MAPK通過調控TLR4/Myd88/NF-κB通路對妊娠期腸梗阻胃腸功能的影響

高飛 李景 李洪健

1河北醫科大學第二醫院普外科 （石家莊 050000）；河北省第八人民醫院2護理部，3普外肛腸科（石家莊 050000）

腸梗阻為腸道中腸道內容物不能正常運行、通過，不但可造成腸管本身功能、解剖結構變化，且可引發全身性生理紊亂，嚴重情況下可危及生命，臨床多通過手術、放置支架、廣譜抗生素治療，多數患者可經上述方法治療恢復，但其復發率較高，進而對患者生命安全構成了嚴重威脅［1-2］。妊娠期腸梗阻多發生于存在腹部手術史、剖宮產史人群，發病率較低，胃腸道為全身炎癥反應的始動器、觸發器，在腸梗阻發生后胃腸吸收、消化功能遭受破壞，易引發腸黏膜屏障損傷，進而造成了一系列生理、病理變化、甚至造成了多器官功能障礙綜合征、全身炎癥反應綜合征，加重了妊娠期腸梗阻患者病情，故需及時診治［3-4］。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是可對多種細胞外刺激做出反應的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與癌癥、自身免疫性疾病等存在密切聯系。Toll 樣受體4/髓樣分化因子88/核轉錄因子-κB（Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear transcription factor-κB，TLR4/MyD88/NF-κB）通路是與免疫性疾病、炎癥性疾病存在密切聯系的信號通路，對炎性因子釋放具有促進作用，可引發腸黏膜細胞再灌注損傷，進而加重了腸梗阻患者病情。目前臨床關于MAPK 通過調控TLR4/Myd88/NF-κB 通路對妊娠期腸梗阻胃腸功能影響的相關研究較少，基于此，本研究分析MAPK 通過調控TLR4/Myd88/NF-κB 通路對妊娠期腸梗阻胃腸功能的影響，為妊娠期腸梗阻診斷、治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料選取SPF 級Wistar 大鼠105 只，雌性、雄性分別為70、35 只，體質量220 ～ 260 g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，動物許可證號：SYXK（粵）2020-0229，所有大鼠在無病原菌環境（室溫23oC、相對濕度50%）中進行喂養，高溫高壓對所使用的水、食物進行殺毒，共進行5 d 適應性喂養，本研究操作均參照動物試驗倫理相關要求，且研究經醫院倫理委員會批準，批準號：（2019）倫審第（56）號。

主要試劑與儀器：水合氯醛（武漢榮燦生物科技有限公司），PCR 試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司；KG204］，ELISA 試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司），LX-400 迷你離心機（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），-80 ℃超低溫冰箱（日本Sanyo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 MAPK 慢病毒載體構建LPL 基因序列經GenBank 查找序列而獲得，構建MAPK 沉默、過表達轉染質粒，通過上海吉瑪公司設計和合成，并行慢病毒滴度測定（病毒滴度為1 × 109TU/mL）。

1.2.2 分組與建模在喂養5 d 后，將所有大鼠同籠放置，第2、3 天連續進行陰道栓檢查，將受孕大鼠納入后續研究，共有33 只雌性大鼠妊娠成功，將妊娠成功的大鼠繼續飼養12 d，第13 天將妊娠成功的8 只作為空白組，剩余25 只雌性大鼠參照孟瑩等［5］建立腸梗阻模型，術前禁食、禁水12 h，1%水合氯醛（10 mL/kg）麻醉后，對大鼠進行固定，將腹部毛發剔除，將碘伏全面涂抹至腹部，之后采用眼科剪沿下腹正中線在大鼠下腹正中做約2 cm 的切口，以此將皮膚、淺筋膜、腹壁肌肉切開，使得腹腔暴露，使用無損傷鉗將距盲腸15 cm 左右小腸及盲腸取出，取出后放置于提前采用生理鹽水浸潤的紗布之上，對腸道結構進行辨認，采用生理鹽水自上而下進行擦拭，共5 次，期間應小心操作，保持力道均勻，避免對腸系膜血管造成損傷，體外暴露30 min 后還納腹腔，期間保持輕柔，避免腸道扭轉，采用棉簽（浸有碘伏）對腹腔進行擦拭，關閉腹腔，再次采用碘伏進行擦拭，采用紅外理療燈對大鼠進行2 h 復溫，以大鼠出現大便、進食量明顯減少，萎靡、懶動、腹前明顯較前膨隆為建模成功，最終建模成功24 只，將其分為模型組、上調組、下調組各8 只。

1.2.3 MAPK 轉染上調組、下調組大鼠胃組織中分別注射10 μL MAPK 過表達慢病毒懸液、MAPK 沉默慢病毒懸液，同劑量的蒸餾水灌注于空白組、模型組大鼠胃中，24 h 后對大鼠變化進行觀察。

1.3 指標檢測樣本采集：于MAPK 轉染后，將所有大鼠麻醉后處死，獲得大鼠小腸組織，經脫水、透明、石蠟包埋后制成小腸標本，-80 ℃保存。

1.3.1 一般情況觀察于建模后MAPK 轉染前，對空白組大鼠、建模大鼠活動度、飲食、進水、排尿情況、皮毛光澤度、精神狀況進行觀察記錄。

1.3.2 病理學觀察MAPK 轉染后，取大鼠的小腸組織，經脫水、石蠟包埋等處理后，行HE 染色，光鏡下觀察，圖片拍攝，分析病理形態變化。

1.3.3 MAPK 轉染效率鑒定和TLR4、Myd88、NF-κB 表達量檢測于MAPK 轉染后，取出大鼠小腸組織，實時熒光定量法測定MAPK 轉染效率和TLR4、Myd88 及NF-κB 的表達量，提取小腸組織總RNA，通過Takara 逆轉錄試劑盒逆轉錄小腸組織中的RNA 為cDNA，Primer 5.0 軟件設計引物序列，反應體系為：1 μL cDNA 模板、3.4 μL dH2O 混合，加蒸餾水至20 μL。反應條件為：95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 2 min，共進行40 個循環，采用2-△△Ct方法計算出MAPK、TLR4、Myd88、NF-κB 表達量，內參基因為GAPDH。

1.3.4 檢測胃腸功能指標水平MAPK 轉染后，取大鼠小腸組織，加入組織蛋白抽離液（1∶10），充分碾碎，離心15 min（離心半徑、轉速別為3 cm、3 000 r/min），獲得上清液，保存待測于-80 ℃超低溫冰箱中，通過免疫放射法對各組大鼠MOT、VIP、GAS 水平進行檢測。

1.3.5 檢測炎性因子指標水平MAPK 轉染后，取大鼠小腸組織，加入組織蛋白抽離液（1∶10），充分碾碎，離心15 min（離心半徑、轉速別為3 cm、3 000 r/min），獲得上清液，保存待測于-80 ℃超低溫冰箱中，通過酶聯免疫吸附（ELISA）法對各組大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）水平進行檢測。孔中加入將待測樣品10 μL 與稀釋液40 μL，搖晃均勻后在孔中加入100 μL 酶標試劑后封板，之后孵育60 min（37 ℃），棄去孔中液體，進行重復清洗，清洗采用Wash Sohltion，完成后加50 μL 顯色劑，搖晃均勻后在37 ℃下進行顯色處理15 min 后終止反應，在450 nm 波長下檢測OD值，查出TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10 水平。

1.3.6 檢測TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路蛋白相對表達量通過Western blot 對小腸組織中的TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白相對表達量進行檢測，裂解30 min 后，取上清液，檢測BCA 蛋白定性，將樣品上樣至凝膠上，電泳，轉移至PVDF 膜上，PBS封閉，羊抗鼠TLR4、Myd88 及NF-κB 一抗采用TBST 稀釋，比例為1∶2 500，4 ℃ 孵育過夜，洗膜3 次，加入羊抗鼠二抗（1∶10 000），1 h 溫室孵育，做TBST 洗膜3 次，GAPDH 為內參照，定量分析TLR4、Myd88 和NF-κB 蛋白表達情況，試驗重復3 次。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0 統計學軟件進行處理。計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用方差齊性檢驗，多個均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗或Bonfferonit檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察空白組大鼠皮毛順滑、飲食正常，無腹脹、活動度正常、精力充沛、排便無異常，建模大鼠精神萎靡、活動度減少、排便減少、毛皮欠光澤、飲食量減少。

2.2 病理學特征見圖1，空白組大鼠小腸無炎癥，結構排列整齊；模型組大鼠炎性細胞、淋巴細胞增多，杯狀細胞減少或消失，小腸絨毛上皮結構破壞、脫落、壞死，界限不清；上調組大鼠炎性細胞、淋巴細胞增多明顯，小腸絨毛上皮結構嚴重破壞，界限不清；下調組大鼠炎性細胞浸潤減輕，但小腸絨毛上皮仍有脫落、壞死。

圖1 病理特征比較（HE，×200）Fig.1 Comparison of pathological features （HE， ×200）

2.3 MAPK 轉染效率鑒定與空白組比較，模型組、上調組、下調組MAPK 表達量升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，上調組MAPK 表達量升高，下調組MAPK 表達量下降（P＜ 0.05）；與上調組比較，下調組MAPK 表達量下降（P＜ 0.05），以上差異均有統計學意義，說明轉染成功。見表1。

表1 MAPK 轉染效率的鑒定Tab.1 Identification of MAPK transfection efficiency ±s

表1 MAPK 轉染效率的鑒定Tab.1 Identification of MAPK transfection efficiency ±s

注：與空白組相比，aP ＜ 0.05；與模型組相比，bP ＜ 0.05；與上調組相比，cP ＜ 0.05

MAPK表達量1.40 ± 0.17 2.23 ± 0.35a 2.69 ± 0.39ab 1.65 ± 0.17abc 2.941 0.011組別空白組模型組上調組下調組F值P值例數8888

2.4 各組大鼠胃腸功能指標水平對比與空白組比較，模型組、上調組、下調組MOT 水平下降，VIP、GAS 水平升高；與模型組比較，上調組MOT水平下降，VIP、GAS 水平升高，下調組MOT 水平升高，VIP、GAS 水平下降；與上調組比較，下調組MOT 水平升高，VIP、GAS 水平下降，以上差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠胃腸功能指標水平對比Tab.2 Comparison of gastrointestinal function indexes of rats in each group ±s

表2 各組大鼠胃腸功能指標水平對比Tab.2 Comparison of gastrointestinal function indexes of rats in each group ±s

注：與空白組相比，aP ＜ 0.05；與模型組相比，bP ＜ 0.05；與上調組相比，cP ＜ 0.05

GAS（ng/L）40.29 ± 4.21 79.42 ± 7.36a 87.55 ± 9.01ab 50.36 ± 6.45abc 3.698 0.002組別空白組模型組上調組下調組F值P值例數8888 MOT（ng/L）100.69 ± 20.37 60.88 ± 15.73a 52.83 ± 11.39ab 76.89 ± 17.05abc 2.534 0.024 VIP（pg/L）50.29 ± 5.01 80.77 ± 10.68a 86.35 ± 11.09ab 62.85 ± 6.14abc 4.483 0.001

2.5 各組大鼠炎性因子水平對比與空白組比較，模型組、上調組、下調組TNF-α、IL-6 水平升高，IL-4、IL-10 水平下降；與模型組比較，上調組TNF-α、IL-6 水平升高，IL-4、IL-10 水平下降，下調組TNF-α、IL-6 水平下降，IL-4、IL-10 水平升高；與上調組相比，下調組TNF-α、IL-6 水平下降，IL-4、IL-10 水平升高，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠炎性因子水平對比Tab.3 Comparison of inflammatory factors in each group ±s

表3 各組大鼠炎性因子水平對比Tab.3 Comparison of inflammatory factors in each group ±s

注：與空白組相比，aP ＜ 0.05；與模型組相比，bP ＜ 0.05；與上調組相比，cP ＜ 0.05

組別空白組模型組上調組下調組F值P值IL-10（pg/mL）130.69 ± 20.58 90.31 ± 16.13a 78.58 ± 13.52ab 103.59 ± 17.23abc 2.856 0.013例數8888 TNF-α（ng/L）72.59 ± 10.77 224.73 ± 30.76a 260.89 ± 36.89ab 101.59 ± 12.73abc 4.919 0.001 IL-6（ng/L）35.44 ± 5.12 70.89 ± 8.45a 76.90 ± 9.01ab 42.37 ± 4.20abc 2.960 0.010 IL-4（pg/mL）16.02 ± 2.25 8.77 ± 2.01a 6.02 ± 1.56ab 12.10 ± 2.14abc 3.571 0.003

2.6 各組大鼠TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量與空白組比較，模型組、上調組、下調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量升高；與模型組相比，上調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量升高，下調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量下降；與上調組相比，下調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量下降，以上差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

表4 各組大鼠TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量Tab.4 Expression levels of TLR4， Myd88 and NF-κB mRNA in rats of each group ±s

表4 各組大鼠TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 表達量Tab.4 Expression levels of TLR4， Myd88 and NF-κB mRNA in rats of each group ±s

注：與空白組相比，aP ＜ 0.05；與模型組相比，bP ＜ 0.05；與上調組相比，cP ＜ 0.05

NF-κB 1.00 ± 0.01 1.55 ± 0.17a 1.92 ± 0.19ab 1.18 ± 0.11abc 4.609 0.001組別空白組模型組上調組下調組F值P值例數8888 TLR4 1.00 ± 0.01 1.46 ± 0.12a 1.70 ± 0.15ab 1.21 ± 0.10abc 5.910 0.001 Myd88 1.00 ± 0.01 1.53 ± 0.16a 1.90 ± 0.20ab 1.20 ± 0.13abc 4.339 0.001

2.7 各組大鼠TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路相關蛋白相對表達量與空白組比較，模型組、上調組、下調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 相對表達量升高；與模型組比較，上調組TLR4、Myd88、NFκB mRNA 相對表達量升高，下調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 相對表達量下降；與上調組比較，下調組TLR4、Myd88、NF-κB mRNA 相對表達量下降，以上差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表5和圖2。

表5 各組大鼠TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路相關蛋白相對表達量Tab.5 Relative expression levels of TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway related proteins in rats of each group ±s

表5 各組大鼠TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路相關蛋白相對表達量Tab.5 Relative expression levels of TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway related proteins in rats of each group ±s

注：與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調組相比，cP＜0.05

NF-κB 1.00 ± 0.01 1.59 ± 0.20a 1.99 ± 0.22ab 1.25 ± 0.13abc 5.423 0.001組別空白組模型組上調組下調組F值P值例數8888 TLR4 1.00 ± 0.01 1.55 ± 0.13a 1.79 ± 0.17ab 1.23 ± 0.12abc 5.402 0.001 Myd88 1.00 ± 0.01 1.60 ± 0.18a 1.98 ± 0.20ab 1.21 ± 0.13abc 4.556 0.001

圖2 TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路蛋白Western blot 圖Fig.2 Western blot map of TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway protein

3 討論

妊娠期腸梗阻的發生與腸套疊、腸粘連、疝、腸扭轉等因素存在聯系，臨床多表現為嘔吐、腸內容物無法排出、腹痛等，可對患者排氣、排便造成不利影響，嚴重情況下可引發腸絞窄、腸穿孔等，進而對母嬰健康構成了嚴重威脅，目前臨床主要通過X 線對腸梗阻進行診斷，但因電離輻射對胎兒具有一定的損害，因此診斷難度較大，繼而造成了治療延誤。

MAPK 在炎癥介質調控中發揮著重要作用，可經JNK、p38MAPK、ERK1/2 等途徑促進炎癥細胞因子的生成，進而引發或加劇炎癥反應。本研究發現，妊娠期腸梗阻大鼠經下調MAPK 干預后胃腸功能增強，炎性反應緩解，癥狀改善，提示下調MAPK 可抑制妊娠期腸梗阻病情進展。有研究［6］表明，在腸道屏障損傷、潰瘍性結腸炎等疾病中MAPK 均呈異常表達，高表達的MAPK 可誘發細胞的炎癥反應，進而增加了腸道的炎性細胞浸潤，加重了腸道炎癥，故抑制MAPK 表達可預防或減輕腸梗阻炎癥反應，進而改善其臨床癥狀，其結果與本研究結果相似。

腸道疾病發生、發展過程中MOT、VIP、GAS 發揮著重要作用，上述指標可對胃腸道功能進行反映［7］。本研究發現，妊娠期腸梗阻大鼠經下調MAPK 干預后MOT、IL-4、IL-10 水平上升，VIP、GAS、TNF-α、IL-6 水平下降，表明下調MAPK 對妊娠期腸梗阻胃腸功能具有改善作用，且可緩解炎性反應。有關研究［8-10］發現，MOT 可參與小腸分節活動、胃強力收縮、胃腸道水電解質運輸、胃腸運動的胃腸激素，其水平上升對胃腸道蠕動具有促進作用，進而加速了腸內容物通過；VIP 主要在結腸、十二指腸中存在，對胃蛋白酶、胃酸分泌具有抑制作用，且可松弛胃底平滑肌，最終抑制性調控了胃腸活動；GAS 是可參與胃竇及胃體收縮、胃腸道運動的G 細胞分泌產物，其表達水平與胃腸道功能障礙呈正相關。另有研究［11-12］表明，TNF-α 是由細菌產物及脂多糖活化巨噬細胞后分泌的細胞因子，可加重炎癥反應活性，IL-6 是可引發或加重器官炎癥反應的免疫調節活性細胞因子，TNF-α、IL-6 水平升高可造成腸粘連、腸黏膜損傷；IL-4、IL-10 均是具有免疫調節、免疫抑制、抗炎等作用的Th2 細胞因子，對巨噬、嗜酸、中性粒細胞產生炎性因子具有抑制作用，可減輕腸黏膜炎癥反應，緩解組織損傷，進而對組織修復、重建起到了有利作用。

TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路可促使細胞炎癥反應［13-15］。有研究［16］表明，阻斷TLR4 的表達可抑制炎癥反應和并發癥，其中Myd88 為重要的鏈接蛋白因子，能夠對TLR4/Myd88/NF-κB 信號分子下游轉導進行識別，進而激活NF-κB，激活后的NF-κB 可顯著提升TNF-α、IL-6 等炎性因子表達，進而引發細胞功能紊亂，對腸黏膜屏障完整性造成破壞。本研究發現，下調MAPK 干預后妊娠期腸梗阻大鼠TLR4/Myd88/NF-κB 表達量降低，提示下調MAPK 可通過調節TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路抑制炎癥因子表達，緩解胃腸功能障礙。劉繼攀等［17］研究表明，MAPK 可引發一系列連鎖反應，可活化核轉錄因子、激活肥大及巨噬細胞，進而促進了IL-1、TNF-α、IL-6 等趨化、促炎細胞因子釋放，激活了TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路，經下調MAPK 可抑制TLR4/Myd88/NF-κB 信號通路，減輕炎癥反應，進而緩解了腸組織缺血損害，對腸屏障功能起到了有效保護作用，與本研究結果相同。

綜上所述，本研究結果顯示妊娠期腸梗阻發生后伴隨著MOT 水平的下降，VIP、GAS、TNF-α、IL-6 水平的升高等表現，經下調MAPK 后，炎性反應得到抑制，胃腸功能改善，其機制可能與TLR4/Myd88/NF-κB 通路得到抑制有關，但本研究就仍具有局限性，例如研究指標較少且未分析MAPK在其他通路中的作用機制，因此需后續多角度、多方位、多指標研究探究，為臨床妊娠期腸梗阻的靶向治療提供依據。

【Author contributions】GAO Fei performed the experiments and wrote the article.LI Jing performed the experiments. LI Hongjian revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.