北京歐文氏菌4個糖基轉移酶活性測定及蛋白相互作用分析

常曉寧 郭金英 榮成博 谷彤彤 劉宇

摘要：北京歐文氏菌（Erwinia beijingensis）可引起刺芹側耳細菌性軟腐病，為明確該病原菌中糖基轉移酶的功能，以糖基轉移酶基因為研究對象，構建重組表達載體進行表達純化；并測定蛋白活性，分析蛋白間相互作用。結果表明，成功構建了原核表達載體，獲得4個可溶性蛋白。經親和層析柱純化獲得MshA、WbnH2、EpsH及TuaG 蛋白，活性測定顯示4 個蛋白均可以利用UDP-糖，并優先利用UDP-半乳糖。GST pull down 證實WbnH2及TuaG蛋白分別與MshA及EpsH蛋白在體外具有相互作用。以上研究結果為進一步研究北京歐文氏菌糖基轉移酶基因功能奠定了基礎。

關鍵詞：北京歐文氏菌；軟腐病；糖基轉移酶；原核表達

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0736

中圖分類號：Q933 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）01012508

軟腐病作為一種重要的侵染性病害，給農業生產帶來了嚴重的經濟損失[1-4]。近年來，刺芹側耳細菌性軟腐?。╞acterial soft-rot disease）在韓國[5]及中國的北京[6]、廣州[7]等地均有發現。感染該病害的子實體上出現水漬狀病斑，嚴重時整個子實體腐爛[89]。本課題組前期鑒定表明，北京地區刺芹側耳細菌性軟腐病的病原菌為北京歐文氏菌（Erwinia beijingensis），該病原菌上存在1 個和多糖合成相關的可移動元件，推測其與致病性相關。胞外多糖是由細菌分泌、暴露在細胞表面的多糖[1011]，可以保護細菌免受干燥等惡劣環境的影響[12]，對病原菌的毒力至關重要[1314]。糖基轉移酶（glycosyltransferases，GT）是產生多種復雜糖綴合物所必需的酶[15]，負責將單糖共價連接到多種有機底物，并催化糖的附著[16]。大多數糖基化蛋白暴露于細胞表面，通常參與細胞間識別、信號轉導和免疫調節等[17]。研究證明，糖基轉移酶作為重要的毒力因子在致病過程中發揮關鍵作用[18-20]。通過分析，發現北京歐文氏菌中存在6個糖基轉移酶基因，分別為mshA、wbnH1、wbnH2、EpsH、tuaG 和1422，其中，EpsH、tuaG 及1422 基因屬于糖基轉移酶GTA 型超家族（Glycosyltransferase _GTA-type superfamily）； mshA、wbnH1、wbnH2 基因屬于糖基轉移酶GTB 型超家族（Glycosyl transferase _GTB-type superfamily）。

為進一步了解這些糖基轉移酶基因的功能，本研究擬構建糖基轉移酶基因的原核表達載體，然后轉化大腸桿菌BL21（DE3）進行誘導表達純化，并對其酶學性質進行分析，同時利用GST pulldown分析蛋白間的相互關系，旨在明確糖基轉移酶基因在北京歐文氏菌中的作用，為刺芹側耳細菌性軟腐病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

北京歐文氏菌LMG 27579T 由本實驗室分離并保存，大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

1.2.1 主要試劑 氨芐西林購自上海金畔生物科技有限公司；TBST （TBS with Tween-20， 10×）、卡那霉素、BCA 蛋白檢測試劑盒、BeyoECL Plus（超敏ECL化學發光試劑盒）購自上海碧云天生物技術有限公司；LB MILLER 肉湯培養基購自美國BD公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；NP-40裂解液、脫脂奶粉、二硫蘇糖醇購自北京酷來搏科技有限公司；一抗Anti-6×His tag 抗體[EPR20547]-ChIP Grade 購自艾博抗（上海）貿易有限公司；二抗Anti-rabbit lgG、HRPlinkedAntibody 購自美國Cell SignalingTechnology （CST）公司；Fast Blue蛋白染色液購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；Ni-NTA樹脂購買自凱杰企業管理（上海）有限公司；谷胱甘肽瓊脂糖、還原型谷胱甘肽購自sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購買于天根生化科技（北京）有限公司；無縫克隆試劑盒購買于中美泰和生物技術（北京）有限公司。JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司所用引物（表1）由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.2 培養基及主要試劑配置 LB（luriabertani）液體培養基：2 g LB粉末溶于100 mL去離子水中；LB固體培養基：2 g LB粉末，2 g瓊脂粉溶于100 mL去離子水中；121 ℃，高壓滅菌30 min。使用時根據試驗要求按照1∶1 000比例添加相應抗生素。

緩沖液A：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，pH 8.0。

緩沖液B：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5%甘油，pH 8.0。

緩沖液C：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5 mmol·L?1 DTT，5%甘油，pH 8.0。

緩沖液D：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5 mmol·L?1 DTT，0.4% NP40，pH 8.0。

緩沖液E：20 mmol·L?1 Tris-HCl，50 mmol·L?1NaCl，5 mmol·L?1 DTT，pH 8.0。

洗脫緩沖液A：20 mmol·L?1 Tris-HCl，1 mol·L?1咪唑，pH 8.0。

洗脫緩沖液B：20 mmol·L?1 Tris-HCl，20 mmol·L?1 GSH。

1×糖基轉移酶反應液：50 mmol·L?1 Tris-HCl（pH 7.5），5 mmol·L?1 MnCl2。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組質粒表達載體構建 以北京歐文氏菌LMG 27579T 基因組DNA 為模板，設計合成引物wbnH2-F 和wbnH2-R，wbnH2 基因PCR 體系（50 μL）包含：5×Phusion 10 μL，10 mmol·L?1 dNTP1 μL，正、反向引物各2.5 μL，模板DNA 1 μL，DMSO 1.5 μL，Phusion DNA 聚合酶0.5 μL。PCR程序為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。10%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠回收。利用限制性內切酶Xho I/EcoR Ⅰ雙酶切pGEX-KG載體，利用無縫克隆試劑盒將目的基因片段與pGEX-KG 質粒載體連接，連接體系（10 μL）包含：wbnH2 DNA 片段4 μL，pGEX-KG1 μL，Mix酶5 μL；50 ℃反應15 min。反應完成后將連接產物轉化至DH5α大腸桿菌中，涂布于含有50 mg·L?1氨芐西林（ampicillin，Amp）的抗性平板，37 ℃倒置過夜培養，獲得重組克?。惶崛≠|粒送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序驗證，測序正確的命名為pGEX-wbnH2。將其余5個糖基轉移酶基因委托中美泰和生物技術（北京）有限公司分別構建到pGEX-及pET-30a-載體，獲得表達質粒分別命名為pET-30a-mshA、pET-30awbnH1、pET-30a-EpsH、pGEX-6p-1-tuaG、pET-30a-1422 及pGEX-6p-1-1422。

1.3.2 重組蛋白誘導表達 將上述構建成功的重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，構建重組表達菌株并進行誘導表達。

挑取pET-30a-載體的E. coli BL21/ pET-30amshA、E. coli BL21/pET-30a- wbnH1、E. coli BL21/pET-30a-EpsH 及E. coli BL21/pET-30a-1422 菌株單克隆接種于含有50 mg·L?1 卡那霉素（kanamycin，Kan）的LB 液體培養基中，挑取pGEX-KG- 載體的E. coli BL21/pGEX-wbnH2、E.coli BL21/pGEX-6p-1-tuaG、E. coli BL21/pGEX-6p-1-1422 菌株單克隆接種于含有50 mg·L?1 氨芐西林的LB液體培養基中，37 ℃、180 r·min?1振蕩過夜培養。將所得培養物按照1∶10比例轉接到帶有相應抗生素的新鮮培養液中，培養至OD600為0.6～0.8，取出部分菌液命名為未誘導組；其余菌液加入IPTG過夜誘導，180 r·min?1振蕩過夜培養。在上述條件下，對IPTG 終濃度（0.1 mmol·L?1 和1.0 mmol·L?1）及誘導溫度（16 ℃和37 ℃）做優化和篩選。

離心收集菌體，pET-30a-載體的菌株使用緩沖液B將細胞重懸，pGEX-KG載體的菌株用緩沖液C將細胞重懸。使用超聲破碎儀在冰浴條件下對細胞超聲破碎裂解，破碎至菌液澄清，在4 ℃條件下離心（12 000 r·min?1、10 min）獲得上清液，SDS-PAGE檢測蛋白誘導情況。

1.3.3 重組蛋白純化 將上一步經誘導獲得可溶性蛋白的E. coli BL21/pET-30a-mshA、E. coli BL21/pET-30a-EpsH、E. coli BL21/pGEX-wbnH2、E. coliBL21/pGEX-6p-1-tuaG 菌株進行大量培養表達，并進行純化。

pET-30a-載體的菌株使用鎳離子金屬鰲合親和層析介質（Ni-NTA）樹脂進行純化。取500 μL的Ni-NTA鎳柱加入純化柱中，無菌水沖洗5個柱體積，緩沖液A平衡5個柱體積，將誘導后的蛋白上清液過濾上柱，并加入10 mmol·L?1 咪唑1 mL（除去非特異性結合），冰上搖動結合4 h。用緩沖液A 洗脫至無雜帶，再用洗脫緩沖液A 配置成20～300 mmol·L?1 咪唑洗脫并收集目的蛋白。SDS-PAGE 電泳檢測，利用超濾管對收集的蛋白液進行脫鹽處理。將純化好的蛋白保存于?80 ℃超低溫冰箱。

pGEX-KG-載體的菌株使用谷胱甘肽瓊脂糖進行純化。取500 μL溶解好的的谷胱甘肽瓊脂糖加入純化柱中，無菌水沖洗5個柱體積，緩沖液E平衡5個柱體積，將上清液過濾上柱，冰上搖動結合4 h，用緩沖液A洗脫至無雜蛋白，用洗脫緩沖液B洗脫并收集目的蛋白。SDS-PAGE電泳檢測，用超濾管對收集的蛋白液進行脫鹽處理。將純化好的蛋白保存于?80 ℃超低溫冰箱。

1.3.4 糖基轉移酶活性測定 利用Pomega UDPGlo糖基轉移酶測定試劑盒，參照MIDDLETON[18]的方法并稍作改進，分析4個糖基轉移酶蛋白對UDP- 半乳糖（UDP-GAL）、UDP- 葡萄糖（UDPGlucose）、UDP-尿苷葡萄糖醛酸三鈉（UDP-GlcA）的水解能力。將純化的MshA、EpsH、WbnH2、TuaG蛋白利用BCA蛋白檢測試劑盒標定蛋白含量，在不存在受體的情況下，在含有50 mmol·L?1Tris（pH7.5）和5 mmol·L?1 MnCl2 的25 μL 1×糖基轉移酶反應液中，將蛋白質與100 mmol·L?1 的單一UDP-糖在室溫下孵育30 min，添加25 μL 的UDP-Glo檢測試劑來終止水解反應，并在室溫下孵育1 h，使用酶標儀檢測發光值。

1.3.5 GST pull down 分析 ① MshA 蛋白與WbnH2、TuaG 蛋白互作分析。取500 μL 谷胱甘肽瓊脂糖（glutathione-agarose）加入到純化柱中，使用無菌水分別沖洗5個柱體積，再用緩沖液A分別沖洗5個柱體積，將WbnH2、TuaG及GST蛋白（陰性對照）的蛋白裂解液，分別加入到各層析柱中，冰上搖動結合4 h。棄流出液，使用緩沖液A沖洗柱體洗脫雜蛋白。洗脫完成后，將每個純化柱中分別加入200 μL的MshA蛋白，并用緩沖液A 補充至500 μL，冰上搖動結合4 h，4 ℃結合過夜。用緩沖液A、D沖洗柱體洗脫去除雜蛋白，用洗脫緩沖液B洗脫目的蛋白，收集樣品，加入一定量的蛋白上樣緩沖液，10% SDS-PAGE電泳檢測，同時用His 抗體進行Western-blot 檢測。用Western-blot電轉儀于300 mA 低溫轉膜1h，加入含有5%脫脂牛奶的封閉液中封閉1h，TBST（TBSwith Tween-20）洗滌，加入一抗室溫搖動孵育3 h并4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗，室溫搖動孵育1 h，TBST洗滌3次。使用超敏ECL化學發光試劑盒孵育2～3 min，用凝膠成像儀成像并拍照記錄。② EpsH蛋白與WbnH2、TuaG蛋白互作分析。方法同①。

2 結果與分析

2.1 重組載體可溶性蛋白篩選結果

對構建成功的糖基轉移酶蛋白表達載體進行小量誘導表達，同時對IPTG 濃度及誘導溫度進行篩選，結果表明E. coli BL21/pET-30a-mshA（圖1A）、E. coli BL21/pET-30a-EpsH（圖1B）、E.coli BL21/pGEX-6p-1-tuaG（ 圖1C）在16 ℃ 、0.1 mmol·L?1 IPTG 情況下誘導可獲得可溶性蛋白；E. coli BL21/pGEX-wbnH2 在16 ℃、1.0 mmol·L?1IPTG情況下誘導可獲得可溶性蛋白（圖1D）。

2.2 糖基轉移酶蛋白純化結果

對pET-30a- 載體的E. coli BL21/pET-30amshA和E. coli BL21/pET-30a-EpsH 進行大量誘導表達，并利用Ni柱純化，利用不同濃度咪唑洗脫；對pGEX-載體的E. coli BL21/pGEX-wbnH2、E. coliBL21/pGEX-6p-1-tuaG 利用谷胱甘肽瓊脂糖純化，利用GSH 洗脫。結果表明，MshA（圖2A 泳道8、9）、EpsH（圖2B泳道4）、WbnH2（圖2C泳道3）及TuaG（圖2D 泳道3）目的條帶大小正確、雜帶較少、蛋白水平相對較高，因此收集對應泳道蛋白，并利用超濾管進行脫鹽處理，保存至?80 ℃超低溫冰箱，備用。

2.3 糖基轉移酶蛋白活性測定結果

利用Pomega UDP-Glo 糖基轉移酶測定試劑盒測試4個蛋白在沒有受體底物的情況下對UDP-半乳糖（UDP-GAL）、UDP-葡萄糖（UDP-Glucose）、UDP-尿苷葡萄糖醛酸三鈉（UDP-GlcA）的水解能力，在水解后通過檢測游離UDP來評估反應，以無酶反應作為空白對照。結果（圖4）表明，4個蛋白均可以水解UDP-糖，其中4 種蛋白均優先利用UDP-半乳糖，對UDP-葡萄糖、UDP-尿苷葡萄糖醛酸三鈉的水解能力相似，無明顯差異。WbnH2蛋白對UDP-半乳糖的水解能力最強；TuaG對UDP-半乳糖的水解能力低于其他3種蛋白。

2.4 蛋白互作分析

利用GST pull down 分析WbnH2、TuaG 蛋白分別與MshA、EpsH蛋白的互作情況， SDS檢測結果（圖4）表明，蛋白目的條帶正確，可進行Western-blot 檢測。Western-blot 檢測結果（圖5）表明， WbnH2、TuaG蛋白分別與MshA、EpsH蛋白結合后，western-blot能檢測到MshA、EpsH 蛋白，而GST蛋白與MshA、EpsH蛋白結合洗滌去除非特異結合后，Western-blot檢測不到，說明WbnH2、TuaG蛋白分別與MshA、EpsH蛋白在體外具有相互作用。

3 討論

病原細菌分泌的胞外多糖有助于細菌入侵宿主 [4]，同時影響細菌的多種行為。研究表明，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）[14]、水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、沙門氏菌（Salmonella）[21]等引起宿主致病的原因均與胞外多糖有關。細菌多糖由糖基轉移酶（GT）合成，GT是個酶家族，負責將碳水化合物殘基從供體轉移至受體底物[22]。報道指出，糖基轉移酶是重要的毒力因子，如糖基轉移酶MoGt2 在稻瘟病菌發病機制中起重要作用[23]；嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）中的2型糖基轉移酶基因fpgA 與毒力相關[24]；布魯氏菌屬（Brucellaspp.）中的糖基轉移酶促進多糖的產生[25]。糖基轉移酶相互作用介導病原菌對宿主的黏附，侵入性致病菌不可分型流感嗜血桿菌（nontypeableHaemophilus influenzae， NTHi）可引發中耳炎等疾病，其糖基轉移酶HMW1C/2C將黏附蛋白HMW1/2糖基化，從而黏附于宿主上皮細胞，導致宿主發病[26]；Fap1是一種黏附素，糖基轉移酶Gtf1與Gtf2互作，增強Gtf1對黏附素Fap1的糖基化修飾，從而增強副血鏈球菌（Streptococcus parasanguinis）對宿主的致病能力[27]。

本研究從北京歐文氏菌中篩選出6個糖基轉移酶基因，為了解其蛋白特性，分別將目的基因克隆入pET-30a 及pGEX 載體，構建了重組表達質粒，并進一步用質粒轉化BL21（DE3）感受態細胞，利用IPTG誘導4個基因，獲得可溶性表達蛋白。4個糖基轉移酶蛋白對UDP-半乳糖有較強的水解能力，且蛋白在體外存在相互作用，為進一步研究糖基轉移酶基因在北京歐文氏菌中的作用奠定了基礎。

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（責任編輯：張冬玲）