子宮內膜癌組織CTGF、TWIST1、NCAPH的表達與臨床病理特征及預后的關系*

丁其培,盧 紅,陸月梅,薛曉玲,陳 薇,章楊韋

海安市人民醫院婦產科,江蘇海安 226600

子宮內膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,早期最常見的臨床表現是異常的子宮出血,全子宮切除聯合雙側輸卵管卵巢切除術是早期子宮內膜癌的主要治療方法[1]。但是很多患者確診疾病時已處于腫瘤的中晚期,預后不佳。目前,子宮內膜癌發生的具體分子機制和遺傳特性仍不十分清楚,因此,迫切需要尋找新的治療靶點以提高臨床療效并改善患者的生存預后。結締組織生長因子(CTGF)是一類與細胞外基質相關的分泌蛋白,在胚胎發育、傷口愈合、纖維化疾病及惡性腫瘤的發生等病理生理過程中扮演重要角色[2]。有研究已經證實,CTGF可作為食管鱗癌、胃癌和肺癌的預后重要指標。但是,CTGF在子宮內膜癌中的表達模式及作用機制尚不清楚[3]。TWIST1是一種進化上高度保守的堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子,最初在果蠅胚胎發育過程中發現具有重要作用,TWIST1基因突變引起頭面部和肢體畸形。近年來越來越多研究證實,TWIST1與腫瘤的惡性增殖和凋亡特性,以及上皮間充質轉化的發生直接相關[4]。TWIST1作為一種新的致癌基因在多種惡性腫瘤中過度表達,賦予腫瘤細胞更多的表型特征。有研究表明[5],TWIST1可能是一種新的評估子宮內膜癌疾病嚴重程度的分子標志物,但是,TWIST1表達的預測價值是否足以指導子宮內膜癌患者的臨床治療,以及在子宮內膜癌發生和發展中的具體作用仍有待確定。非平滑肌細胞凝聚素Ⅰ復合亞單位H(NCAPH)是間期染色質轉化為濃縮染色體所必需的物質之一,近期研究證實,其在肝細胞癌、前列腺癌和結腸癌的發生和臨床預后方面發揮重要作用[6]。但是,NCAPH在子宮內膜癌的發生中是否起作用還不清楚。因此,本研究擬探討子宮內膜癌組織中CTGF、TWIST1和NCAPH的表達,并分析其與腫瘤臨床病理特征以及患者生存預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年1月至2019年1月于南通大學附屬海安醫院行全子宮切除術140 例患者的臨床資料,術后病理證實為子宮內膜癌患者68例(子宮內膜癌組)、不典型增生患者42例(不典型增生組)和正常子宮內膜患者30例(正常組)。納入標準:(1)年齡40～75歲;(2)符合病理診斷結果;(3)術前無放化療史;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)合并其他部位原發惡性腫瘤,如宮頸癌;(2)合并泌尿生殖系統嚴重感染、自身免疫性疾病、營養代謝性疾病;(3)合并嚴重肝腎功能障礙。本研究取得南通大學附屬海安醫院醫學倫理學委員會批準,所有受試者簽署知情同意書。子宮內膜癌組年齡50～69歲,平均(57.4±8.6)歲,不典型增生組年齡47～68歲,平均(57.1±9.2)歲,正常組年齡45～71歲,平均(57.2±10.3)歲;3組患者年齡等比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2研究方法 采用免疫組化染色法檢測3組CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達率,分析它們與子宮內膜癌患者的腫瘤病理特征和生存預后的關系,其中臨床病理特征包括患者年齡、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移和腫瘤肌層浸潤深度。

1.2.1免疫組化染色法 將術中切除的新鮮子宮內膜組織制作切片,厚度5 μm,經脫蠟、水化,抗原修復處理,然后加入3% H2O2溶液孵育 20 min,滴加正常山羊血清工作液孵育30 min提高圖片染色對比度。滴加鼠抗人CTGF、TWIST1和NCAPH抗體(一抗,江蘇碧云天科技有限公司,1∶2 000),置于濕盒內 4 ℃孵育過夜,以正常小鼠 IgG 代替一抗作為陰性對照;洗滌干凈后滴加兔抗鼠抗體(二抗,江蘇碧云天科技有限公司,1∶500),置于濕盒中37 ℃孵育 20 min;洗滌干凈后滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液(江蘇碧云天科技有限公司),置于濕盒中37 ℃孵育 20 min提高圖片染色清晰度。最后,洗滌、DAB顯色、蘇木素復染等,在光學顯微鏡下觀察。

結果判定:采用半定量法,依據染色強度和染色細胞百分比,以細胞質或細胞核黃染為陽性,無陽性染色為 0分,弱染色為1分,中等強度染色為2分,強染色為3分;陽性細胞百分率≤5%為0分,>5～25%為1分,>25～50%為2分,>50～75%為3分,>75%為4分;兩項乘積0～3分為陰性,4～12分為陽性。由兩名經驗豐富的病理科醫師獨立閱片,取評分結果的平均值。

1.2.2隨訪預后 子宮內膜癌患者從出院后常規電話隨訪,記錄生存結局,定義總生存為任何原因的死亡。隨訪截止時間為2022年5月,隨訪時間8～62個月,中位時間42.5個月。

2 結 果

2.1CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達率 子宮內膜癌組CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達率均明顯高于不典型增生組和正常組,差異有統計學意義(P<0.05),而不典型增生組和正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1和圖1。

注:A～C為CTGF染色,D～F為TWIST1染色,G～I為NCAPH染色。

表1 CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達率[n(%)]

2.2CTGF、TWIST1和NCAPH表達與子宮內膜癌患者臨床病理特征的關系 子宮內膜癌組CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達與患者年齡、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑和病理類型無關(P>0.05),而與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移和腫瘤肌層浸潤深度密切相關(P<0.05)。見表2。

表2 CTGF、TWIST1和NCAPH表達與子宮內膜癌患者臨床病理特征的關系(n)

2.3CTGF、TWIST1和NCAPH表達與子宮內膜癌患者預后的關系 Kaplan-Meier 生存分析顯示,子宮內膜癌組CTGF、TWIST1和NCAPH陽性表達患者的累積總生存率均明顯低于陰性表達患者(P<0.05)。見表3和圖2。

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線分析結果

表3 CTGF、TWIST1和NCAPH表達與子宮內膜癌患者預后的關系

2.4子宮內膜癌患者預后的危險因素 單因素COX回歸分析顯示,FIGO分期、淋巴結轉移、CTGF、TWIST1和NCAPH表達與子宮內膜癌患者的生存預后密切相關(P<0.05)。多因素COX回歸分析顯示,FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移陽性、CTGF、TWIST1和NCAPH陽性表達是患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 子宮內膜癌患者預后的危險因素

3 討 論

根據組織學和代謝特征,子宮內膜癌可分為Ⅰ型(雌激素依賴型)和Ⅱ型(非雌激素依賴型),其中Ⅰ型最常見,絕大多數為內膜樣腺癌。通常認為Ⅰ型子宮內膜癌的發生遵循正常組、良性增生、不典型增生和惡性腫瘤的路徑,其中靶向分子的異常表達在子宮內膜癌的發生和發展中發揮重要作用[7]。子宮內膜癌的發生可能是多分子、多途徑共同參與的結果[8],沒有一個單一的標志物具有高度的敏感性或特異性,還需要尋找更合適的敏感分子標志物用于診斷子宮內膜癌、分析疾病發生機制及預測患者生存預后。該研究顯示,子宮內膜癌組CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達率明顯高于不典型增生組和正常組,CTGF、TWIST1和NCAPH蛋白的陽性表達率與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移和腫瘤肌層浸潤深度密切相關,CTGF、TWIST1和NCAPH陽性表達患者的OS率明顯低于陰性表達患者,CTGF、TWIST1和NCAPH陽性表達是患者死亡的獨立危險因素。研究證實CTGF、TWIST1和NCAPH高表達可能在子宮內膜癌的發生和患者預后方面起一定作用。

CTGF在不同類型的惡性腫瘤中具有不同的特性,比如在胰腺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌中發揮促癌效應[9],而在肺癌和口腔鱗癌中起抑癌作用[10]。CTGF在上皮性卵巢癌組織中的表達增加,與腫瘤臨床分期增加相一致[11]。CTGF可通過介導肝癌細胞與肝星狀細胞之間的腫瘤-腫瘤相互作用而加速腫瘤的進展,在肝癌轉移過程中CTGF與趨化因子配體18存在正反饋機制[12]。CTGF在實體瘤組織中更具侵襲性的表型和腫瘤進展相關。CTGF是促進乳腺癌細胞溶骨性和骨轉移的基因信號的關鍵成分[13]。人源化抗CTGF單克隆抗體FG-3019能夠抑制小鼠胰腺癌異種移植和原位模型的腫瘤生長和轉移能力[14]。

TWIST1與腫瘤的發生、血管生成、化療耐藥等機制有關[15]。不典型增生被稱為子宮內膜癌的癌前病變,不典型增生診斷后至少1年可發展為子宮內膜癌,不典型增生發生子宮內膜癌的風險為40%[16],TWIST1可能是一個潛在診斷子宮內膜癌的重要生物標志物。研究指出,雌激素通過上調TWIST1和PI3K/AKT/NF-κB信號途徑,以及CCL2-CCR2軸促進激素依賴性乳腺癌的發生和進展,而雌激素與孕激素比值的增加是Ⅰ型子宮內膜癌發生的關鍵驅動因素[17]。子宮內膜癌中TWIST1和ER之間可能存在負相關。高表達TWIST1的子宮內膜癌患者具有更大的侵襲能力和發展為遠端轉移的風險。相關機制可能涉及TWIST1/E-cadherin/EMT通路、侵襲足的形成、血管內遷移、外滲和血管生成擬態的形成等,在體外細胞實驗中可以得到證實[18-19]。

應用腫瘤基因組圖譜預測NCAPH在子宮內膜癌組織中顯著高表達,與更高的FIGO分期、更高分化級別、漿液性組織學亞型、肌層浸潤深度增加、淋巴結轉移等密切相關[20]。基因富集分析表明,NCAPH參與子宮內膜癌發生的關鍵靶點有有絲分裂紡錘體、G2M-u檢查點、MYC-u靶點、E2F-u靶點等[21];在上調的NCAPH組中,MTORC1-u信號參與了NCAPH低甲基化、擴增拷貝數變異和基因突變[22];提示NCAPH上調在子宮內膜癌發生中起促進作用。因此,推測NCAPH具有癌基因的功能,可促進子宮內膜癌的發生發展。

CTGF、TWIST1和NCAPH從不同的角度闡述了與腫瘤發生和發展的重要關系,CTGF、TWIST1和NCAPH之間也可能存在重要聯系,相互影響共同參與腫瘤的發生,但是具體內在聯系還需要體外分子實驗和動物模型來探索。

綜上所述,子宮內膜癌患者組織中CTGF、TWIST1和NCAPH表達上調可能與腫瘤發生和發展密切相關,可作為預測生存預后的重要生物標志物。