上皮性卵巢癌患者血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p水平變化及臨床意義*

張 躍,王倩倩,呂 蓓,陸 泓

1.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院婦科,江蘇無錫 214000;2.南通大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科,江蘇南通 226300

上皮性卵巢癌(EOC)為卵巢癌的常見病理類型,占卵巢癌的85%～90%[1]。該腫瘤早期癥狀不典型,患者確診時多為中晚期,導致其預后差,病死率高[2]。目前臨床對于EOC的治療已從傳統(tǒng)放化療轉為新輔助化療、靶向治療等綜合治療,但5年生存率提升不顯著[3],故早期對EOC進行診斷和治療是提高EOC患者生存率的關鍵。尋找可診斷EOC并預測預后相關的生物標志物具有重要意義。非編碼核糖核酸(RNA)為不編碼蛋白質(zhì)的RNA,長鏈非編碼RNA(LncRNA)為組織特異性較高的非編碼RNA,可參與調(diào)控細胞增殖、凋亡等過程,與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關[4-5]。LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(LncRNA KCNQ1OT1)在肺癌[6]、肝癌[7]等多種惡性腫瘤中表達,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。有研究指出,LncRNA KCNQ1OT1在卵巢癌組織中異常表達,但有關其在EOC中的研究較少[8]。微小RNA(miRNA)為非編碼RNA,在EOC的發(fā)生機制中參與調(diào)控[9-10]。miR-506-3p在前列腺癌細胞中表達下調(diào),其水平上調(diào)對癌細胞惡性行為具有抑制作用[11]。同時,研究顯示,miR-506-3p在骨肉瘤中具有抑癌基因作用[12],在卵巢癌組織中表達異常[13],但臨床中有關其在EOC中的表達相關研究較少。本研究探討血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p與EOC患者臨床病理及預后的關系,旨在為臨床診療與預后評估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3月至2020年12月南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院(以下簡稱本院)收治的102例EOC患者作為EOC組,年齡40～66歲,平均(58.29±5.29)歲;孕次1～5次,平均(3.49±0.53)次;產(chǎn)次1～4次,平均(2.20±0.29)次;國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期12例,Ⅲ期39例,Ⅳ期45例;分化程度:低分化67例,中分化21例,高分化14例;病理類型:漿液性73例,其他29例;淋巴結轉移52例;腹膜轉移49例。納入標準:(1)EOC診斷符合《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南(第四版)》相關標準[14],且經(jīng)病理組織檢查確診為EOC;(2)患者年齡超過18歲;(3)初次確診,入院前無抗腫瘤治療;(4)病理資料完整。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)存在自身免疫性疾病;(3)重要臟器功能障礙;(4)存在急慢性感染;(5)近期服用免疫抑制劑或激素等藥物;(6)精神性疾病。選取同期本院經(jīng)病理組織檢查證實為良性卵巢腫瘤的70例患者作為良性組。其中年齡42～65歲,平均(57.93±5.34)歲;孕次1～5次,平均(3.36±0.47)次;產(chǎn)次1～4次,平均(2.25±0.30)次。另選取同期體檢健康的60例健康女性作為對照組,年齡為43～65歲,平均(58.48±5.42)歲;孕次1～4次,平均(3.45±0.61)次;產(chǎn)次1～4次,平均(2.29±0.38)次。3組年齡、孕次、產(chǎn)次等資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究取得本院倫理委員會的批準(編號:KY2019054)。

1.2方法 采用熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p表達水平。對照組于體檢當日、良性組與EOC組于入院后次日清晨采集空腹靜脈血3 mL。按Trizol試劑盒說明書操作提取血清總RNA,按mRNA逆轉錄試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)操作將2 μg RNA逆轉錄為cDNA,隨后按SYBR Green PCR master mix試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)說明書要求配制反應體系,加樣。反應體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL,cDNA2.0 μL,上、下游引物0.8 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL,ddH20 6.0 μL。PCR反應條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s ,共40個循環(huán),72 ℃反應10 min。以U6為內(nèi)參基因,LncRNA KCNQ1OT1正向引物為5′-CCCAGAAATCCACACCTCGG-3′,反向引物為5′-TCCTCAGTGAGCAGATGGAGA-3′;miR-506-3p正向引物為5′-ACCACCATCAGCCATACTATGT-3′,反向引物為5′-TGTTGCACATTACTCTACTCAGA-3′;U6正向引物為5′-CGTCGACGTGCATGCACG-3′,反向引物為5′-GCTTAAGCTA GCTAGCGC-3′。反應結束后,分析獲得Ct值,采用2-ΔΔCt法計算血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p6的相對表達量。

根據(jù)血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p在EOC組織中相對表達量,以LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量均值為臨界值,將EOC患者分為LncRNA KCNQ1OT1低表達組與高表達組,以及miR-506-3p低表達組與高表達組。

1.3隨訪 EOC患者術后出院開始進行電話或門診隨訪,每隔3個月對患者進行1次隨訪,隨訪時間為10～24個月。隨訪截止時間為隨訪到期或患者死亡,記錄患者生存、死亡例數(shù)?？偵媛?生存例數(shù)/總例數(shù)×100%。無失訪病例。

2 結 果

2.13組血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量比較 良性組、EOC組血清LncRNA KCNQ1OT1相對表達量高于對照組,miR-506-3p相對表達量低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);EOC組血清LncRNA KCNQ1OT1相對表達量高于良性組,miR-506-3p相對表達量低于良性組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量比較

2.2血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量與EOC患者臨床病理特征的關系 EOC患者的血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量與年齡、組織學類型無關(P>0.05),與FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移、腹膜轉移有關(P<0.05)。見表2。

表2 血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量與EOC患者臨床病理特征的關系

2.3血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p對EOC的診斷價值 以本研究EOC組(n=102)為陽性樣本,良性組(n=70)為陰性樣本,行ROC曲線分析。單獨應用:兩指標均參考臨床實踐劃分成若干個組段,再以軟件擬合ROC曲線計算曲線下面積(AUC)及95%CI,并按實測樣本計算靈敏度、特異度、準確度。聯(lián)合應用(LogP模式):以Logistic回歸方法,建立風險評估/診斷模型,獲得Ln(P/1-P)=-0.152+0.202×LncRNA KCNQ1OT1-0.901×miR-506-3p,以其模型值為聯(lián)合應用的虛擬概率量指標,再行ROC曲線分析,結果顯示,血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p單獨及聯(lián)合應用時,AUC及95%CI:分別為0.760(0.603～0.905)、0.724(0.485～0.967)、0.842(0.719～0.944),其中聯(lián)合應用診斷效能較高,AUC及靈敏度、特異度、準確度均較高。見表3和圖1。

圖1 LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p對EOC診斷ROC曲線

表3 血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量對EOC的診斷價值

2.4LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量與患者預后關系 Kaplan-Meier生存曲線顯示,LncRNA KCNQ1OT1低表達組2年生存率61.76%(21/34)高于高表達組33.82%(23/68),miR-506-3p高表達組2年生存率58.06%(18/31)高于低表達組36.62%(26/71),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注:A為LncRNA KCNQ1OT1;B為miR-506-3p。

2.5COX回歸分析EOC患者預后的影響因素 以EOC患者預后為因變量(賦值:死亡=1,生存=0,生存期=t),以表4所列指標為自變量。經(jīng)COX回歸分析,FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、腹膜轉移與血清LncRNA KCNQ1OT1相對表達量上調(diào)、miR-506-3p相對表達量下調(diào)均為影響EOC患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 患者預后影響因素的COX回歸分析

3 討 論

卵巢癌為女性惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤,其常見的類型為EOC[15]。近年來化療、放療等方式雖可在一定程度上延長患者生存時間,但仍存在部分患者發(fā)生復發(fā)以及產(chǎn)生化療耐藥[16]。臨床目前主要通過血清腫瘤標志物與電子計算機斷層掃描、核磁共振成像等影像學檢查輔助診斷EOC,但容易存在漏診誤診等不足,且檢查費用較高,無法滿足早期診斷要求[17]。故尋找高靈敏與特異性的血清標志物對EOC早期診療與預后評估極為重要。

LncRNA為長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,其表達失調(diào)可誘導基因異常表達,在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。KCNQ1OT1是位于KCNQ1位點的LncRNA,僅代表父源等位基因,其轉錄物可調(diào)控人類染色體11p15.5[18]。有研究顯示,敲減KCNQ1OT1能降低卵巢癌細胞增殖與轉移能力,可能作為卵巢癌治療潛在靶點[19]。本研究結果顯示,LncRNA KCNQ1OT1在EOC患者中表達上調(diào),說明LncRNA KCNQ1OT1可能參與EOC發(fā)生發(fā)展,且其相對表達量與FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移、腹膜轉移有關,說明LncRNA KCNQ1OT1在EOC中可能發(fā)揮致癌基因作用,與杜曉琴[8]研究結論相近。原因可能為LncRNA KCNQ1OT1可進一步強化腫瘤惡性行為,當其高表達時體內(nèi)腫瘤細胞可能存在擴散轉移情況。LncRNA KCNQ1OT1可能發(fā)揮致癌基因作用對EOC細胞侵襲轉移等具有促進作用。miR-509-3p、miR-514a-3p、miR-506-3p等miRNA在EOC中低表達降低細胞活性并抑制其發(fā)生增殖、轉移等生物學行為,在EOC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。miRNA為體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼RNA,可在轉錄后調(diào)節(jié)發(fā)育途徑與生物學過程。miR-506-3p為前列腺癌細胞中表達下調(diào)的一種miRNA[11],其相對表達量上調(diào)對腫瘤惡性生物學行為有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-506-3p在EOC患者中表達下調(diào),且其相對表達量與FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移、腹膜轉移有關。這說明miR-506-3p表達缺失與EOC進展有關,可能原因:miR-506-3p可作為抑癌基因,抑制EOC細胞增殖、凋亡及細胞周期進程等,其相對表達量下調(diào)可促進EOC進展。

本研究中,ROC曲線分析結果顯示,血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p診斷EOC的AUC分別為0.760、0.724,提示二者對EOC均有一定診斷價值。當二者聯(lián)合檢測診斷時AUC為0.842,靈敏度與特異度為0.843(86/102)、0.800(56/70),表明血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p聯(lián)合檢測對EOC有較高的診斷價值。生存曲線分析結果顯示,LncRNA KCNQ1OT1低表達組生存率高于高表達組,miR-506-3p高表達組生存率高于低表達組,提示不同LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p相對表達量的患者生存率存在差異,二者相對表達量檢測有助于指導患者預后評估。COX回歸分析結果顯示,FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、腹膜轉移及LncRNA KCNQ1OT1相對表達量上調(diào)、miR-506-3p相對表達量下調(diào)為影響EOC患者預后不良的獨立危險因素。LncRNA KCNQ1OT1可參與癌細胞生物學行為,其作用機制可能與miRNA相互作用有關,具有增殖、侵襲等生物學特征[21]。miR-506-3p可通過抑制細胞增殖轉移等過程以抑制EOC進展與轉移,當其表達下調(diào),對患者預后有較大影響[22]。伊紀亮等[23]研究指出,LncRNA KCNQ1OT1通過調(diào)控miR-506-3p表達調(diào)節(jié)喉鱗狀細胞癌細胞的生物學行為;ZHANG等[24]研究顯示,LncRNA KCNQ1OT1可通過調(diào)控miR-506-3p促進肝癌細胞遷移。由此推測,LncRNA KCNQ1OT1可能通過一些信號通路轉導負性調(diào)控EOC中miR-506-3p表達,進而在EOC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

血清LncRNA KCNQ1OT1在EOC患者中上調(diào)、miR-506-3p下調(diào),二者聯(lián)合檢測對EOC患者診斷效能較高,還與患者不良預后有關,有望成為輔助評估病情和預后的生物學標志物。但本研究也存在一定不足,如樣本量較小,隨訪時間短,期待未來通過增加樣本量、延長隨訪時間進一步研究,以獲得更準確的研究結論。同時,開展體外實驗研究以進一步探討LncRNA KCNQ1OT1、miR-506-3p在EOC中的作用機制。