎癥因子表達的重要調控作用和分子機制，提示TLR-7/miR-15b 在抑制Aβ 積累和神經炎癥反應中潛在的靶點作用，為AD 的致病機制和干預策略的研究提供了新思路。