α-突觸核蛋白在紅核中異常沉積對運動和痛覺的影響

宋越，蘇穎，何艷，陳江帆，郭衛

1.溫州醫科大學 眼視光學院（生物醫學工程學院） 眼視光學和視覺科學國家重點實驗室，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 麻醉與圍術期醫學科 小兒麻醉學教育部重點實驗室 浙江省精準麻醉學重點實驗室，浙江 溫州 325027

帕金森病（Parkinson’ disease, PD）是第二大常見的神經退行性疾病，其病理改變主要是黑質-紋狀體通路上的多巴胺能神經元變性壞死，而殘存的多巴胺能神經元內路易小體聚集。該小體主要成分是α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-Syn）。BRAAK等[1]認為PD的病理改變并不局限于黑質區，而是起始于延髓，并按照延髓-中腦-大腦皮質（包括嗅球）的順序向上呈漸進性發展。先前的研究表明隨著時間推移，α-Syn可擴散到除黑質外的廣大中腦區域[2]。

近年的研究發現中腦多個核團在運動狀態（如啟動、維持、終止）的切換過程中發揮重要作用[3-4]，特別是位于中腦腹側的紅核（red nucleus, RN）是調節運動和進行運動-感覺整合的重要腦區，其功能失調可能與PD的發生有關[5-6]。利用磁共振研究發現，PD患者中RN體積明顯增大[7]，加之RN中富含鐵，推測PD患者RN中可能存在著鐵的過量聚集[8]。通過對PD患者RN中鐵進行檢測和定量分析，得出的數據與上述推測完全吻合，并且發現在PD的早期階段，只有黑質致密部存在鐵的聚集，而在晚期PD階段，黑質網狀部、蒼白球和RN均受到影響[9]，表明鐵儲存和代謝改變后的氧化應激是PD神經元細胞死亡的重要病因之一[8]。除鐵過量聚集外，RN中α-Syn異常沉積是否與PD運動和感覺異常存在關聯，迄今鮮見報道。

前期我們研究了α-Syn異常沉積對運動程序性學習[10]和運動技能學習[11]的影響。本研究將利用病毒過表達α-Syn這一方法[12]研究RN處α-Syn異常沉積對小鼠運動和感覺的影響，以期對探究PD的行為學表現及尋找PD的治療手段提供科學價值和臨床意義[5]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康C57BL/6J小鼠，8～10周齡，體質量20～26 g，購于上海杰斯捷實驗動物公司，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。所有小鼠安置在溫州醫科大學實驗動物中心飼養，飼養溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為40%±10%，室內光照維持12 h/12 h日夜交替，自由飲食，飼養1周熟悉環境后用于實驗。本研究所采用動物實驗方案通過溫州醫科大學實驗動物倫理委員會審核（倫理編號：xmsq2021-0012）。

1.1.2 主要試劑 AAV-2/9-CMV-bGI-SNCA-IRESEGFP-WPRE（S1108-9，上海泰兒圖生物科技有限公司）；rAAV-hSyn-EGFP-WPRE-hGH polyA（PT-0241，武漢樞密腦科學技術有限公司）；Anti-磷酸化α-Syn（phosphorylated α-Syn, p-Syn）抗體（015-25191，日本WAKO公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）（C1090，上海碧云天生物技術有限公司）； Fluoromount-G熒光封片劑（05-0100-01，美國Southern Biotech公司）；驢抗鼠IgG抗體（A31570，美國Invitrogen公司）；DAPI染色液（C1005，上海碧云天生物技術有限公司）。

1.1.3 主要儀器 曠場實驗箱（廈門艾德生物醫藥科技有限公司）；腦立體定位儀（美國KOPF公司）；微量注射泵（美國KD公司）；微量注射器（美國 Hamilton公司）；轉棒測試儀（意大利Ugo Basile Srl公司）；小鼠肌力測量儀（上海雅珩信息科技有限公司）；336爪/尾刺激痛覺測試儀（美國Life Science公司）；VonFrey針刺觸覺測量套件（美國Life Science公司）；正置熒光顯微鏡Leica DM 6B（德國萊卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 17 只C57BL/6J小鼠隨機分為2 組：對照組（n=10）注射對照病毒rAAV-hSyn-EGFP-WPREhGH polyA，只表達綠色熒光蛋白，不表達α-Syn；α-Syn病毒造模組即實驗組（n=7），注射AAV-2/9-CMV-bGI-SNCA-IRES-EGFP-WPRE，表達綠色熒光蛋白和α-Syn。

1.2.2 小鼠腦立體定位病毒注射 將小鼠按照每10 g腹腔注射阿佛丁溶液0.2 mL進行麻醉后，用腦立體定位儀夾持器固定小鼠。對小鼠頭部皮膚進行消毒后，充分暴露小鼠的前囟和后囟點。RN注射坐標為：前囟后：-3.4 mm；旁開：±0.75 mm；深度：-3.5 mm。病毒注射（20 nL/min）結束后繼續留針 5 min，縫合傷口。小鼠置于動物用電熱毯上復蘇，蘇醒之后將其移至鼠籠飼養。

1.2.3 曠場實驗 參考既往操作[13]，曠場實驗在規格為40 cm×40 cm×40 cm的隔音試驗箱中進行。利用EthoVision XT分析系統實時追蹤記錄小鼠10 min內的運動情況，前5 min作為環境適應，后5 min用于評估運動狀態。瞬時運動速度大于 2 cm/s為運動狀態，瞬時運動速度小于1.75 cm/s為靜止狀態，根據小鼠每秒的運動速度來計算小鼠的總運動距離、運動時間、不動時間和在運動時間內的平均運動速度等參數。

1.2.4 握力測試 參考既往操作[14]，將小鼠放在小鼠肌力測量儀的網格上，其用前肢或四肢牢牢抓住測試網格后猛拉小鼠尾巴，記錄下小鼠松開網格的峰值力度。每只小鼠測試10次，計算握力平均值和握力平均值/體質量。

1.2.5 轉棒實驗 參考既往操作[14]，在對小鼠進行連續3 d的訓練（5 min/次，3次/d）后，在測試當天轉棒在300 s內從5 r/min勻加速到40 r/min，記錄小鼠從轉棒上掉落的潛伏期。分析連續3次試驗中的平均掉落時間。

1.2.6 鐵絲懸掛實驗 參考我們既往的操作[14]，將小鼠放在40 cm×40 cm的鐵絲網上，鐵絲網蓋在40 cm×40 cm×40 cm的箱體上。小鼠四肢牢牢抓住鐵絲網后，慢慢地將鐵絲網上下顛倒，同時記錄小鼠從鐵絲網上掉下來的潛伏期（上限15 min）。連續測試2 d，并取均值進行比較。

1.2.7 爬桿測試 爬桿設備由一根直徑為10 mm、長50 cm的金屬棒纏繞著繃帶制作而成，參考我們既往的操作[14]，在訓練期間將小鼠頭部朝上放在桿子的頂部（距離頂端7.5 cm），小鼠爬到桿子頂端，然后轉身爬到桿子底部，每天3次，連續2 d。在測試當天記錄小鼠的轉身時間和轉身到達底部的總時間（上限120 s），測試3次，每次間隔至少1 h，計算3次測試的平均值。

1.2.8 痛覺閾值測試 機械性縮足閾值 （mechanical withdrawal threshold, MWT）：參考既往操作[15]，將小鼠置于底部為金屬絲網格架（0.8 cm×0.8 cm）的亞克力透明罩內（18 cm× 25 cm×18 cm），利用von Frey細絲（0.08～2.0 g）垂直觸碰小鼠的右后爪腳掌趾根區域，觀察小鼠的行為反應（如抬起、抖足或舔舐后爪）。若小鼠無明顯反應，間隔5 min后使用刺激力度大一級的von Frey細絲進行刺激，直到小鼠出現明顯的反應；若小鼠出現反應，則用刺激力度低一級的細絲進行刺激；重復以上步驟3次。記錄小鼠的反應情況，測試的平均值記為MWT。熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency, TWL）：參考我們既往的操 作[15]，將小鼠放置在底部為導熱透明玻璃板的前述透明罩中，使用336爪/尾刺激痛覺測試儀的光源照射小鼠相同的右后爪腳掌趾根區域。儀器參數設定：加熱光源在空閑時激光發射強度為10%，測試工作時發射強度為60%，切斷時間30 s，觸發溫度30 ℃。當動物縮爪或者啃咬腳趾逃避熱刺激時關閉光源，儀器自動記錄反應時間。重復以上步驟測量3次，計算平均時間記為TWL。

1.2.9 小鼠腦組織準備 麻醉小鼠后暴露心臟，依次灌流0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛。將腦組織分離后放入4%多聚甲醛液體中固定6～8 h，然后轉移浸泡于20%蔗糖組織脫水液中進行脫水，直至腦沉到底部。根據實驗安排，冰凍切片（30 μm）后進行染色或保存備用。

1.2.10 組織免疫熒光染色 挑選腦片，在磷酸鈉鹽緩沖液（0.01 mol/L PBS，pH=7.2）中漂洗10 min， 重復3次。將腦片浸入封閉液中破膜封閉0.5 h，然后加入鼠源Anti-pSyn抗體（1:2 000）在室溫下慢搖孵育過夜。一抗孵育結束后，將腦片放入PBS中漂洗3次。洗滌后加入驢抗鼠二抗（1:1 000）避光孵育2 h。再次漂洗3次后，將腦片貼附在載玻片上，并滴加DAPI顯色液染色5～10 min后，滴加抗淬滅劑封片，在Leica DM 6B正置熒光顯微鏡下仔細觀察p-Syn形態并拍攝RN部位，使用ImageJ計數紅色熒光標記神經元數目。

1.2.11 TUNEL染色 將TUNEL染色試劑盒里的TdT酶（5 μL）和Biotin-dUTP（45 μL）配制成50 μL的凋亡檢測液。將腦片黏附于載玻片上，使用0.4% PBST通透5 min后使用PBS浸泡漂洗3 次，再將凋亡檢測液滴加在腦片上，在37 ℃烘箱避光孵育 60 min；滴加DAPI顯色液染色5～10 min后，滴加抗淬滅劑封片，在Leica DM 6B正置熒光顯微鏡下拍攝RN部位的凋亡神經元，使用ImageJ計數紅色熒光標記神經元數目。

1.3 統計學處理方法

使用ImageJ軟件進行定量分析，計算每只動物RN區域15張腦片的合計值。采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析。計量資料采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 α-Syn在RN處異常沉積可損毀神經元

在實驗組小鼠雙側RN注射可表達α-Syn的病毒，在對照組小鼠RN注射對照病毒（圖1A）。病毒表達4周后（圖1B），將小鼠進行灌流取材并進行冰凍切片。p-Syn免疫熒光染色發現，相較于對照組（圖1C），實驗組中p-Syn陽性數目顯著增加（圖1D），差異有統計學意義（P＜0.001，圖1E）。這表明α-Syn在RN處出現異常沉積。而TUNEL染色發現，在RN區域，相較于對照組（圖1F），實驗組中陽性神經元顯著增加（圖1G），差異有統計學意義（P＜0.001，圖1H）。

圖1 RN區域注射α-Syn病毒后，p-Syn異常沉積并導致神經元凋亡

2.2 α-Syn在RN處異常沉積可以促進小鼠的自主活動

在病毒表達4周后，曠場實驗結果表明，與對照組相比，實驗組小鼠在曠場中的總運動距離增加和運動（瞬時運動速度大于2 cm/s）時間明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.001）；實驗組小鼠在曠場中的不動時間（瞬時運動速度小于1.75 cm/s）明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.001）；而兩組小鼠的平均運動速度差異無統計學意義（P＞0.05）；見圖2。

圖2 2組小鼠在曠場中的運動情況比較

2.3 α-Syn在RN處異常沉積降低小鼠的運動協調能力，但增強四肢肌肉力量

在病毒表達4周后，本研究通過多種實驗評估小鼠的運動控制能力和神經肌肉力量（圖3A）。轉棒實驗結果顯示，與對照組小鼠相比，實驗組小鼠掉落潛伏期縮短，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3B）；爬桿實驗結果顯示，與對照組小鼠相比，實驗組小鼠在爬桿實驗中轉身時間不變，但轉身到達底部的時間增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3C；鐵絲懸掛實驗結果顯示，掉落潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05，圖3D）；握力測試結果顯示，實驗組小鼠前肢肌力增加不明顯（P＞0.05，圖3E）；但四肢肌力增強，差異有統計學意義（P＜0.05），體質量歸一化的四肢肌力也增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3F。

圖3 2組小鼠的運動協調能力、運動控制和神經肌肉力量情況比較

2.4 α-Syn在RN處異常沉積提高小鼠對熱痛刺激的敏感性

病毒表達4周后檢測兩組小鼠右后足掌趾根部的MWT和TWL（圖4A）。實驗結果顯示，雖然兩組小鼠對機械性刺激的MWT差異無統計學意義（P＞0.05，圖4B），但與對照組相比，實驗組小鼠對熱刺激的TWL顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05，圖4C）。

圖4 2組小鼠的MWT和TWL比較

3 討論

正常小鼠具有攀爬活性，這需要適當的握力和運動協調性，本研究的轉棒實驗結果表明小鼠的運動協調性出現明顯障礙，這種現象在爬桿實驗中得到進一步確認—實驗組小鼠轉身到達底部的時間增加，小鼠出現運動遲緩的癥狀。鐵絲懸掛實驗可以評估PD小鼠模型的握力，握力測試可以檢測小鼠的神經肌肉力量。正常的成年小鼠會伸展四肢，在基底神經節功能障礙中可以觀察到由脊髓引起的異常屈曲反應，導致小鼠四肢屈曲[16]。本研究發現RN處α-Syn異常沉積導致四肢肌肉力量明顯增強，可能是由于小鼠的后爪過度屈曲導致的，這可能與PD患者的病理性抓握反射有關[17]。Thy1-α-Syn（L61）小鼠（L61 tg小鼠）和（Thy-1）-h[A30P]α-Syn（A30P）小鼠（A30P tg小鼠）均是SNCA轉基因小鼠，廣泛用于PD病理研究[16]。研究發現7月齡的L61 tg小鼠的運動時間、總運動距離和運動速度均有增加[18]，但14月齡的L61 tg小鼠在曠場中運動則減少[19]。而12月齡的A30P tg小鼠在曠場中的運動顯著增加，但4月齡的小鼠則未有運動異常[20]。這些觀察結果的差異提示α-Syn過表達小鼠的行為異常可能具有年齡相關性。α-Syn在RN病理性沉積促進小鼠在曠場中的運動也可能是因為處于病程的早期階段，這需要后續更長時間的觀察。

疼痛是多數PD患者主訴的非運動癥狀之一，表型復雜且病因多樣[21]。伴隨疼痛癥狀的PD患者中，其中三分之二是慢性疼痛。PD中受神經退行性影響的多個區域（如邊緣結構、丘腦、中腦導水管周圍灰質和脊髓）的功能異常可導致中樞傷害性疼痛。但對PD中疼痛的發生機制還缺乏深入了解。早期的研究發現刺激嚙齒動物的RN會產生持久而強烈的鎮痛作用[22]，這可能是通過RN與鎮痛感受系統（如中腦導水管周圍灰質、中縫大核和外側網狀核）的稀疏解剖連接來介導的[23]。最近的研究[24]表明RN可通過分泌炎性因子雙向調節神經性疼痛，而在RN注射不同劑量的抗IL-6抗體可劑量依賴性地增加大鼠的MWT，并減輕坐骨神經分支損傷引起的異常機械性疼痛。進一步的研究發現RN IL-33參與了神經性疼痛的早期發展，并通過激活NF-κB、ERK、p38 MAPK和JAK2/STAT3信號通路產生鎮痛作用[25]。我們的研究發現RN處α-Syn異常沉積可敏化熱痛刺激，這也為PD神經性疼痛的治療提供了潛在的治療靶點。

RN內存在興奮性谷氨酸能神經元和抑制性γ-氨基丁酸能神經元混雜分布[26]，這限制了對不同類型神經元調控運動的精細研究。新近的研究發現，光遺傳激活RN谷氨酸能神經元或者刺激RN至腹側被蓋區谷氨酸通路可以產生運動獎賞；反之，抑制該通路則減弱運動獎賞[27]。應激后大鼠的RN谷氨酸能神經元活性下降；抑制RN谷氨酸能神經元對大鼠運動能力無影響，但減少大鼠在中心區的停留時間；激活RN谷氨酸能神經元對大鼠運動能力無影響，但會增加大鼠在中心區的停留時間[28]。這些研究提示RN內不同類型的神經元可能介導不同的功能。

綜上所述，本研究將表達α-Syn的病毒特異性注射到RN誘導產生p-Syn病理性沉積，發現損毀該區域神經元可導致小鼠運動和感覺異常。這主要表現為：促進小鼠的自主運動，降低小鼠的平衡協調能力和運動控制功能，增強小鼠的四肢肌肉力量，對機械性刺激耐受力較強，對熱痛刺激較敏感。這些結果為認識RN在PD發生中的作用提供了新的認識，也有助于為PD異常行為提供潛在的干預策略。