藏紅花素對脊髓損傷大鼠運動功能、炎癥的影響及機制研究*

矯秀環,趙桂欣,徐 莉,馬建林

青島市城陽區人民醫院:1.藥學部;2.骨科,山東青島 266000

脊髓損傷會誘發患者運動功能障礙,表現為損傷平面下感覺消失,會出現慢性、頑固性疼痛[1]。研究顯示,脊髓損傷患者預后一般較差,大部分患者術后無法完全康復且感覺功能、運動功能均會出現一定損傷[2-3]。脊髓損傷后會使得炎性因子活性增強,伴隨著劇烈的炎癥反應[4]。因此減輕脊髓損傷患者炎癥反應,改善其運動功能,對于改善患者預后極為重要。藏紅花素是中藥藏紅花的主要有效成分,具有抗炎、抗氧化應激等方面的作用[5]。研究表明,藏紅花素可減輕卵清蛋白誘導的小鼠肺組織炎性損傷[6]。Ras同源基因家族成員A(RhoA)在多種疾病的發生發展過程中起著重要作用,Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)是其下游信號因子[7]。RhoA/ROCK是在脊髓變性和再生過程中起重要作用的信號通路,同時也能調節炎癥反應,以及炎癥細胞的侵襲和浸潤,有研究發現,在脊髓損傷后,抑制RhoA/ROCK通路活性可顯著減少脊髓組織細胞凋亡[8]。但藏紅花素是否對脊髓損傷有治療作用鮮見報道。故本研究擬基于RhoA/ROCK信號通路,探究藏紅花素對脊髓損傷大鼠運動功能、炎癥的影響,以期為脊髓損傷開發新的治療方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠,10～11周齡,體重326～351 g,購自湖北天勤生物科技有限公司,動物生產許可證號:SCXK(鄂)2020-0011。大鼠飼養環境為溫度(25±1)℃,相對濕度54%±6%,12 h明/暗循環。期間自由飲水進食。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.1.2主要藥物與試劑 藏紅花素(批號:DL15850,原料藥,純度≥98.59%,溶于生理鹽水制成質量濃度分別為2.5、5 mg/mL的溶液)、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)染色試劑盒(批號:DL25990)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號:DL45822)、白細胞介素(IL)-1β(批號:DL58292)、IL-6(批號:DL24691)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、蛋白裂解液(批號:DL52902)均購自廣州東林生物科技有限公司;注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(批號:20220725,溶于生理鹽水制成質量濃度為3 mg/mL的溶液)購自天津金耀藥業有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號:YQ49503)、Trizol試劑(批號:YQ24816)、逆轉錄試劑盒(批號:YQ73927)、PCR試劑盒(批號:YQ63931)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號:YQ25600)、化學發光試劑(批號:YQ42955)均購自南京有晴生物科技有限公司;鼠源RhoA(批號:SM20454)、ROCK1(批號:SM52144)、ROCK2(批號:SM27554)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號:SM31056)一抗、羊抗鼠二抗(批號:SM54200)均購自廣州蘇瑪生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 顯微鏡(型號CX41)、酶標儀(型號PR4100)、熒光定量PCR儀(型號CFX-96)、凝膠成像系統(型號OmegaLum C)均購自寧波重鼎生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1脊髓損傷大鼠模型的建立及分組給藥 構建脊髓損傷大鼠模型[9]:麻醉大鼠,俯臥位固定大鼠于操作臺上,背部備皮,去除T9～T10椎板,10 g的砝碼從6 cm高度落下撞擊T9～T10椎板去除處,若大鼠出現搖尾反射、雙后肢及身體回縮撲動后雙后肢癱瘓則表示大鼠脊髓損傷模型構建成功[10]。將建模成功的48只大鼠隨機分為模型組、藏紅花素低(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量組[11]、甲潑尼龍琥珀酸鈉(30 mg/kg)組[12],每組12只;另取12只健康大鼠作為假手術組(假手術組大鼠僅去除T9～T10椎板,不進行脊髓損傷造模)。藏紅花素低、高劑量組大鼠分別給予25、50 mg/kg藏紅花素腹腔注射給藥[11](藏紅花素溶于生理鹽水制成濃度為2.5、5 mg/mL的溶液,注射體積10 mL/kg);甲潑尼龍琥珀酸鈉組大鼠給予30 mg/kg甲潑尼龍琥珀酸鈉腹腔注射給藥[12](甲潑尼龍琥珀酸鈉溶于生理鹽水制成濃度為3 mg/mL的溶液,注射體積10 mL/kg);假手術組、模型組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。各組給藥每天1次,連續14 d,其間無大鼠死亡。

1.2.2大鼠運動功能評估 于建模結束后(給藥前)和末次給藥結束后24 h,按巴索-貝蒂-布雷斯納漢(BBB)評分法[10]評估大鼠運動功能:由2名實驗觀察者進行盲檢并評分(若兩名實驗觀察者評分不一致則協商后確定),BBB量表總分21分,0分為無任何肢體功能,21分為正常運動功能,評分越低代表大鼠運動功能受損越嚴重。

1.2.3大鼠脊髓組織病理觀察及脊髓組織細胞凋亡率檢測 評分結束后,處死大鼠,收集大鼠撞擊處脊髓組織,取部分脊髓組織置于-70 ℃冰箱中保存;其余脊髓組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后,制成5 μm切片,取切片按照HE及TUNEL染色試劑盒進行染色、脫水、透明后封片。觀察各組大鼠脊髓組織病理改變情況,隨機選取6個視野計算脊髓組織細胞凋亡率,細胞凋亡率=TUNEL陽性染色細胞(陽性細胞被染為棕黃色)數目/細胞總數目×100%。

1.2.4大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的檢測 取凍存的大鼠脊髓組織樣本,研磨勻漿,4 ℃下6 400 r/min離心21 min,收集上清液,ELISA法檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.5大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2信使RNA(mRNA)水平的測定 取凍存的大鼠脊髓組織樣本,充分研磨,Trizol試劑提取脊髓組織總RNA,逆轉錄為cDNA,熒光定量PCR法檢測脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平,以GAPDH為內參。反應體系共30 μL:cDNA 2 μL,緩沖液5 μL,dNTPs 4 μL,正、反向引物各1 μL、DNA聚合酶1 μL、ddH2O 16 μL。擴增條件:94 ℃ 12 min,94 ℃ 15 s、62 ℃ 21 s、72 ℃ 23 s,共40個循環,72 ℃延伸10 min。所用引物由廣州東林生物科技有限公司設計合成。mRNA水平采用相對定量法(2-ΔΔCt法)計算,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6蛋白質印跡法檢測大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平 取凍存的大鼠脊髓組織樣本,充分研磨勻漿,蛋白裂解液裂解,BCA法定量總蛋白,取適量蛋白電泳后轉膜,5%脫脂牛奶封膜2 h,加入稀釋好的鼠源RhoA(1∶600)、ROCK1(1∶800)、ROCK2(1∶700)、GAPDH(1∶1 000)一抗,4 ℃下孵育過夜,加入羊抗鼠二抗(1∶1 400),室溫孵育2 h,化學發光試劑顯影, Image J軟件分析蛋白質條帶,以GAPDH為內參,計算RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平。

2 結 果

2.1藏紅花素對脊髓損傷大鼠BBB評分的影響 建模結束后(給藥前),與假手術組相比,模型組、藏紅花素低、高劑量組、甲潑尼龍琥珀酸鈉組大鼠BBB評分顯著降低(P<0.05);但模型組、藏紅花素低、高劑量組、甲潑尼龍琥珀酸鈉組大鼠BBB評分兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。末次給藥結束后24 h,與假手術組相比,模型組大鼠BBB評分顯著降低(P<0.05);與模型組相比,藏紅花素低、高劑量組大鼠BBB評分依次升高(P<0.05);尼龍琥珀酸鈉組和藏紅花素高劑量組大鼠BBB評分差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BBB評分的比較分)

2.2藏紅花素對脊髓損傷大鼠脊髓組織病理學變化的影響 假手術組大鼠脊髓組織結構正常,無明顯變化;模型組大鼠脊髓組織出現壞死灶,伴隨嗜伊紅色素顆粒生成,可見較多膠質瘢痕及空洞;藏紅花素低、高劑量組大鼠脊髓組織病理損傷程度依次減輕;甲潑尼龍琥珀酸鈉組和藏紅花素高劑量組大鼠脊髓組織病理變化程度相似。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理變化圖(HE染色,×200)

2.3藏紅花素對脊髓損傷大鼠脊髓組織細胞凋亡率的影響 假手術組、模型組、藏紅花素低劑量組、藏紅花素高劑量組、甲潑尼龍琥珀酸鈉組細胞凋亡率分別為1.29%±0.19%、42.74%±5.96%、21.54%±3.12%、11.17%±2.14%、10.70%±2.12%;與假手術組相比,模型組大鼠脊髓組織細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組相比,藏紅花素低、高劑量組大鼠脊髓組織細胞凋亡率依次降低(P<0.05);甲潑尼龍琥珀酸鈉組和藏紅花素高劑量組大鼠脊髓組織細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠脊髓組織細胞凋亡圖(TUNEL染色,×200)

2.4藏紅花素對脊髓損傷大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與假手術組相比,模型組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,藏紅花素低、高劑量組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次降低(P<0.05);甲潑尼龍琥珀酸鈉組和藏紅花素高劑量組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.5藏紅花素對脊髓損傷大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平的影響 與假手術組相比,模型組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,藏紅花素低、高劑量組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平依次降低(P<0.05);甲潑尼龍琥珀酸鈉組和藏紅花素高劑量組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平比較

2.6藏紅花素對脊髓損傷大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平的影響 與假手術組相比,模型組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,藏紅花素低、高劑量組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平依次降低(P<0.05);甲潑尼龍琥珀酸鈉組和藏紅花素高劑量組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表6。

注:A為假手術組;B為模型組;C為藏紅花素低劑量組;D為藏紅花素高劑量組;E為甲潑尼龍琥珀酸鈉組。

表6 各組大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白水平比較

3 討 論

脊髓損傷屬于中樞神經系統損傷,具有不可逆性,目前臨床上尚無治療脊髓損傷的有效方法[13]。脊髓損傷造成的神經功能障礙對患者的生活質量產生較大影響[14]。BBB評分是一種神經運動功能評分,常用于脊髓損傷大鼠運動恢復過程的評價,能夠反映脊髓損傷的病情嚴重程度[15]。發生脊髓損傷時,脊髓組織中的小膠質細胞、巨噬細胞會激活并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子,促進炎癥反應,加重脊髓的繼發性損傷,所以,減輕炎癥反應可能有益于治療脊髓損傷[16]。此外,在脊髓損傷期間還會存在脊髓空腔病變、脊髓神經元細胞凋亡等情況,從而阻礙中樞神經系統正常功能及修復[17]。本研究構建脊髓損傷大鼠模型,結果發現假手術組大鼠脊髓組織結構正常,無明顯變化;模型組大鼠脊髓組織出現壞死灶,伴隨嗜伊紅色素顆粒生成,可見較多膠質瘢痕及空洞,BBB評分顯著降低,脊髓組織細胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,提示脊髓損傷大鼠運動功能受損,脊髓組織發生炎癥反應、病變且伴隨細胞凋亡。

藏紅花素是一種傳統藥材,提取于藏紅花,具有抗炎、抗癌等藥理活性,同時廣泛用于神經保護、免疫功能調節等方面[18]。VAFAEI等[19]研究表明,藏紅花素的抗炎特性使其在骨關節炎、類風濕性關節炎和關節疼痛方面具有較大的治療潛力,且藏紅花素的抗凋亡及對破骨細胞的抑制作用使其在骨質疏松癥和軟骨退行性疾病中表現出一定的療效。AHMED等[20]研究發現,藏紅花素的抗炎、抗凋亡活性能夠抑制神經退行性疾病中神經元細胞凋亡及結構功能改變。本研究使用藏紅花素處理脊髓損傷大鼠,結果發現,藏紅花素干預后的脊髓損傷大鼠脊髓組織病理損傷程度得到改善,BBB評分升高,脊髓組織細胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,與AHMED等[20]研究結果一致,提示藏紅花素能改善脊髓損傷大鼠運動功能和脊髓損傷,抑制大鼠炎癥反應。

RhoA/ROCK信號通路與多種疾病的發生發展密切相關。據報道,中樞神經系統的損傷和疾病能夠誘導RhoA及其下游效應分子ROCK的激活,而ROCK活化可以通過激活小膠質細胞和星形膠質細胞釋放炎性細胞因子來促進神經炎癥反應[21]。同時RhoA/ROCK信號通路的激活會促進細胞死亡以及神經突觸的收縮和喪失[22]。YING等[23]研究表明,RhoA/ROCK信號通路還參與了脊髓損傷的病理過程,脊髓損傷區域的神經細胞含有高活性的RhoA、ROCK,抑制RhoA/ROCK信號通路可以促進軸突的生長。本研究發現,脊髓損傷大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白水平均顯著升高,藏紅花素處理后的脊髓損傷大鼠脊髓組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白水平均顯著降低,結合YING等[23]的研究,猜測藏紅花素對脊髓損傷大鼠運動功能的改善作用,對大鼠脊髓組織細胞凋亡和炎癥反應的抑制作用可能與抑制RhoA/ROCK信號通路的激活有關。

綜上所述,藏紅花素能改善脊髓損傷大鼠運動功能,抑制脊髓組織細胞凋亡和炎癥反應,其機制可能與抑制RhoA/ROCK信號通路的激活有關。下一步將通過RhoA/ROCK信號通路激活劑干預藏紅花素治療的脊髓損傷大鼠,進一步驗證本研究結果。