藜麥SOD 家族基因的鑒定及其對混合鹽堿脅迫的響應

鄧玉榮 韓聯 王金龍 韋興翰 王旭東 趙穎 魏小紅 李朝周

摘要：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是植物抗氧化系統的關鍵酶，在保護植物免受生物和非生物脅迫方面發揮重要作用。以擬南芥SOD為基礎，通過序列比對在藜麥基因組中鑒定出12個SOD 基因，分別定位于細胞核、微體及線粒體，在11條染色體上不均勻分布，其編碼蛋白質三級結構顯示Cu/Zn-SODs與Fe-SODs為同源二聚體，Mn-SODs為同源四聚體。CqSOD 基因內含子/外顯子分布模式不盡相同，內含子數介于4～7個，保守基序差異明顯。系統發育關系顯示，SOD蛋白可分為Cu/Zn-SODs、Fe-SODs及Mn-SODs 3個亞族。此外，所有的CqFe-SODs 及CqMn-SODs 啟動子區都含有脫落酸激素反應順式元件，CqSOD12 與11 個CqSOD蛋白及4個CqCAT蛋白存在相互作用。表達譜分析表明，12個CqSOD 基因對混合鹽堿及硝普鈉均有較強響應。研究結果為SOD 基因在植物發育和脅迫響應中的作用及分子機制研究奠定基礎。

關鍵詞：藜麥；SOD 家族基因；鹽堿脅迫；生物信息學分析；表達分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0558

中圖分類號：S519 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）01002812

在自然條件下，植物容易受到干旱、鹽、極端溫度、重金屬及其他對植物生長和發育產生重大影響的非生物因素脅迫[1]。當植物受到脅迫時，會在其細胞中產生更多的活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）來氧化蛋白質、破壞細胞膜并導致DNA損害。ROS主要在質外體、線粒體、質膜、葉綠體、過氧化物酶體、內質網和細胞壁中形成[2]，其主要包括羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2· -）、過氧化氫（H2O2）和單線態氧（1O?），能引起細胞膜的損傷、大分子的過氧化和變質，最終導致細胞死亡。ROS也被認為是不同生物體中的信號分子，可以影響植物的各種生理過程。使用活性氧清除劑可以通過調節酶反應家族基因，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPX）等編碼基因的表達來抵抗環境脅迫[3]。因此，為了減輕ROS的毒性，植物建立了組織良好的復合抗氧化防御系統，包括許多非酶和酶抗氧化劑。

SOD是一種金屬酶，首先在紅細胞中發現，然后在細菌、脊椎動物和高等植物中進行了研究[4]。SODs可以催化O2· -進行歧化反應生成H2O2和O2，SOD可在植物的根、果實、葉子和種子中檢測到，其為細胞抵御氧化應激提供了必要的保護[5]。根據SOD 與金屬輔助因子的結合模式，可分為鐵SOD（FeSOD）、銅/鋅SOD（Cu/ZnSOD）、錳SOD（MnSOD）、和鎳SOD（NiSOD）[6]4 個亞型，不同亞型具有不同的功能。此外，它們具有不同的氨基酸序列、體外亞細胞定位和晶體結構以及不同的過氧化氫敏感性[7]，某些SOD單獨分布在細胞隔室中，在氧化應激中發揮重要作用。Cu/ZnSODs主要分布在葉綠體、細胞外空間和細胞質中，也存在于某些細菌和所有真核生物中，而MnSODs主要存在于植物線粒體中[8]。植物基因組中的MnSOD 在消除線粒體ROS 中發揮作用[9]。FeSODs主要分布在原生動物、原核生物、細胞質和植物葉綠體中，而NiSODs存在于鏈霉菌和一些藍細菌中，但在植物中不存在[2]。

最近的研究表明，SODs 可以保護植物免受熱、干旱、寒冷、脫落酸、鹽和乙烯等非生物脅迫的影響[10]。SOD 基因可以在不同的植物中受到熱、干旱、冷、鹽、滲透脅迫、氧化脅迫和激素信號轉導等條件下誘導和轉錄。近年來，越來越多植物基因組信息的發布使SOD 基因家族研究成為熱點，Su等[6]在油菜（Brassica campestris）中鑒定了31個SOD 基因，其中8個在不同激素和非生物脅迫條件下顯著上調；丹參（Salvia miltiorrhiza）的8 個SOD 基因對寒冷、鹽、干旱、重金屬和植物激素表現出不同的響應特征[11]；大麥（Hordeum vulgare）的SOD 基因家族共有7 個成員，其中HvSOD1、HvSOD4 和HvSOD5 在干旱和鹽脅迫下表達量顯著變化[12]；在番茄（Solanum lycopersicum）中，SlSOD1 是9 個SlSOD 基因中唯一顯著上調的基因，而SlSOD2、SlSOD5、SlSOD6 和SlSOD8 受鹽脅迫的調節；Feng 等[13] 發現，SlSOD2、SlSOD5、SlSOD6 和SlSOD8 4個基因的表達水平在強干旱環境下明顯提高。此外，同一類型的SOD 基因在不同物種中的表達模式也不盡相同，氧化脅迫下擬南芥中MnSODs 的表達沒有變化，而鹽脅迫下豌豆（Pisum sativum）和小麥（Triticum aestivum）中MnSODs 的表達有顯著變化[14]。以上研究表明，不同的SOD 基因在不同環境脅迫下的表達模式不同。迄今為止，SOD 基因家族已在許多植物中得到解析鑒定，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、高粱（Sorghum bicolor）、菜豆（Phaseolus vulgaris）和楊樹（Populus）[15]。藜麥起源于南美洲安第斯山脈，為藜科藜屬一年生四倍體雙子葉草本植物，是世界重要的經濟和營養作物[16]，具有較強的耐旱、耐鹽、耐瘠薄特性。趙穎等[17]發現，藜麥種子能耐受較高水平的混合鹽堿脅迫，有些品種抗鹽性極強，是抗鹽作物棉花的2～3 倍。劉文瑜等[18]發現，隨NaCl含量的升高和處理時間的延長，藜麥幼苗葉片葉綠素含量先升高后下降，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量逐漸升高，SOD、POD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性增強以提高藜麥應對鹽脅迫的能力。但關于藜麥分子方面研究較少，有研究發現鹽脅迫下藜麥大多數基因在轉錄水平發生變化[19]，目前尚未見SOD 家族的報道。因此，本研究深入分析藜麥中SOD 基因在不同組織中的系統發育譜系、基因結構、基本基序及非生物脅迫下的表達差異等，為藜麥SOD 基因的功能鑒定奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

以‘隴藜2號（甘肅省農業科學院提供）為試驗材料。藜麥種子用體積分數75%的乙醇滅菌30 s，無菌水洗滌2次，10%次氯酸鈉滅菌15 min，用無菌水洗滌5次，然后接種在MS固體培養基上，種子在光照培養箱25 °C、光照16 h/黑暗8 h下培養48 h直至發芽，然后將發芽的種子種植在含有沙子、珍珠巖和泥炭（體積比1∶1∶1）的托盤中，并在生長室中培養，條件為：相對濕度60%～70%，光照強度4 000 lx，時間12 h，白28 ℃/晝18 ℃。幼苗生長2個月至6葉期，參照趙穎等[17]的方法配置混合鹽堿處理液，分別進行混合鹽堿（200 mmol·L?1，堿性鹽比例遞增）脅迫及混合鹽堿+外源NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP，150 μmol·L?1）噴施處理，噴施100 mL SNP后24 h，每盆噴施100mL混合鹽堿，均勻噴施于葉片上。共計12個處理（表1），每個處理3個重復。在處理后第9天收集葉片，于?80 ℃的冰箱中儲存，用于后續的實時熒光定量試驗。

1.2 藜麥SOD 基因家族的鑒定

以擬南芥的7個SOD 基因編碼的氨基酸序列（CAA43270、AAD10208、AAC24833、AAA32791、CAA73188、AAC24834 和AAC24832）為比對序列，通過BLAST搜索藜麥氨基酸序列文件，藜麥的基因組、氨基酸序列以及GFF 注釋文件來自Phytozome 數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。使用Pfam（https：//pfam.xfam.org/）[20]、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）與NCBICDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）數據庫獲得和鑒定候選蛋白質序列，CqSOD 家族最終由SOD保守結構域的蛋白質序列確定。

1.3 理化特性及亞細胞定位

使用ProtParam 工具（http：//web. expasy. org/protparam/）計算CqSOD蛋白的理化特性，包括氨基酸數、分子量、理論等電點（isoelectric point，pI）和親水性的總平均值。用ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/）預測CqSOD蛋白的亞細胞定位。

1.4 CqSODs 的二級和三級結構與染色體定位

采用ExPASy（https：//www.expasy.org/）提供的SOPMA 和SWISS MODEL 在線服務器分析CqSODs的二級和三級結構。通過分子可視化軟件VMD（https：//www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）檢測蛋白質的三級結構。使用NetPhos 3.1 Server分析CqSOD的磷酸化位點。通過NetOGlyc-4.0分析糖基化位點。根據藜麥GFF文件，預測CqSOD 基因在染色體上的位置。

1.5 CqSOD 的基因結構與保守基序預測

CqSOD 基因家族的cDNA和DNA序列取自基因組數據庫。利用基因結構展示服務器GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對其基因結構進行分析，并解析各CqSOD 的內含子分布模式。使用默認設置的MEME Suite（http：//meme-suite.org/）預測保守的蛋白質基序。

1.6 CqSOD 的系統發育樹構建

為研究不同植物之間SODs 的系統發育關系，使用Clustal W 以默認參數比對多個SOD蛋白序列，并使用MEGA X.10.0.5 使用鄰接（neighborjoining，NJ）方法和Poisson model 模型，引導程序設置1 000次重復，構建系統發育進化樹。

1.7 CqSOD 基因的啟動子序列分析及蛋白互作網絡圖的構建

分析CqSODs 啟動子中的順式元件有助于了解基因表達調控的信息。每個CqSOD 基因起始密碼子的2.0 kb上游序列作為啟動子區。然后，使用PlantCARE 服務器（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html）預測CqSOD 基因啟動子中的順式元件，通過TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）中的啟動子可視化工具繪制啟動子的分布圖。為預測藜麥中SOD家族的蛋白質-蛋白質相互作用網絡，使用與藜麥SOD 基因直系同源的擬南芥SOD 基因通過STRING構建網絡圖。

1.8 混合鹽堿及SNP 處理下CqSOD 基因家族的實時定量PCR

使用HiPure HP Plant RNA Mini Kit（Magen）提取總RNA。使用NanoDrop 2000C 分光光度計（Thermo）評估提取RNA的純度和質量濃度，以無RNase水作為空白。用HiScript Ⅱ Q RT SuperMixⅡ（Vazyme Biotech Co.， Ltd.）合成cDNA。將單次40 μL反應中約1 μL（1 000 ng·μL?1）的總RNA反轉錄合成cDNA，稀釋50 倍備用。按照ChamQTMSYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech Co.， Ltd.）說明書中方法，在Roche LightCycler 96 PCR 系統中進行qRT-PCR分析。20 μL反應體系包含10 μLSYBR qPCR Master Mix、5 μL 稀釋cDNA、0.5 μL正向和反向引物（10 μmol·L?1）（引物序列見表2）和4 μL ddH2O。反應程序如下：95 ℃變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個循環。每個基因進行3次重復。CqActin （GenBank accession：LOC110715281）用作標準化CqSOD 基因表達的內部對照。使用2-ΔΔCt [21]方法計算基因的表達水平。

1.9 數據處理

使用Excel繪制圖表，使用Dunnett檢驗分析統計顯著性。

2 結果與分析

2.1 CqSOD 家族基因的鑒定及理化性質分析

基于已知擬南芥SOD 蛋白序列進行BLAST搜索以及SMART和Pfam 數據庫的鑒定，在藜麥中鑒定了12 個SOD 基因家族成員，將其命名為CqSOD01～CqSOD12。根據蛋白結構域分析，將12個CqSODs 分為3 類：Cu/Zn-SODs（CqSOD01～CqSOD06）、Fe-SODs（CqSOD07～CqSOD10）和Mn-SODs（CqSOD11～CqSOD12）。其中，CqSOD01～CqSOD06 都包含1 個保守的SOD_Cu 結構域（Pfam： PF00080），該結構域為Cu/Zn-SOD蛋白的典型特征。CqSOD07～CqSOD10 和CqSOD11～CqSOD12中都存在N端鐵/錳SOD-α發夾結構域（Pfam：PF00081）和C 端鐵/錳SOD 結構域（Pfam：PF02777），表明它們均屬于Fe/Mn-SODs亞家族。理化分析（表3）表明，12個CqSOD蛋白的氨基酸序列長度、分子量、等電點（pI）、脂肪酸指數和疏水性不盡相同。CqSOD 蛋白的氨基酸數在130（CqSOD06）～295（CqSOD11），存在較大差別；分子量在13.41～32.43 kD，pI 在 5.28～8.80。脂肪酸指數介于69.71～93.63；所有 CqSOD蛋白的疏水性指數均小于0，都屬于親水性蛋白質；不穩定指數介于15.37～41.28，其中11個蛋白質的不穩定指數小于40，屬于穩定蛋白。亞細胞定位顯示，6個Cu/Zn-SODs亞家族成員定位于細胞質，4個Fe-SODs 定位于微體，2 個Mn-SODs 成員定位于線粒體基質中。此外，潛在磷酸化位點的數量介于11～77，其中CqSOD03磷酸化位點最多（77個），潛在的磷酸化位點越多，多功能的可能性就越大。

2.2 CqSOD 蛋白結構及染色體定位分析

蛋白質的結構分析對于了解其功能具有重要意義。二級結構預測分析（表4）表明，CqSOD蛋白主要由α螺旋、延伸鏈和無規卷曲組成，5個Cu/Zn-SODs中無規則卷曲>延伸鏈>α螺旋；所有的Fe-SODs與Mn-SODs的二級結構組成均為無規則卷曲>α 螺旋>延伸鏈。染色體定位顯示，除CqSOD06、CqSOD07 定位于同一染色體外，其余10個基因均定位于不同的染色體上。

三級結構分析表明， 所有Cu/Zn-SODs 和Fe-SODs 都是同源二聚體，Mn-SODs 都是同源四聚體。除了CqSOD03與CqSOD04外，所有CqSODs都有不同數量的金屬離子結合位點，其中CqSOD01、CqSOD02、CqSOD05 與CqSOD06 螯合2 個銅離子，CqSOD07～CqSOD10 螯合2 個鐵離子，CqSOD11～CqSOD12 螯合4 個錳（Ⅱ）離子。以上3 種金屬離子全部通過非共價鍵與肽鏈結合。

2.3 基因結構與基本基序分析

基于CqSODs 的cDNA和相應的DNA序列分析基因結構（圖1），所有CqSOD基因均含有4～7個內含子，其中，4 個CqFe-SODs、1 個CqMn-SODs（CqSOD11）和1個CqCu/Zn-SODs（CqSOD11）均包含7個內含子，CqSOD06 包含最小數量的內含子（4個）。此外，在8個基因的兩端發現了UTR非編碼區。值得注意的是，CqSOD08 和CqSOD10，CqSOD07 和CqSOD09 在基因結構上表現出高度相似性，它們的cDNA和DNA序列高度一致，表明這2對Fe-SOD 基因很可能是重復的。

利用MEME 軟件分析保守基序，共鑒定出10個保守基序（圖2），在3個亞族間可以清晰觀察到motif 的差異。其中，與Cu-Zn 結構域（PF00080）相關的motif 1 在6 個Cu/Zn-SOD 中都能觀察到，motif 5 與motif 6 僅存在于Cu/Zn-SOD蛋白中。所有Fe-SOD和Mn-SOD都包含motif 2、motif 3與motif 4，這些基序涉及C端Fe/Mn SOD結構域（PF02777）。motif 2包含Mn-SODs和Fe-SODs的保守金屬結合域“DVWEHAYY”，motif 7、motif 8與motif 9僅存在于Fe-SODs中。

2.4 藜麥SOD 蛋白系統發育分析

為更準確地預測CqSODs 的功能，進一步探討SOD蛋白在不同物種間的進化關系，對擬南芥、水稻、小麥、陸地棉等5個物種的SOD蛋白氨基酸序列進行了系統發育分析（圖3）。系統發育樹顯示，SOD蛋白可分為3個亞族，其中第Ⅰ亞族均為Cu/Zn-SODs，第Ⅱ亞族均為Fe-SODs，第Ⅲ亞族均為Mn-SODs。此外，在藜麥中存在6對旁系同源基因（CqSOD01/CqSOD02、CqSOD03/CqSOD04、CqSOD05/CqSOD06、CqSOD07/CqSOD09、CqSOD08/CqSOD10、CqSOD11/CqSOD12）。上述結果表明，SOD 基因在整個進化過程中可能發生了基因丟失或復制事件，特定SOD 基因成員的獲得和損失導致其基因功能的差異。

2.5 CqSOD 蛋白互作分析

為探索藜麥SOD 蛋白及其調控功能之間的關系，使用STRING軟件構建了擬南芥和藜麥之間的SOD家族蛋白互作網絡（圖4）。根據預測，CqSOD 蛋白出現在已知的擬南芥SOD蛋白互作網絡中。CqSOD 和AtSOD 蛋白之間存在密切關系，暗示可以通過已知AtSOD 基因的功能預測CqSOD 基因的未知功能。結果顯示，藜麥CqSOD12與11個CqSOD蛋白及4個CqCAT蛋白相互作用，而擬南芥中SOD 與CAT 基因在應對多種生物脅迫及非生物脅迫中起著關鍵作用，推測藜麥中SOD 基因可能具有類似的功能。

2.6 CqSOD 基因啟動子元件分析

為進一步確定CqSOD 在各種脅迫下的作用，分析CqSOD 基因啟動子序列中的順式元件（表5），CqSOD 基因家族的啟動子區域富含非生物脅迫順式調節元件和植物激素反應元件。順式元件分為激素反應性、應激反應性和組織特異表達3個亞族。激素響應方面，參與ABA反應的順式調節元件（ABRE）廣泛存在于所有的CqFe-SODs 與CqMn-SODs 的啟動子區，參與MeJA反應的順式調節元件（TGACG 基序）在大多數CqCu/Zn-SODs、CqFe-SODs 與CqMn-SODs 的啟動子區均有發現。而參與SA反應的順式調節元件（CCATCTTTTT基序）在所有的CqFe-SODs 的啟動子區均存在。在壓力響應方面，與低溫脅迫相關的響應元件存在于CqSOD02～CqSOD04、CqSOD06， CqSOD10 與CqSOD11 的啟動子區，CqSOD02、CqSOD07、CqSOD11 與CqSOD12 的啟動子具有1個與干旱誘導相關的MYB結合位點。CqSOD06～CqSOD08、CqSOD11 與CqSOD12 的啟動子區具有與應急反應相關的元件。在組織特異表達方面，ARE元件參與厭氧反應，存在于所有的CqSOD 中（除CqSOD07），且在CqSOD03 的啟動子區具有7 個ARE元件。CAT-box元件是與分生組織表達有關的順式作用調控元件，存在于CqSOD05 與CqSOD11 的啟動子區。CqSOD08 的啟動子具有MYB結合位點，參與黃酮類生物合成基因調控，暗示CqSOD08 可能與黃酮類生物合成有關。O2-site是玉米醇溶蛋白代謝調控順式調控作用元件，以單拷貝的形式存在于CqSOD01、CqSOD02、CqSOD05、CqSOD08 與CqSOD12 的啟動子區。

2.7 CqSODs 在混合鹽堿脅迫下的qRT-PCR分析

為了解藜麥SOD 基因的作用，使用qRT-PCR分析SOD 基因在混合鹽堿脅迫下的表達模式（圖5）。與CK 相比，CqSOD 基因在不同處理下的表達水平存在顯著差異，其表達模式具有復雜性。然而總體上可以觀察到3個亞族基因間（6個Cu/Zn-SOD、4個Fe-SOD 和2個Mn-SOD 基因）具有相似的表達模式。本研究發現，不同比例的混合鹽堿處理均顯著誘導了SOD 基因的表達，對于不同組合的鹽堿處理而言，E處理下11個CqSOD 基因（除CqSOD12）的表達量均達到最大值，A處理下12個CqSOD 基因的表達量均較CK增加最少。而在外源施加150 μmol·L?1 的SNP 后，6 個Cu/Zn-SOD （CqSOD01～CqSOD06） 與4 個Fe-SOD（CqSOD07～CqSOD10）基因的表達量在A+處理下達到最大值。

3 討論

長期以來，逆境脅迫不斷制約著作物的生產。超氧化物歧化酶（SOD）在植物應對鹽、干旱和金屬毒性等不同脅迫中發揮著重要作用，SOD 基因家族廣泛分布于多種植物中，如擬南芥、谷子[22]、水稻[23]、高粱[24]、棉花、番茄[13]、楊樹[15]和日本落葉松[25]等。本研究對藜麥SOD 家族基因進行了系統和全面的全基因組進化分析，結果顯示，SOD 參與了大量氧化過程，是保護植物免受ROS侵害的關鍵酶，是所有抗氧化酶中的核心酶，是最早參與清除活性氧的物質之一。當植物應答逆境脅迫時，SODs 可清除生物在脅迫下產生的過量活性氧，從而有效減少氧化應激。SOD 基因在植物適應非生物脅迫中的重要作用已被大量研究所證實，例如植物的異質表達賦予了它們對多種非生物脅迫的耐受性[26]。本研究在藜麥基因組中鑒定了12個CqSOD基因，SOD蛋白的氨基酸分子量在13.41～32.43 kD，呈現出顯著的變化。此外，進化枝之間的差異可能與外顯子/內含子的不同功能和多樣性以及保守的基序結構有關。根據結構域和基序將其分為3 種類型（6 個Cu/Zn-SOD、4 個Fe-SOD 和2 個Mn-SOD），其成員數量高于擬南芥（7 個）、蒺藜（7個）、番茄（8個）、水稻（8個）、谷子（8個）和黃瓜（9 個），與葡萄（10 個）、香蕉（13 個）相近[11]。然而，Cu/ZnSOD、Fe-SOD 和Mn-SOD 的基因數量在不同物種中出現差異，例如谷子和番茄中有4個Cu/Zn-SODs、3個Fe-SODs 和1個Mn-SOD，而本研究發現了6 個Cu/Zn-SODs、4 個Fe-SODs 和2 個Mn-SODs。SOD 家族成員數量的差異可能是由不同物種的基因組大小不同或基因重復造成的。亞細胞定位進一步研究了SOD 之間的多樣性，12個SOD 基因分別定位于細胞質（50%）、微體（33%）、線粒體（17%），CqSOD基因的定位需要進一步研究證實。

研究表明，藻類和苔蘚植物中僅有Fe-SOD 和Mn-SOD，而不存在Cu/Zn-SOD，Cu/Zn-SOD 僅出現于高等植物中，這意味著Fe-SOD 和Mn-SOD 進化時間較早[27]。隨著地球環境的不斷變化，植物面臨的逆境挑戰變得更加復雜。Fe-SOD 和Mn-SOD 不足以應答復雜的逆境，因此進化出了功能更復雜的Cu/Zn-SOD 以抵御不利的外部環境條件，保證植物的正常生長發育[28]。

基因結構分析表明，12個CqSOD 基因內含子數量不一。已有研究表明，植物SOD 基因的內含子模式高度保守，并且在大多數細胞質和葉綠體SOD 中存在7 個內含子[29]。同樣，本研究中6 個CqSOD 基因包含7個內含子。SOD 基因結構的差異可能歸因于外顯子/內含子的插入/缺失機制[30]。值得注意的是，CqSOD08 和CqSOD10，CqSOD07和CqSOD09 表現出相似的內含子/外顯子組織模式，它們編碼的蛋白質高度一致，并在系統發育樹中聚集在一起。但是，它們啟動子中的順式元件不同，表明它們可以對不同的逆境條件作出反應。內含子和外顯子變異在不同基因的進化中起主要作用。內含子/外顯子和基序結構的變化表明，不同物種之間SOD 基因存在高度的復雜性。

通過對SOD 基因啟動子中的順式元件分析發現，CqSOD 基因存在與非生物脅迫和激素反應相關的2種主要類型的順式元件以及與發育過程和組織特異性表達相關的順式元件。在SOD 基因啟動子中鑒定出一系列與非生物脅迫反應相關的順式元件，如MBS、LTR、富含TC 的重復序列，它們可能在多種脅迫下調節基因表達。擬南芥、香蕉、水稻、番茄、楊樹、棉花和其他不同植物中的大多數SOD 基因可以被誘導響應各種非生物脅迫，如熱、冷、干旱和鹽度[13，27]，與本研究結果一致。

非生物脅迫導致的過量ROS 會對藜麥幼苗及產量構成威脅。SOD在各種非生物脅迫引起的植物ROS清除響應中發揮著積極作用[31]。藜麥對混合鹽分的具體響應尚不清楚，qRT-PCR使了解CqSOD 基因在藜麥應答混合鹽堿脅迫中的功能成為可能。基于對CqSOD 基因啟動子的順式元件的評價，發現主要存在于光、非生物脅迫和激素反應相關的3種主要順式元件類型。CqSOD 啟動子中的順式元件包括富含TC的基序、LTR基序、MBS 基序、ARE 基序和ABRE 基序，為參與非生物脅迫反應提供了可能。這些基序參與了植物對非生物脅迫的響應，例如香蕉、番茄、蕓苔屬植物、煙草和小米[32-34]。本研究中，12個CqSOD 基因在混合鹽堿脅迫下的表達水平發生了顯著變化，同時對混合鹽堿處理的幼苗外源施加SNP也顯著誘導了CqSOD 基因的表達，表明藜麥SOD 基因在鹽堿脅迫反應中發揮著重要的調控作用。上述結果表明，CqSOD 在鹽脅迫期間對ROS的解毒具有積極作用，而SNP則不同程度提高了在混合鹽堿脅迫期間CqSOD 基因對ROS的解毒能力。

參 考 文 獻

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（責任編輯：胡立霞）