數(shù)字PCR技術在感染性疾病中的應用進展*

王國飛,王雪亮 綜述,周 靖 審校

上海市臨床檢驗中心/上海市實驗醫(yī)學研究院,上海 200126

感染性疾病是世界各地社會公共衛(wèi)生和經(jīng)濟穩(wěn)定的重大負擔,對全球衛(wèi)生安全和人類健康帶來越來越大的挑戰(zhàn)[1]。此外,受全球氣候變暖、城市化加速和人口快速流動等多種因素影響,新發(fā)感染性疾病近年來逐漸增多,尤其是新型冠狀病毒(以下簡稱新冠病毒)感染的全球大流行,使其成為全球重要的公共衛(wèi)生威脅[2-3]。因此,在全球一體化大背景下,快速精準地識別相關病原微生物,對于人類健康和公共衛(wèi)生安全具有非常重要的作用。

病原微生物檢測技術主要包括形態(tài)學檢查、病原分離培養(yǎng)、免疫學檢測和核酸檢測等。形態(tài)學檢查、病原分離培養(yǎng)、免疫學檢測等傳統(tǒng)方法存在漏檢和不便分型、培養(yǎng)周期長、較易出現(xiàn)假陰和假陽等缺點。核酸檢測因為靈敏性高、特異性強、反應快速等優(yōu)點,目前已在臨床得到廣泛應用,特別是實時熒光PCR,已被用作某些病原體檢測的金標準。然而,實時熒光PCR作為一種核酸間接定量手段,受到其固有方法學制約,在檢測極低豐度靶標序列、識別微小靶標濃度變化等方面存在不足,特別是在定量檢測時無法擺脫標準曲線等外部標準品束縛。

隨著技術的不斷發(fā)展,1999年作為第3代PCR技術的數(shù)字PCR(dPCR)被提出,完成了從相對定量到絕對定量的轉(zhuǎn)變。作為一種新的核酸定量技術,具有比傳統(tǒng)PCR更精準和重復性更好的優(yōu)點,已逐漸成為生命科學領域引人矚目的創(chuàng)新之一,并在病原體檢測、腫瘤早篩、伴隨診斷和產(chǎn)前診斷等領域中得到廣泛應用[4-5]。本文就dPCR在病原體檢測中的應用進行綜述,以期為dPCR更好地用于傳染性疾病早期診斷、用藥指導和療效監(jiān)測等提供參考借鑒。

1 數(shù)字PCR技術的原理和優(yōu)勢

1992年,SYKES等[6]在核酸擴增時對樣品進行有限稀釋并結(jié)合泊松分布對擴增結(jié)果進行統(tǒng)計處理,這為dPCR的產(chǎn)生奠定了堅實的理論基礎。1999年,VOGELSTEIN與KINZLER正式提出了dPCR的概念[7],即將指數(shù)型函數(shù)轉(zhuǎn)化成線性函數(shù),對模板進行有限稀釋,根據(jù)熒光信號的有或無進行精確定量,其為結(jié)合了第1代傳統(tǒng)PCR簡單操作和第2代實時熒光PCR準確定量的特征發(fā)展而來的第3代PCR技術[8]。

同傳統(tǒng)PCR相比,dPCR增加了對反應體系進行分隔的操作,將幾十微升的反應體系分隔成了數(shù)萬微小獨立反應體系,核酸模板在分隔過程中被充分稀釋,理想狀態(tài)下為每個微滴中含有1個分子核酸模板,擴增完成后對所有液滴進行熒光信號識別并計數(shù),以此計算靶標分子的濃度(圖1)[9]。dPCR的優(yōu)勢包括[5,10]:(1)絕對定量。不需要標準品,不依賴擴增閾值和標準曲線,dPCR擴增效率不影響結(jié)果,可以絕對定量核酸分子[11]。(2)受干擾影響小。dPCR使用終點熒光分析的方式,定量較少受到樣品中擴增抑制劑的影響。(3)靈敏度更高。dPCR可更精確地量化靶標分子,且在測抗病毒治療中低濃度病毒載量方面更為靈敏,同時在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯的優(yōu)勢。

圖1 dPCR的原理和工作流程[9]

在發(fā)展過程中,dPCR系統(tǒng)出現(xiàn)了3種類型,即微孔板dPCR系統(tǒng)、微流控芯片dPCR(mcdPCR)系統(tǒng)和微滴式dPCR(ddPCR)系統(tǒng)[12]。微孔板dPCR系統(tǒng)是在不銹鋼芯片上刻蝕幾千個微反應室,微量擴增體系在每個微反應室中分別擴增,每孔的反應體積從微升級降至納升級,須通過自動點樣儀加液,實驗成本和操作復雜性相對較高。mcdPCR系統(tǒng)是在微流體技術、納米制造技術和微電子技術等大力發(fā)展的基礎上產(chǎn)生的,通過微流控芯片技術可使樣品流體快速準確地分布于若干個獨立單元,此方法通量高、成本低、效果好。ddPCR系統(tǒng)則是利用油包水技術將其“分割”為數(shù)萬個納升級的微滴,每一個微滴都是一個獨立的PCR反應體系,該方法通量高,操作簡單,成本低,是目前應用最為廣泛的dPCR平臺。

2 dPCR在感染性疾病檢測中的應用

dPCR憑借其高靈敏度、高精度和絕對定量的特點,已成為檢測病原微生物的一種有前途和可靠的工具[13],并廣泛應用于多種病毒、細菌、衣原體、寄生蟲感染等的檢測和研究中。

2.1dPCR在病毒檢測中的應用 病毒感染很容易出現(xiàn)發(fā)燒感冒的現(xiàn)象,也會出現(xiàn)咳嗽咳痰的癥狀,尤其是高致病性病毒,會影響人的免疫系統(tǒng)從而引起多種并發(fā)癥,導致人體出現(xiàn)免疫力低下、感染、腹瀉等癥狀,對人體產(chǎn)生較大的不同程度的損害。dPCR在病毒感染診斷中起著重要的作用,目前已應用于新型冠狀病毒[14]、人類乳頭瘤病毒(HPV)[15]、人類皰疹病毒、巨細胞病毒、人流感病毒、乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒(HIV)等[16]病毒的檢測中。NYARUABA等[17]綜述了dPCR在新冠病毒檢測中的廣泛應用,包括新冠病毒檢測和參考標準的開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測、突變檢測及其臨床診斷等,相關研究均顯示dPCR的特異性、靈敏性、再現(xiàn)性和檢測限通常不受常見因素影響,可有效規(guī)避實時熒光PCR法中出現(xiàn)的假陰性和假陽性情況。CAROW等[18]使用dPCR和實時熒光PCR對宮頸癌患者前哨淋巴結(jié)中的HPV mRNA進行定量檢測,并確定了預后閾值水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實時熒光PCR的平均變異系數(shù)(CV)為126%,而dPCR的平均CV僅為40%,這表明dPCR具有更高的可靠性。SNIPPENBERG等[19]通過dPCR檢測平臺對HIV-1感染者樣本中DNA載量進行定量,可獲得更為準確及敏感的HIV-1儲存庫檢測結(jié)果,這對提高HIV-1感染者的治療效果起到至關重要的作用。

2.2在細菌檢測中的應用 致病性細菌感染嚴重威脅人類健康,副溶血弧菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌引起的相關疾病已引起廣泛關注。LEI等[4]建立了一種針對副溶血弧菌tlh、tdh和ureR基因的多重ddPCR方法。結(jié)果表明該方法顯著提高了副溶血性葡萄球菌檢測的特異性和準確性,且其檢出限可低至15 CFU/mL。USHIO等[20]利用dPCR檢測肺結(jié)核(PTB)患者血漿中結(jié)核分枝桿菌(MTB)的研究中發(fā)現(xiàn),從新診斷的痰涂片陽性PTB患者血漿樣本中純化總DNA后,用dPCR定量樣品中MTB特異性基因(S6110或gyrB)拷貝數(shù),結(jié)果成功檢測到PTB患者血漿中的MTB DNA,該dPCR的測定提高了檢測小拷貝數(shù)目標分子的靈敏度,同時為dPCR檢測PTB患者血漿中MTB DNA進行了實用性探索。徐衛(wèi)華等[21]比較了dPCR和血培養(yǎng)法在檢測兒童耐甲氧西林金黃色葡萄球菌血流感染中的應用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)dPCR的靈敏度和特異度分別為91.40%和94.15%,平均檢測時間為2.5 h,遠少于血培養(yǎng)法的48 h,有助于提高耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的快速診斷能力,為早期精準治療贏取時間。

2.3在支原體和衣原體檢測中的應用 解脲支原體(UU)和沙眼衣原體(CT)感染是發(fā)病率較高的非淋球菌性性傳播疾病的常見原因。HUANG等[22]開發(fā)出用于臨床樣本中UU檢測和定量的ddPCR方法,為UU感染與女性非特異性宮頸炎之間的相關性提供了有效證據(jù)。ROBERTS等[23]開發(fā)出一種用于CT感染的ddPCR方法,通過檢測幾內(nèi)亞比紹CT流行人群的1 509份臨床結(jié)膜拭子樣本,通過比較ddPCR和羅氏擴增CT/NG檢測的性能,發(fā)現(xiàn)ddPCR的靈敏度和特異度分別為73.3%和99.1%,陰性和陽性預測值分別為94.6%和94.5%,這提示ddPCR可作為一種有效的診斷技術用于診斷眼部沙眼衣原體感染。

2.4在寄生蟲檢測中的應用 由于國際旅游和移民等因素,寄生蟲感染已成為全球疾病負擔的主要原因之一和發(fā)展中國家面臨的主要公共衛(wèi)生問題。顯微鏡鏡檢是檢測寄生蟲感染的主要手段,但該法耗時長,低豐度標本檢出率低,而dPCR憑借其特有優(yōu)勢在寄生蟲感染檢測中應用越來越多,包括瘧原蟲[24]、日本血吸蟲[25]、巴貝西蟲[26]等。POMARI等[27]的研究匯總了dPCR在寄生蟲感染檢測中的應用現(xiàn)狀,發(fā)現(xiàn)dPCR在惡性瘧原蟲和日本血吸蟲檢測中具有明顯優(yōu)勢,不僅表現(xiàn)出更高的靈敏度,同時在對隱孢子蟲的檢測中顯示出對糞便抑制劑具有更好的穩(wěn)定性。楊亞閃等[28]建立了針對人巴貝西蟲的18S rRNA基因的dPCR檢測方法,并利用該方法檢測了1 000份我國牡丹江市采集的獻血者紅細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)人巴貝西蟲的檢出陽性率為0.2%,并證實該方法具有較高靈敏度和較好穩(wěn)定性,可穩(wěn)定檢測單拷貝核酸檢測下限能達到組內(nèi)實際檢測拷貝數(shù)為4.00±0.65,組間實際檢測拷貝數(shù)為4.53±0.71,為巴貝西蟲研究及我國血供安全評估提供了技術儲備和參考數(shù)據(jù)。WEERAKOON等[29]研究了dPCR直接檢測血吸蟲的可行性,糞便和血清的檢測結(jié)果表明其均具有良好的靈敏度(分別為98%和94%),且可根據(jù)血吸蟲DNA載量變化判斷患者感染程度,這也表明dPCR在血吸蟲疾病控制方面可起到重要作用。

3 數(shù)字PCR在感染性疾病監(jiān)測中的應用

dPCR可以精確定量10個拷貝以下的病原微生物[30],這是實時熒光PCR所無法實現(xiàn)的,該特性特別適合感染性疾病早期診斷和低濃度病毒監(jiān)測。LIN等[31]報道了使用ddPCR可在24 h內(nèi)快速準確鑒定出兩例膿毒癥患者中大腸桿菌和肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌和糞腸球菌的案例,這表明dPCR有助于膿毒癥的超早期(<24 h)診斷,可提早預警并在治療過程中對病原體精準定量監(jiān)測。RENAULT等[32]通過dPCR和qPCR對215例HIV感染者樣本總DNA進行連續(xù)監(jiān)測,結(jié)果顯示dPCR的重復性(CV為11.9%)和再現(xiàn)性要比實時熒光PCR更好(CV為24.7%),有助于長期接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者,通過dPCR對總HIV DNA的絕對定量可以比實時熒光PCR更準確地監(jiān)測HIV病毒庫。韓冰等[33]利用dPCR技術檢測布魯菌,針對20例急性期布魯菌病患者血清樣本,dPCR均能檢出陽性,而實時熒光PCR的檢測陽性為0,在急性期布魯菌病患者血清標本檢測中,dPCR檢測靈敏度高于實時熒光PCR,有良好的臨床應用前景,同時檢出限可低至每微升0.08個拷貝,有效提高了低豐度標本的病原菌檢出率。

4 數(shù)字PCR在感染性疾病重癥管理中的應用

病原體感染是重癥醫(yī)學中發(fā)病率和死亡率的主要原因,及時準確地診斷對減少感染導致的致死率和致殘率至關重要,尤其是某些重癥感染疾病的早期診斷、嚴重程度分層、預后評估或治療指導等。ZHOU等[34]利用ddPCR對胸膜和腹膜感染患者樣本中的克雷伯菌進行了檢測,ddPCR檢測的靈敏度分別為96%和92.86%,同時與基于培養(yǎng)的鑒定的時間相比,ddPCR分析的標本周轉(zhuǎn)時間約為3 h,時間上也更為快速。WU等[35]通過進行在重癥監(jiān)護病房(ICU)實踐中診斷血流感染(BSIs)的差異ddPCR結(jié)果的前瞻性臨床研究,用來評判ddPCR作為重癥醫(yī)學中BSIs病原體檢測的一種有前途工具的可行性。以臨床診斷的BSI真陽性為基礎,ddPCR檢測的靈敏度和特異度分別提高到84.9%和92.5%,結(jié)合臨床感染證據(jù),ddPCR顯示出在ICU實踐中快速診斷可疑BSIs的潛在優(yōu)勢。CHEN等[36]通過在體外將真菌細胞與人血混合,以及在體內(nèi)分析感染小鼠和疑似念珠菌血癥患者的血樣,評估了ddPCR檢測念珠菌DNA的靈敏度和特異度,結(jié)果表明,ddPCR分析可以在血液樣品中檢測到每個反應至少4.5個DNA拷貝。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)和實時熒光PCR法相比,ddPCR對念珠菌DNA檢測顯示出更高的靈敏度和特異度,臨床上可用于監(jiān)測念珠菌血癥的治療。以上研究證明,dPCR可作為一種有潛力的技術工具,有助于改善重癥醫(yī)學中感染的檢測和臨床管理。

5 數(shù)字PCR在耐藥基因檢測中的應用

相比qPCR,dPCR能早期檢測罕見突變基因或藥物抗性基因[37]。SUN等[38]建立了一種使用ddPCR定量檢測糞便樣本中幽門螺桿菌克拉霉素耐藥(突變)和易感(野生型)等位基因(23S rRNA)的方法,以對幽門螺桿菌抗微生物耐藥性進行評估。相較于常規(guī)臨床耐藥監(jiān)測,由于幽門螺桿菌抗微生物劑抗性的準確評估受到分離物取樣較少的限制,ddPCR靈敏度高的特性使其能更好地檢測到耐藥性突變。SRISUTHAM等[39]開發(fā)和驗證了用于檢測與抗瘧疾藥物抗性相關的惡性瘧原蟲多藥耐藥性1(pfmdr1)、惡性瘧原蟲血漿蛋白酶2(pfplasmepsin2)和惡性瘧原蟲GTP環(huán)化水解酶1 (pfgch1)基因拷貝數(shù)變異(CNV)的ddPCR檢測方法。通過與實時熒光PCR法的比較,多重ddPCR法是準確檢測基因拷貝數(shù)的可選方法,不需要校準標準,同時降低了成本和檢測所需時間,表明ddPCR試驗是監(jiān)測抗瘧疾藥物耐藥性的一個有用的附加工具。HU等[40]使用多重ddPCR檢測臨床上常見的16種細菌、4種真菌和4個耐藥基因,通過比較dPCR、mNGS疑似血流感染患者中的應用,表明在ddPCR檢測Panel所覆蓋的病原體范圍內(nèi),ddPCR比mNGS具有更高的靈敏度,且ddPCR可在4 h內(nèi)完成檢測,相比宏基因組測序(mNGS)2 d的檢測時間具有明顯優(yōu)勢。

6 數(shù)字PCR在感染性疾病檢測新平臺/新技術檢測開發(fā)中的應用

隨著新技術的發(fā)展,針對感染性疾病的dPCR新檢測平臺也在不斷開發(fā)中。CHOI等[41]為實現(xiàn)傳染病快速檢測,開發(fā)出傳染病定量檢測的物聯(lián)網(wǎng)集成多路dPCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)可使用自啟動微流控芯片,以更高的線性度(>98%)和靈敏度(每微升1個拷貝)實現(xiàn)3種疾病病原體(流感病毒、登革熱病毒和人類冠狀病毒)的9個型別(如H1N1、H3N2、IFZ B、DENV2、DENV3、DENV4、OC43、229E和NL63)的檢測。鐘田雨等[42]研發(fā)試制了基于dPCR平臺的新冠病毒核酸超敏定量檢測試劑,利用創(chuàng)新的RNA一步法逆轉(zhuǎn)錄ddPCR技術,針對可對新冠病毒 ORF1ab基因和N基因保守區(qū)進行核酸絕對定量,提高檢測準確性可用于臨床上新冠病毒感染的輔助診斷和病毒載量分析,具有廣泛的臨床應用價值。CHEN等[43]設計了硅基快速生成靜態(tài)液滴陣列芯片的快速dPCR檢測平臺,使用乙型肝炎病毒質(zhì)粒的梯度稀釋作為dPCR反應的靶DNA來測試平臺定量檢測DNA分子的可行性,平臺可實現(xiàn)2 704個微孔(每微孔0.785 nL)的液滴陣列,樣品加載時間小于10 s,具備簡單和有效的特性。

7 小 結(jié)

作為第3代PCR技術,dPCR以其高靈敏、高精度、干擾小、絕對定量的技術優(yōu)勢已在感染性疾病檢測和研究中得到廣泛應用,并為疾病早期診斷、療效評估和預后檢測等方面提供了更具重復性和再現(xiàn)性的數(shù)據(jù)支持。但作為一項新的技術,dPCR尚處于發(fā)展階段,還有許多問題需要進一步解決和探討,如實驗成本過高、臨床應用尚未普及、操作過程存在污染概率較高、檢測速度和檢測通量有待提升等。未來,結(jié)合高通量和數(shù)字芯片技術的持續(xù)發(fā)展,dPCR將作為“精準醫(yī)療”的有力支撐,朝著高通量、自動化、多功能方向發(fā)展,繼續(xù)引領分子診斷熱潮,推動dPCR在生命科學中的實際應用。