結直腸癌微衛星不穩定狀態與KRAS、NRAS、BRAF基因突變和臨床病理特征及預后的關系*

趙勇強,王媛媛△,劉春鵬,詹曉芬,魏巍然,古家美

1.汕頭市中心醫院病理科,廣東汕頭 515031;2.中山大學腫瘤防治中心分子診斷科,廣東廣州 510060

研究發現,結直腸癌(CRC)在歐美國家的發病率居內臟腫瘤的第2位[1]。在我國,CRC的發病率呈逐年上升趨勢,且危害較大[2]。病因學上認為遺傳因素在CRC的發生發展過程中起到了關鍵作用,遺傳易感性范圍從明確的遺傳綜合征到不明確的家族性集合體,其分子遺傳機制較為復雜。GAO等[3]和米迷等[4]研究認為,CRC的進展有兩種途徑:其一是染色體不穩定性(CIN)通路,即EGFR-KRAS/BRAF-MEK-ERK-MAPK通路上的基因突變;其二是微衛星不穩定性(MSI),即DNA錯配修復(MMR)功能異常而造成的生物學狀態。CRC的發生發展是多基因、多通路共同參與的復雜過程[5]。然而,目前鮮有針對MSI狀態、CIN通路上的RAS/BRAF基因突變、患者的臨床病理特征及預后相關性的研究。本研究旨在通過對CRC重要生物學行為和臨床病理特征的探討,為其精準個體化治療與預后提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年3月至2020年12月于汕頭市中心醫院和中山大學腫瘤防治中心就診,經病理檢查確診為CRC的861例患者的臨床標本。861例CRC患者中男498例,女363例;年齡31～80歲,平均(56.78±12.62)歲。入選標準:(1)病理檢查明確為原發性CRC;(2)無其他腫瘤診斷史;(3)無放化療、內分泌治療、激素治療和靶向治療史;(4)依從性好。排除標準:(1)妊娠或哺乳期女性;(2)伴嚴重未控制的內科疾病和急性傳染病。CRC診斷依據2020年第5版世界衛生組織(WHO)結直腸腫瘤組織學分類標準[6],CRC分期依據為2017年AJCC第8版TNM分期標準[7]。本研究獲得汕頭市中心醫院和中山大學腫瘤防治中心醫學倫理委員會批準(審批號:2019-科研-121號)和患者的知情同意。

1.2儀器與試劑 Titan S全自動免疫組化染色機、MMR檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。KRAS、NRAS和BRAF基因突變檢測試劑盒均購自北京雅康博生物科技有限公司。MSI檢測試劑、ABI 7500實時熒光定量PCR儀均購自美國應用生物系統公司。

1.3方法

1.3.1CRC組織的蘇木素-伊紅(HE)染色 常規石蠟組織切片的HE染色參照文獻[8]完成。

1.3.2MMR蛋白檢測及判定標準 檢測流程:按照MLH1(1∶150)、MSH2(1∶100)、MSH6(1∶150)和PMS2(1∶150)的一抗稀釋比例完成MMR蛋白檢測。結果判定標準[9]:切片中腫瘤細胞核見黃色或棕黃色著色,且無背景染色。陰性染色結果:腫瘤細胞核未見黃色或棕黃色著色。MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2)中有1種以上蛋白染色結果為陰性,則判定為錯配修復缺陷(dMMR),對應于高頻度微衛星不穩定(MSI-H)。4種蛋白均表現為陽性時判定為錯配修復完善(pMMR),對應于低頻度微衛星不穩定(MSI-L)或微衛星穩定(MSS)。

1.3.3MSI檢測及判定標準 檢測流程:提取組織DNA,完成引物的稀釋及存放。配制PCR反應體系、加樣、上機檢測。檢測結果判讀,參閱文獻[10]:本試劑盒檢測位點包括D5S346、BAT26、BAT25、D17S250、D2S123。與配對正常組織相比較,檢測的全部微衛星不穩定性位點均無等位基因的移動或異常等位基因出現,定義為MSS。與配對正常組織相比較呈現波峰的移動或數目改變,定義為MSI,微衛星5個位點中2個以及2個以上位點出現不穩定者為MSI-H;只有1位點出現不穩定時為MSI-L。

1.3.4KRAS、NRAS、BRAF基因突變的檢測及判定標準 KRAS、NRAS、BRAF基因檢測流程及檢測結果判讀參閱文獻[11]。若待檢DNA樣品中突變位點檢測無擴增或Ct值≥39,則判定為陰性;若待檢DNA樣品中有至少一個突變位點檢測有擴增且Ct值<39,則計算該突變位點ΔCt值。若該突變位點ΔCt值

1.3.5癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)的檢測及判定標準 檢測流程:參閱文獻[12]。結果判讀:CEA的參考值為0.0～4.7 ng/mL、CA199的參考值為0～27 U/mL。大于參考值,則判定為陽性;否則視為陰性。

2 結 果

2.1結腸癌的HE染色及MMR蛋白染色 伴微衛星不穩定性的結腸腺癌,HE染色顯示伴隨淋巴細胞浸潤。IHC染色顯示腫瘤缺乏MLH1和PMS2蛋白的表達。見圖1。

注:A為結腸腺癌的HE染色(上方箭頭為正常的腸黏膜,下方箭頭為結腸腺癌,中間箭頭為間質淋巴細胞);B為結腸腺癌的MLH1蛋白呈陰性表達;C為結腸腺癌的PMS2蛋白呈陰性表達;D為結腸腺癌的MSH2蛋白呈陽性表達;E為結腸腺癌的MSH6蛋白呈陽性表達。

2.2CRC的MMR蛋白表達缺失情況 CRC中的MMR蛋白表達總缺失率為12.08%(104/861)。104例CRC中的MMR蛋白表達缺失類型:MLH1 + PMS2缺失率為54.81%(57/104),MSH2 + MSH6缺失率為21.15%(22/104),PMS2缺失率為8.65%(9/104),MSH2缺失率為5.77%(6/104),MSH6缺失率為9.62%(10/104)。

2.3KRAS、NRAS和BRAF基因在CRC標本的突變情況 KRAS基因突變率為42.28%(364/861),NRAS基因突變率為2.21%(19/861),BRAF基因突變率為6.50%(56/861),3種基因檢出的相應密碼子、堿基變化、氨基酸變化和突變例數及構成比見表1。

表1 KRAS、NRAS和BRAF基因在CRC標本的突變情況

2.4MMR蛋白表達及KRAS、NRAS和BRAF基因突變與CRC患者臨床病理特征的關系 不同年齡、腫瘤部位、組織學類型、腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移狀態、CEA水平的患者MMR蛋白表達比較,差異有統計學意義(P<0.05);不同性別、腫瘤浸潤深度、CA199水平的患者MMR蛋白表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。不同性別、腫瘤部位、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移狀態、CA199水平的患者KRAS基因突變比較,差異有統計學意義(P<0.05);不同患者年齡、腫瘤最大徑、浸潤深度、CEA水平的患者KRAS基因突變比較,差異無統計學意義(P>0.05)。不同CEA水平的患者NRAS基因突變比較,差異有統計學意義(P<0.05);不同患者性別、年齡、腫瘤部位、組織學類型、腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移狀態、CA199水平的患者NRAS基因突變比較,差異無統計學意義(P>0.05)。不同腫瘤部位、組織學類型、腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移狀態的患者BRAF基因突變比較,差異有統計學意義(P<0.05);不同患者性別、年齡、浸潤深度、CEA水平、CA199水平的患者BRAF基因突變比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 MMR蛋白表達、KRAS、NRAS和BRAF基因突變與CRC患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.5MMR蛋白表達與KRAS、NRAS和BRAF基因突變的相關性 KRAS基因在MSI的CRC突變率24.04%(25/104)低于MSS的CRC突變率44.78%(339/757),MMR蛋白表達與KRAS基因突變呈負相關(r=-0.137,P<0.001)。NRAS基因在MSI的CRC突變率1.92%(2/104)低于MSS的CRC突變率2.25%(17/757),但是MMR蛋白表達與NRAS基因突變不相關(r=-0.007,P=0.834)。BRAF基因在MSI的CRC突變率17.31%(18/104)高于MSS的CRC突變率5.02%(38/757),MMR蛋白表達與BRAF基因突變呈正相關(r=0.162,P<0.001)。

2.6CRC患者兩年內死亡影響因素的COX回歸模型 截至2022 年12月31日,有4.53%(39/861)的CRC患者失訪。隨訪患者中,70.07%(576/822)的患者于2年內死亡,生存時間為588.30(455.60,746.00)d。通過 Kaplan-Meier 生存分析法對總生存期進行單因素分析,淋巴結轉移、KRAS突變、BRAF突變、MSI-H是CRC患者2年內死亡的影響因素(P<0.05)。對單因素分析差異有統計學意義的因素進行COX回歸分析,結果顯示,淋巴結轉移、KRAS突變、BRAF突變、MSI-H是影響CRC患者2年內死亡的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 CRC患者2年內死亡影響因素的COX回歸模型

3 討 論

《中國結直腸癌診療規范(2020年版)》[13]推薦檢測的CRC分子生物標志物包括MSI、Ras、BRAF等,其中MSI作為Ⅰ級推薦,Ras(包括K-Ras和N-Ras)、BRAF作為Ⅱ級推薦,并建議根據檢測結果制訂相應的治療方案。DU等[14]和HE等[15]研究顯示,MSH2、MSH6、MLH1和PMS2為臨床上首選檢測MMR蛋白的關鍵生物標志物。

本研究中,CRC患者的MMR蛋白表達缺失率為12.08%,與高菲等[16]的研究中MMR蛋白表達缺失率為11.3%較接近;MMR蛋白表達缺失以MLH1缺失+PMS2缺失為主,與黎相照等[17]研究結論基本吻合。本研究結果顯示,KRAS的基因突變率為42.28%,略高于孫屏等[18]研究的40.59%,可能所研究的標本分期有關;NRAS基因突變率為2.21%,與孫耀華等[19]研究中NRAS的基因突變率為2.74%接近,誤差可能是由樣本量不同導致的;BRAF基因突變率為6.50%,略低于TABERNERO等[20]報道的歐洲和美國人10%的BRAF基因突變率,可能是因為人種的差異,也有可能是因為本研究納入的研究對象是Ⅰ～Ⅳ期CRC患者,而TABERNERO等[20]的研究對象是轉移性結直腸癌(mCRC)患者。

本研究結果發現,MMR蛋白表達與KRAS基因突變呈負相關,MMR蛋白表達與NRAS基因突變不相關。MMR蛋白表達與BRAF基因突變呈正相關,與KIM 等[21]和DARIYA等[22]的研究結論一致。本研究的MSI患者大多為KRAS野生型,患者預后相對較好,而KRAS突變患者預后較差,這一現象與MMR蛋白表達與KRAS基因突變呈負相關的研究結論相對應。本研究結果還顯示,淋巴結轉移、KRAS突變、BRAF突變是CRC患者2年內死亡的危險因素,而MSI-H是CRC患者2年內死亡的保護因素。這一研究結論與SAHIN等[23]的研究結果相一致。江少鋒等[24]研究發現伴肝轉移的CRC原發灶內 MSI-H 率降低,與本文研究結論相符。

KRAS突變、BRAF突變預示CRC預后差的原因可能是:KRAS突變、BRAF突變的通路上的都具有刺激細胞增殖的作用,且對部分化療藥物存在抗藥性。有淋巴結轉移的CRC患者,即使原發切除了轉移灶腫瘤依然繼續生長,因此淋巴結轉移越多,患者預后越差。本課題組認為,MSI的CRC患者預后較好的原因有2個,其一是修復機制的問題導致突變負荷增加,更容易發生突變,有利于免疫系統識別殺傷,往往伴有較多的淋巴細胞等免疫細胞浸潤,發展比較慢,也對免疫治療更敏感;其二是MSI機制引起腫瘤微環境改變,導致免疫細胞浸潤,抑制腫瘤發展。

因為受限于研究時間,本研究的樣本量偏小,本課題組后續將進一步加大符合納入標準樣本的收集,加強臨床和實驗室的緊密合作,促進基礎向臨床的轉化。