短鏈脂肪酸通過抑制白細胞介素17A和NF-κB信號通路減輕γδT細胞介導的炎癥反應

劉槃 席德雙 黃瑞 滕益霖 劉睿 曾高峰 宗少暉

1新鄉醫學院第三附屬醫院骨科（河南新鄉 453000）；2廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科（南寧 530021）；3廣西醫科大學公共衛生學院（南寧 530021）；4新鄉醫學院（河南新鄉 453000）

γδT 細胞僅為T 淋巴細胞的一小部分，但這些細胞在宿主防御做出關鍵貢獻［1-2］。研究［3-4］表明腸道中γδT 細胞對感染或炎癥反應迅速，可被募集到損傷部位促進炎癥反應，嚴重影響中樞神經系統疾病的預后。腸道微生物群是一個復雜的生態系統，在細胞代謝、消化和營養吸收以及免疫系統的發育和維持方面有著至關重要的作用［5-8］。有研究［9］表明腸道細菌產生的代謝物對免疫細胞如樹突狀細胞和T 淋巴細胞有著深刻的影響。短鏈脂肪酸作為腸道菌群的主要代謝產物之一，在調節免疫反應和維持抗/促炎平衡方面發揮著重要作用，它是腸道微生物群和免疫系統之間的橋梁［10-12］，可以調節免疫細胞的分化和細胞因子的產生［9］。然而，短鏈脂肪酸對γδT 細胞的影響有待于進一步的研究。為此，在本研究中，采用了腸道微生物代謝產物短鏈脂肪酸對γδT 細胞進行干預，旨在明確短鏈脂肪酸對γδT 細胞的影響，并分析其內在分子機制，以期為微生物代謝產物治療相關疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料SD雌性大鼠購于廣西醫科大學動物實驗中心，體質量（200 ± 10）g；脫氧核糖核酸酶Ⅰ、中性蛋白酶、胰酶、Percoll 細胞分離液、RPMI-1640培養基、佛波酯、布雷非德菌素A 及動物組織/細胞總蛋白提取試劑盒購于北京Solarbio 科技有限公司；膠原酶Ⅳ購于美國Gibco 公司；TCRγ/δ+T 細胞分離試劑盒、Atuo MACS Running Buffer、MS 分選柱購于德國Miltenyi 公司；乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、離子霉素購于美國Sigma 公司；CCK-8 購于安徽白鯊生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司；引物由上海生工公司合成，RNA 提取試劑盒購于TaKaRa 生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購于啟衡星生物科技有限公司；Fixable Viability Dye eFlour ? 780、CD3 Monoclonal Antibody（FITC）、IL-17A Monoclonal Antibody（APC）、Biolegend anti-rat TCR γ/δ（PE）及Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set 購于美國eBioscience 公司；IL-17A，P-P65，P65，IKK，β-actin（一抗）購于美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 γδ 細胞的提取取大鼠腸道組織，去除腸系膜和脂肪組織，縱向切開腸管并用PBS 清洗，將組織剪成1 mm2的小塊后加入5 mL 腸道消化液，在恒溫搖床上消化30 min，使用70 μm 濾網過濾，此步驟重復3 次。將消化的濾液加入PBS 進行離心洗滌，使用Percoll 梯度法分離，收集中間層的單核淋巴細胞離心洗滌后備用。將收集的單核淋巴細胞用80 μL MACS 重懸，并調整細胞濃度至1 ×107個/mL。加入偶聯磁珠的γδ+TCR 抗體，4℃避光孵育25 min，MACS洗滌后使用500 μL MACS重懸。采用Miltenyi 分離柱吸附γδ+TCR 細胞，去除磁場后洗滌出陽性選擇的細胞，即為γδ T 細胞。分選后的細胞轉入RPMI-1640 培養基培養。

1.3 細胞增殖-毒性檢測（CCK-8）分別用含有不同濃度（0、0.125、0.25、5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的乙酸鈉（A）、丙酸鈉（P）、丁酸鈉（B）及混合短鏈脂肪酸（Mix）（乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉混合物，混合比例為12∶5∶3）的完全1640 培養基將γδT 細胞接種到96 孔板中，每孔培養基體積為100 μL，細胞密度為1 × 104個/孔。干預24 h 后，每孔中加入CCK-8 溶液10 μL，避光孵育1.5 h 后，酶標儀測定在450 nm 處每孔的OD值。

1.4 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測IL-17A 因子含量以2 × 106個/孔的濃度將γδT 細胞接種在6 孔板中，設為對照組（Control）、乙酸鈉組（sodium acetate， A）、丙酸鈉組（sodium propionate， P）、丁酸鈉組（sodium butyrate，B）及混合短鏈脂肪酸組（Mix）。使用適當濃度的乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸干預γδT 細胞24 h。培養結束后，2 000 r/min 離心5 min，收集上清液。按照試劑盒的步驟檢測γδT 細胞上清液中的IL-17A 因子含量。

1.5 實時熒光定量（RT-qPCR）檢測IL-17A 因子的表達水平按照上述的方法進行分組和干預γδT 細胞。培養結束后，根據RNA 提取試劑盒的步驟提取各組細胞的RNA，根據吸光度比值檢測RNA 260 nm 和280 nm （A260/A280）評估RNA 的完整性。隨后逆轉錄為cDNA，進行RT-qPCR 檢測各組IL-17A 因子的表達水平。各靶基因的相對表達量由2-ΔΔCT方法。引物序列列見表1。

表1 大鼠各基因引物序列Tab.1 Primers sequence of rat genes

1.6 流式細胞儀分析IL-17+γδT 細胞的比例調整細胞懸液密度，首先使用細胞死活染料FVD-780進行染色鑒定細胞死活，CD45-PerCP-eFluor 710，CD3-FITC，TCR γ/δ-PE 流式抗體避光染色20 min用于表面標記分析。用固定和滲透緩沖液固定和滲透后，加入IL-17A 抗體孵育30 min。洗滌后進行流式細胞術檢測，采用美國Beckman Coulter 公司的CytExpert 2.0 軟件進行統計分析。

1.7 Western blot收集6 孔板中各組的γδT 細胞，根據細胞數量加入相應體積的裂解液，渦旋震蕩冰上裂解后高速離心，收集管里的上清液即是提取的總蛋白。使用BCA 法測定各組蛋白濃度并調整到一致，上樣緩沖液充分混勻后金屬浴中變性。各組蛋白等量上樣后進行SDS-PAGE 電泳，200 mA 恒流轉膜120 min，脫脂牛奶室溫封閉90 min，4 ℃下搖床孵育一抗過夜，室溫避光孵育二抗1 h，TBST漂洗條帶后使用Odyssey掃描儀系統采集Western blot 條帶圖像，Image J 軟件對Western blot 條帶進行分析，以β-actin 為內參，計算目標條帶蛋白與各自內參的數值。

1.8統計學方法使用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料采用（±s）表示，單因素方差分析用于比較不同組別之間的差異，P＜ 0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8 檢測SCFAs 對γδT 增殖活性的影響短鏈脂肪酸干預24 h 后通過CCK-8 法檢測γδT的增殖活性。乙酸鈉的濃度在0.5 mmol/L 及以下時，對γδT 細胞的增殖無抑制作用（P＞ 0.05），濃度＞ 0.5 mmol/L 時對γδT 細胞的增殖有抑制作用（P＜ 0.001）。丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸的濃度在0.25 mmol/L及以下時，對γδT細胞的增殖無抑制作用（P＞ 0.05），濃度大0.25 mmol/L 時對γδT細胞的增殖有抑制作用（P＜ 0.001）。因此在后續的實驗中，濃度設置為乙酸鈉0.5 mmol/L、丙酸鈉0.25 mmol/L、丁酸鈉0.25 mmol/L、混合短鏈脂肪酸0.25 mmol/L 來對γδT 細胞進行干預。見圖1。

圖1 SCFAs 以劑量依賴方式抑制γδT 細胞的增殖Fig.1 SCFAs inhibit the proliferation of γδT cells in a dose-dependent manner

2.2 ELISA 檢測γδT 細胞中IL-17A 因子含量ELISA 結果顯示，丙酸鈉組、丁酸鈉組及混合短鏈脂肪酸組處理的γδT 細胞上清液中IL-17A 的含量較Control 組均顯著降低，其中丁酸鈉組抑制的最明顯（P＜ 0.001），丙酸鈉和混合短鏈脂肪酸次之（P＜ 0.001），乙酸鈉組無明顯抑制（P＞ 0.05）。見圖2。

2.3 RT-qPCR 檢測γδT 中IL-17A 因子表達水平丙酸鈉組、丁酸鈉組及混合短鏈脂肪酸組處理的γδT 細胞中IL-17A 的表達水平較Control 組均顯著降低，其中丁酸鈉組降低的最明顯（P＜0.001），丙酸鈉組和混合短鏈脂肪酸組次之（P＜0.001）。RT-qPCR 實驗也在mRNA 水平印證了丙酸鈉、丁酸鈉及混合短鏈脂肪酸可以顯著抑制γδT 細胞分泌IL-17A（P＜ 0.001）。見圖3。

圖3 RT-qPCR 檢測γδT 細胞中IL-17A 因子的表達水平Fig.3 Expression of IL-17A in γδT cells was determined by RT-qPCR

2.4 流式細胞術檢測IL-17+γδT 細胞的數量與Control 組相比，IL-17+γδT 細胞的比例在經過乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉以及混合的短鏈脂肪酸干預后都有明顯的下降。和乙酸鈉組相比，丙酸鈉組、丁酸鈉組和混合短鏈脂肪酸組抑制IL-17+γδT 的能力更明顯，但是丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸三者之間抑制IL-17+γδT 的能力無明顯差別。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測IL-17+γδT 細胞的數量Fig.4 Frequency of IL-17+γδT cells was detected by flow cytometry

2.5 SCFAs 可能通過抑制組蛋白去乙酰化酶（HDAC）的表達來減少γδT細胞IL-17A的分泌將混合的短鏈脂肪酸（Mix）、HDAC 的抑制劑TSA、Mix + TSA 和γδT 共培養24 h，然后檢測IL-17+γδT細胞的比例。與Control 組相比，三組經過處理后的IL-17+γδT 細胞的比例均明顯下降（P＜ 0.001），Mix、TSA 和Mix+TSA 三者之間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖5。

圖5 SCFAs 可能通過抑制HDAC 的表達來影響γδT 細胞IL-17A 的分泌Fig.5 SCFAs may affect IL-17A secretion in γδT cells by inhibiting HDAC expression

2.6 SCFAs 可通過抑制IL-17A 和NF-κB 信號通路來減輕炎癥反應通過Western blot 實驗檢測γδT 細胞內IL-17A 的表達水平及NF-κB 信號通路關鍵蛋白。與Control 組比較，丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸可抑制IL-17A、IκB 激酶（IKK）以及NF-κB 磷酸化水平的表達（P＜ 0.05），而乙酸鈉對IL-17A、IKK 以及NF-κB 的磷酸化水平無明顯抑制（P＞ 0.05）。見圖6。

圖6 短鏈脂肪酸對IL-17A 和NF-κB 信號通路的影響Fig.6 Effect of short-chain fatty acids on IL-17A and NF-κB signaling pathway

3 討論

γδ T細胞是一種獨特的T細胞亞群，在如皮膚、腸道黏膜和脂肪組織等外周組織中富集，尤其在腸道中非常豐富［13］。它們不受主要組織相容性復合體限制，具有先天免疫細胞的多種特性，在先天和免疫反應中起著至關重要的作用［14］。γδT 細胞不僅對感染或炎癥反應迅速，還能促進干擾素-γ、IL-17A 和IL-23 的分泌，這可能會嚴重影響中樞神經疾病的預后［15］。短鏈脂肪酸具有較為豐富的生物學作用，可參與機體的免疫調節，促進免疫細胞分化成熟［16-17］。因此，深入研究短鏈脂肪酸作用于γδT 細胞的分子機制，可為這些小分子代謝物用于中樞神經系統疾病的治療提供新的依據。本研究采用短鏈脂肪酸對γδT 細胞進行干預，以探索短鏈脂肪酸對γδT 細胞的影響。本研究發現一定濃度的短鏈脂肪酸對γδT 細胞沒有毒性作用，并且可以影響到γδT 細胞IL-17A 和NF-κB 信號通路的表達。這些研究結果均提示短鏈脂肪酸能通過抑制γδT 細胞來抑制炎癥反應。

炎癥的發生、發展和終止需要基因激活、表觀遺傳修飾、轉錄翻譯和翻譯后調控，所有這些都受到不同酶的嚴格調控［18］。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDACs）可調節炎癥相關基因的表達，直接影響炎癥的過程［19］。短鏈脂肪酸是HDACs 的天然抑制劑［20］。本研究發現使用一定濃度的短鏈脂肪酸處理γδT 細胞后，丙酸、丁酸及混合的短鏈脂肪酸顯著抑制γδT 細胞中IL-17A的表達。在使用泛HDAC 抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）干預γδT 細胞后，其分泌的IL-17A 同樣得到明顯的抑制。然而，當把短鏈脂肪酸和TSA 混合起來干預γδT 細胞，其抑制γδT 細胞分泌的IL-17A與兩者分別干預后的無明顯差異。因而，推斷短鏈脂肪酸可能是通過抑制HDAC 來起到抑制γδT 來分泌IL-17A 的。

轉錄因子NF-кB 在調節免疫炎癥反應中的作用是基礎性的。它上調特定基因，包括細胞因子、趨化因子、主要組織相容性復合體以及免疫細胞黏附和遷移所需的受體，以及細胞增殖和凋亡［21-22］。IL-17 是機體重要的炎癥因子，它通過誘導促炎細胞因子和趨化因子，招募中性粒細胞，激活T 細胞和B 細胞，在各種炎癥反應和自身免疫性疾病的發病機制中起著關鍵作用［23-24］。IL-17R可識別IL-17 并介導NF-κB 信號通路的激活，誘導p65 表達，進而增強IL-17 自分泌［25］。IL-17 可以與其他細胞因子（如TNF-α）相互作用以激活NF-κB并促進和延長炎癥反應［26］。而阻斷IL-17 可有效地抑制LPS 誘導的肺組織中NF-κB 的表達和激活，并抑制NF-κB 的核轉位［27］。本研究發現，短鏈脂肪酸可抑制IL-17A、IKK 的表達以及NF-κB 磷酸化水平，這提示短鏈脂肪酸可能通過阻礙γδT 細胞的IL-17A 和NF-κB 信號通路，進而減輕機體的炎癥反應。

綜上所述，短鏈脂肪酸可抑制γδT 細胞IL-17A和NF-κB 的激活，從而減輕機體的炎癥反應，其機制可能是短鏈脂肪酸通過調控HDAC 來實現的。本研究通過初步證實了短鏈脂肪酸可抑制γδT 細胞減輕機體的炎癥反應，并探究了其可能的分子機制，為這些小分子代謝物用于中樞神經系統疾病的治療提供一定的理論依據。但該研究尚有不足之處，目前只在從流式實驗中推斷短鏈脂肪酸可能是通過HDAC 影響到γδT 來分泌IL-17A 的。然而，短鏈脂肪酸怎樣通過HDAC 影響到γδT 細胞，以及到底抑制了HDAC 的哪個亞型來發揮作用，后續本課題組還將繼續對其作用機制進行深入探討并加以驗證。

【Author contributions】LIU Pan performed the experimental research and wrote the article. XI Deshuang analyzed the experimental data. HUANG Rui， TENG Yilin and LIU Rui collectedand organized the literature. ZONG Shaohui and ZENG Gaofeng formulated the article ideas and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.