miR-152-3p通過AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路促進腦出血大鼠神經元鐵死亡

汪赟輝，張笑鋒

德清縣人民醫院（浙江大學附屬邵逸夫醫院德清院區） 神經外科，浙江 湖州 313200

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）作為神經外科急癥，是由慢性高血壓或動脈粥樣硬化導致腦內小微血管破裂引起的神經損傷性疾病[1]。雖然ICH僅占腦卒中的10%～15%，但其能夠加劇導致腦卒中患者的死亡和殘疾。該疾病因其住院治療周期長，預后不佳，并發癥多等特點，消耗大量醫療資源[2]。目前研究表明，ICH的致病機制大致是由于腦血腫壓迫腦組織，并在其融解的過程中大量釋放凝血酶、鐵離子等毒性物質及活性氧自由基和炎癥因子，引發細胞毒性腦水腫。腦水腫是ICH后繼發性腦損傷的關鍵因素，是造成患者神經功能缺損的主要原因[3]，其主要因素可能是由于腦水腫導致壓迫腦神經細胞，進而導致神經元細胞死亡[4-5]。有研究稱ICH后神經細胞處于缺血缺氧狀態，并表現出多種細胞死亡形式[6]。鐵死亡的實質是細胞內脂質氧化物代謝障礙，在鐵離子催化作用下代謝發生異常，當細胞抗氧化能力減弱，脂質活性氧堆積，使細胞內氧化還原失衡，誘導細胞死亡[7]。鐵作為血腫降解的主要活性產物，可通過多種途徑導致繼發性腦損傷[8]。因此，明確ICH后神經細胞死亡機制，在病程中采取相應干預措施抑制神經細胞鐵死亡是減輕繼發性腦損傷的關鍵。MicroRNAs （miRNAs）在調控基因轉錄后基因表達過程中起著重要作用[9]。相關的研究結果表明miRNA在ICH的發病中具有重要的調控作用[10]，在大鼠ICH模型中抑制miR-let-7c的表達則能夠減少細胞死亡和細胞水腫，起到神經保護[11]，相關研究[12-14]還發現腦出血患者血漿中miR-150、miR-365、miR-30c、miR-27a、miR-574-5p、miR-130a及miR-423均出現了異常表達。本研究中，我們發現miR-152-3p在體外誘導ICH的神經元中顯著上調。因此，我們推測miR-152-3p很有可能參與ICH的發生與發展。本研究通過體外細胞實驗探討抑制miR-152-3p表達后對ICH導致的體外神經元細胞凋亡的改善作用，以及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠腦皮層神經元細胞（KMCC-002-137，上海昆盟生物科技有限公司）；DMEM培養基（北京索萊寶公司）；FITC/PI細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，杭州天杭生物科技公司）；LipofectamineTM2000試劑盒和TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；引物序列、miR-152-3p inhibitor（si-RNA，南京凱基生物科技公司設計合成）；PIK3CA抑制劑（LY294002，美國Sigama公司）；反轉錄試劑盒和PCR試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；兔抗鼠磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform, PIK3CA）、磷酸化蛋白激酶B（phosprotein kinase B, p-AKT）、蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）、核因子紅系2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor2, Nrf2）和GAPDH多克隆抗體（英國Abcam公司）；RIPA試劑和化學發光試劑（南京凱基生物科技公司）；氧合血紅蛋白（oxyhemoglobin，oxyHb，上海西格生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 將大鼠腦皮層神經元細胞復蘇后，使用DMEM培養基（含有10%的FBS）進行培養。取對數生長期的大鼠腦皮層神經元細胞接種在6孔板中（0.5×106個/孔），使用LipofectamineTM2000將miR-152-3p inhbitor轉染入細胞，轉染完成后6 h，更換培養基。繼續培養24 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞分組及處理 細胞分為對照組、模型組、miR-152-3p inhibitor組和miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組。對照組細胞給予常規培養；模型組細胞參照相關文獻[15-16]，以 10 μmol/L oxyHb刺激大鼠神經元細胞6 h構建ICH體外細胞模型；miR-152-3p inhibitor組細胞在將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，構建ICH體外細胞模型；miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組細胞在將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，構建ICH體外細胞模型并給予10 nmol/L PIK3CA抑制劑處理。各組細胞給予相應處理48 h后，收集各組細胞進行后續實驗。每個實驗均重復3次。

1.2.3 RT-qPCR檢測 各組細胞分別給予相應處理48 h后，離心收集細胞后，用PBS清洗2次后，使用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄為cDNA，行PCR擴增。引物序列見表1，miR-152-3p以U6為內參，其他基因以GAPDH為內參，用2-ΔΔCt法計算相應基因的相對表達量。

表1 相關基因引物序列

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，PBS清洗2次后，將細胞濃度調整為5.0×104個/mL。取細胞懸液1.0 mL，離心（1 000×g，5 min），去除上清液后，加入500 μL的結合緩沖液將細胞重新置懸，將10 μLAnnexin V-FITC和5 μL的PI加入試管內，10 min內上機（美國Thermo Fisher公司）檢測細胞凋亡狀況。

1.2.5 免疫熒光檢測 收集各組細胞，用中性甲醛溶液固定10 min后，使用TBS清洗2次后，滴加封閉緩沖液在37 ℃的濕盒中進行30 min的孵育；使用0.2% Triton X-100在室溫的條件下進行5 min的通透，使用非特異性抗原進行20 min的封閉，加入Nrf2抗體在37 ℃的條件下行2 h的孵育，使用PBS進行清洗，在37 ℃的條件下使用Goat Anti-Mouse IgG H＆L（Alexa Fluor?647）二抗進行30 min的孵育，使用PBS清洗干凈后，滴加DAPI避光5 min的孵育，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白的表達 收集各組細胞，使用RIPA試劑提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白量，使用10% SDS-PAGE進行電泳，電泳完成后，將蛋白轉移至PVDF膜上，使用5%的脫脂奶粉溶液進行1 h的封閉。分別滴加SLC7A44、GPx4、PIK3CA、p-AKT、AKT、GSK-3β、Nrf2和GAPDH一抗在4 ℃環境中孵育過夜，次日，用流水清洗干凈后，滴加辣根過氧化酶標記二抗（1:200）在37 ℃的環境下行1 h的孵育。再加入化學發光試劑避光顯影，曝光，以GAPDH為內參，使用Image J圖像分析軟件進行蛋白條帶灰度值分析。

1.2.7 雙熒光素酶靶標實驗 構建PIK3CA野生型熒光素酶報告基因載體（PIK3CA-wt），同時構建PI3ACA突變型熒光素酶報告基因載體（PIK3CAmut），此過程由南京凱基生物科技有限公司完成。將大鼠神經元細胞（1×105個/孔）接種至6孔板中，將PIK3CA-mut與miR-152-3p mimics、PIK3CA-mut與miR-NC、PIK3CA-wt與miR-152-3p mimics、PIK3CAwt與miR-NC使用LipofectamineTM2000轉染入細胞。轉染完成6 h后。根據雙熒光素酶靶標實驗試劑盒操作步驟進行檢測，以熒光強度表示細胞熒光酶活性。

1.3 統計學處理方法

采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-152-3p靶向調控PIK3CA及相關基因表達

生物信息學軟件預測（圖1A）結果顯示，miR-152-3p可靶向性調控PIK3CA，與共轉染PIK3CA-wt與miR-NC的細胞相比，共轉染PIK3CA-wt與miR-152-3p的細胞熒光素酶活性受到顯著抑制（P＜0.01）；與共轉染PIK3CA-mut與miR-NC的細胞相比，共轉染PIK3CA-mut與miR-152-3p的細胞熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1B。RT-qPCR檢測結果顯示，與miR-NC組比，miR-mimics中miR-152-3p基因表達水平顯著升高，而PIK3CA基因表達水平顯著降低（P＜0.01，圖1C、圖1D）。

圖1 miR-152-3p靶向調控PIK3CA及相關基因表達

2.2 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導大鼠神經元細胞凋亡的影響

與對照組（5.16%±2.51%）比，模型組細胞凋亡率（25.84%±4.76%）明顯增高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組細胞凋亡率（6.33%±3.45%）顯著降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導大鼠神經元細胞凋亡的影響

2.3 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導大鼠神經元細胞相關基因表達的影響

RT-qPCR結果顯示，與對照組比，模型組miR-152-3p和GSK-3β基因表達水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2 基因表達水平顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組miR-152-3p和GSK-3β基因表達水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2基因表達水平顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導大鼠神經元細胞相關基因表達的影響（±s）

2.4 miR-152-3p inhibitor對鐵死亡相關蛋白的影響

Western blot結果顯示，與對照組比，模型組SLC7A11和GPx4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），與模型組比，miR-152-3p inhibitor組SLC7A11和GPx4蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），見圖3。

圖3 miR-152-3p inhibitor對鐵死亡相關蛋白的影響

2.5 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導大鼠神經元細胞相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與對照組比，模型組GSK-3β蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2 蛋白表達水平及p-AKT/AKT顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，與模型組相比，miR-152-3p inhibitor組GSK-3β蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2蛋白表達水平及p-AKT/AKT顯著升高（P＜0.01）。見圖4和表3。

圖4 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導大鼠神經元細胞相關蛋白表達的影響

表3 miR-152-3p對PIK3CA、GSK-3β和Nrf2蛋白水平以及p-AKT/AKT的影響（±s）

2.6 miR-152-3p對Nrf2入核的影響

與正常組Nrf2蛋白入核率（90.51%±4.32%）相比，模型組Nrf2蛋白入核率（10.43%±3.19%）顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，與模型組相比，miR-152-3p inhibitor組Nrf2蛋白入核率（84.79%±6.51%）顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 miR-152-3p對Nrf2入核的影響（×400）

2.7 PIK3CA抑制劑對miR-152-3p inhibitor改善細胞凋亡的影響

與模型組（25.76%±4.51%）相比，miR-152-3p inhibitor組細胞凋亡率（5.19%±3.18%）顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞并使用PIK3CA抑制劑干預后，與miR-152-3p inhibitor組相比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組細胞凋亡率（20.33%±4.72%）顯著增加（P＜0.01）。見圖6。

圖6 PIK3CA抑制劑對miR-152-3p inhibitor改善細胞凋亡的影響

2.8 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關基因表達中的作用

RT-qPCR檢測結果顯示，與模型組相比，miR-152-3p inhibitor和miR-152-3p+PIK3CA抑制劑組miR-152-3p基因表達水平顯著降低（P＜0.01），miR-152-3p inhibitor組GSK-3β基因表達水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2 基因表達水平顯著升高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后使用PIK3CA抑制劑干預后，與miR-152-3p inhbitor組相比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組GSK-3β基因表達水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2 基因表達水平顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關基因表達中的作用（±s）

2.9 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關蛋白表達中的作用

Western blot結果顯示，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組GSK3β蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2 蛋白表達水平以及p-AKT/AKT比率顯著升高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞并給予PIK3CA抑制劑處理后，與miR-152-3p inhibitor組相比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組GSK3β蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2蛋白表達水平以及p-AKT/AKT比率顯著降低（P＜0.01）。見圖7和表5。

圖7 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關蛋白表達中的作用

表5 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關蛋白表達中的作用（±s）

2.10 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響鐵死亡相關蛋白中的作用

Western blot 檢測結果顯示，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組SLC7A11 和GPx4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉染入細胞并給予PIK3CA抑制劑處理后，與miR-152-3p inhibitor組比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組SLC7A11和GPx4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖8。

圖8 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響鐵死亡相關蛋白中的作用

2.11 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響Nrf2入核中的作用

與模型組Nrf2 蛋白入核率（10.41%±3.92%）比，miR-152-3p inhibitor組Nrf2 蛋白入核率（92.43%±7.19%）顯著升高（P＜0.01）；將miR-152.3p inhibitor轉染入細胞并給予PIK3CA抑制劑干預后，與miR-152-3p inhibitor組比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組Nrf2 蛋白入核率（12.69%±5.58%）顯著降低（P＜0.01），見圖9。

圖9 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響Nrf2入核中的作用（×400）

3 討論

ICH是腦卒中的主要亞型，占10%～15%，具有高病死率和致殘率[17]。全世界每年約有280萬人死于ICH，只有25%的ICH幸存者能夠在發病6個月后獨立生活[18]。既往研究大多聚焦于血腫的清除[19]，對于ICH誘導的繼發性腦損傷研究較少。鐵死亡是近年來發現的一種不同于細胞自噬、凋亡和焦亡的新型細胞死亡方式，表現出線粒體皺縮、脂質過氧化增加，且鐵離子螯合劑可以抑制這一過程，而傳統的細胞凋亡、自噬和焦亡抑制劑均不能抑制其發生，說明該過程是鐵離子依賴的過程。鐵死亡的實質是細胞內脂質氧化物代謝障礙，在鐵離子催化作用下代謝發生異常，當細胞抗氧化能力減弱，脂質活性氧堆積，使細胞內氧化還原失衡，誘導細胞死亡[20]。臨床及實驗研究均證實，ICH急性期及恢復期在病灶周圍腦組織持續存在的鐵沉積現象是由于ICH后伴隨血腫的融解及紅細胞的破壞，腦組織間隙大量血紅蛋白（hemoglobin, HGB）聚集，HGB進一步裂解為含鐵血紅素和珠蛋白，再通過血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）的作用進而釋放大量活性亞鐵離子。鐵作為血腫降解的主要活性產物，可通過多種途徑導致繼發性腦損傷[21]。本次研究使用oxyHb誘導大鼠神經元細胞構建ICH體外細胞模型，結果顯示，模型組細胞凋亡率顯著增高的同時，Nrf2蛋白表達水平顯著降低，而在使用miR-152-3p inhibitor轉染入細胞后，oxyHb誘導大鼠神經元細胞損傷得到顯著改善，并伴隨Nrf2蛋白表達升高，Nrf2蛋白入核量增多。

相關研究顯示激活Nrf2/ARE信號通路編碼大量抗氧化蛋白，通過抗鐵死亡作用減輕急性脊髓損 傷[22]。此外，膜鐵轉運蛋白是調控鐵向胞外轉運的主要蛋白，維持細胞內鐵的穩態，防止鐵過載誘發細胞的氧化損傷，其也受Nrf2 的調控。正常生理條件下，Nrf2 轉錄因子在細胞質中與接頭蛋白Keap1結合，不斷被泛素化蛋白酶體途徑降解，無法進入細胞核發揮轉錄活性[23]。當受到氧化應激時，Keap1分子構象發生改變，抑制泛素連接酶活性，Nrf2與Keap1解離而被活化。活化的Nrf2進入細胞核與抗氧化反應元件（antioxidant reaction element, ARE）結合，啟動下游II相解毒酶、抗氧化蛋白等基因的表達[24]。此外，越來越多的證據表明，GSK-3β介導的非Keap1依賴的調節通路在Nrf2介導的鐵死亡中發揮重要作用。PI3K/AKT信號通路能夠負性調控GSK-3β活性，這歸因于GSK-3β可以被磷酸化的AKT激活而失去活性，而磷酸化的GSK-3β可以促進Nrf2的表達及核轉錄[25-27]。研究表明活化GSK-3β可有效保護阿茲海默癥導致的神經元損傷[26]。 因此，AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路應該是神經元鐵死亡的重要機制之一。GPx4和SLC7A11蛋白表達降低是導致鐵死亡的主要因素[28-29]。本研究結果表明，與對照組神經元細胞相比，模型組中神經元細胞中GSK-3β/Nrf2信號通路蛋白表達水平顯著降低，證明GSK-3β/Nrf2 在神經元損傷中具有保護作用，同時GPx4和SLC7A11蛋白表達水平顯著降低，表明模型組神經元細胞鐵死亡增強，將miR-152-3p抑制表達后，可有效地活化AKT進而抑制GSK-3β的活化，使得Nrf2蛋白表達增加的同時，Nrf2蛋白入核量也得到增加，此機制可能是miR-152-3p inhibitor改善ICH導致的神經元細胞鐵死亡的作用機制。

TargetScan數據庫表明miR-152-3p可靶向性調控PIK3CA，PIK3CA活化能夠誘導PI3Ks的催化活性增強，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3 位羥基，產生第二信使肌醇類物質如PIP3，PIP3可促使AKT轉移到細胞膜上并被PDK1/PDK2活化，從而激活PI3K/AKT信號通路[21-22]。因此，PIK3CA是AKT的上游因子之一[30-32]。在本研究中，使用PIK3CA抑制 后，miR-152-3p inhibitor改善ICH導致的鐵死亡作用受到抑制。

綜上所述，依據本研究結果，我們推斷miR-152-3p可能通過AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路加劇ICH誘導的神經元細胞鐵死亡，最終加劇ICH導致的神經元細胞損傷。