孕激素相關子宮內膜蛋白在胃癌早期診斷、預后中的作用

張保根 楊澍 陳斌妮 陳文 鄭梓瑩 張燕

為使用生物信息學系統分析孕激素相關子宮內膜蛋白（Progestagen-associated endometrial protein， PAEP）在胃癌中的早期診斷和預后預測性能及免疫浸潤相關性，該研究構建預測模型ROC曲線和偏差校正曲線檢驗其性能準確性，并通過細胞實驗進一步驗證分析結果.生信分析結果顯示，與正常組織相比，胃癌組織中PAEP的表達較高，在早期（T1期、N0期、M0期）即有統計學意義（ P ＜0.001），且診斷胃癌的準確性較高（ROC曲線下面積為0889）；PAEP高表達的胃癌患者預后較差（ P ≤0.001）；TNM分期越晚，年齡越大，PAEP表達越高，胃癌患者生存概率越低，偏差校正曲線接近理想曲線（45°線），顯示預測結果良好；PAEP的表達與胃癌中的中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤水平呈正相關趨勢，與B細胞、中央記憶型T細胞、T細胞呈顯著的負相關趨勢.qRT-PCR和Western blot結果顯示，HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS細胞中PAEP基因轉錄水平和蛋白表達水平均顯著高于GES-1. 結果表明了PAEP 蛋白可用于胃癌診斷和預后的生物標志物，并進行了實驗驗證，其機制與免疫有關.

胃癌； 孕激素相關子宮內膜蛋白； TCGA； 生存分析； 免疫浸潤

R73-3 A 2024.016002

The role of Progestagen-associated endometrial protein in ?early diagnosis and prognosis of gastric cancer

ZHANG Bao-Gen， YANG Shu， CHEN Bin-Ni， CHEN Wen， ZHENG Zi-Ying， ZHANG Yan

（The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000， China）

To use a bioinformatics system to analyze the early diagnosis and prognosis prediction performance and immune infiltration correlation of Progestagen-associated endometrial protein （PAEP） in gastric cancer， this study constructed a predictive model ROC curve and deviation correction curve to test its performance accuracy， and further validate the analysis results through cell experiments. The results of bioinformatics analysis showed that the expression of PAEP in gastric cancer tissues was higher than that in normal tissues， which was statistically significant in the early stages （T1， N0， M0） （ P ?< 0.001）， and the diagnostic accuracy of gastric cancer was higher （the area under ROC curve was 0889）. The prognosis of gastric cancer patients with high expression of PAEP was poor （ P ?≤ 0.001）. The later the TNM stage， the older the age， the higher the expression of PAEP， and the lower the survival probability of gastric cancer patients， and the deviation correction curve was close to the ideal curve （45 ° line）， indicating a good predictive result. The expression of PAEP was positively correlated with the infiltration level of neutrophils and macrophages in gastric cancer， and negatively correlated with B cells， central memory T cells and T cells. qRT-PCR and Western blot results showed that the transcriptional and protein expression levels of PAEP in HGC-27， BGC-823， MKN-45， SGC-7901 and AGS cells were significantly higher than those in GES-1 cells. The results indicate that PAEP protein can be used as a biomarker in the diagnosis and prognosis of gastric cancer， which is verified by experiments， and its mechanism is related to immunity.

Gastric cancer; Progestagen-associated endometrial protein; TCGA; Survival analysis; Immune infiltration

1 引 言

胃癌（Gastric Cancer， GC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，是全球死亡率排名第四的癌癥 ?［1］ .我國是目前全球胃癌發病率最高的國家，且居癌癥死亡原因第三位 ?［2，3］ .目前，早期診斷、治療胃癌的手段仍存在很多不足之處，胃癌的手術治療作為唯一能夠根治的手段，常因早期診斷方法的限制、早期癥狀隱匿不被察覺而難以實施，多數患者一經診斷即為晚期，預后不盡人意 ?［4］ .雖然胃癌的篩查方法多種多樣，但這些篩查方法仍存在著靈敏度及特異度不佳等諸多問題 ?［5，6］ ，難以在臨床中廣泛篩選出胃癌患者.因此，提高胃癌檢出率，挖掘更靈敏、更特異的胃癌潛在的診斷、免疫和預后生物標志物已經受到越來越多研究者的關注.

孕激素相關子宮內膜蛋白（Progestagen-associated endometrial protein， PAEP）是一種糖蛋白，近年人們通過研究發現PAEP能夠促進腫瘤細胞的遷移侵襲 ?［7-9］ .有研究 ?［9-12］ 發現PAEP在多種惡性腫瘤中特異性表達，與癌癥患者的診斷和預后密切相關，并且可以影響腫瘤免疫微環境從而導致腫瘤免疫逃脫，但目前國內外有關PAEP在胃癌發生發展及臨床意義方面的研究相對較匱乏.

本研究將采用生物信息學方法，分析PAEP基因表達與胃癌的相關性，通過對腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas， TCGA）數據庫挖掘和分析，探討PAEP在胃癌中的早期診斷和預后預測性能及免疫浸潤相關性，最后通過qRT-PCR和Western blot技術進一步進行試驗驗證，證明PAEP在胃癌細胞中高表達，旨在提高對早期胃癌的檢出率，盡早行之以有效的治療，并為臨床上該病的診斷提供新的思路，爭取做到“早發現，早干預”，提高患者生存質量.

2 材料與方法

2.1 數據源

TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）是一個大規模癌癥研究參考數據庫，目前收錄了33種癌癥的臨床和病理信息.本研究的胃癌患者RNA-Seq的表達數據和匹配臨床病理信息是來源于TCGA的STAD項目中對應的正常組織數據以及泛癌數據，因來源是同一個項目，使用的設備、采用的材料方法以及選用參數是相同的，故不需要再進行標準化處理.TCGA數據庫是開放訪問和公開使用的，因此不需要得到當地倫理委員會的批準.

2.2 方 法

2.2.1 表達差異分析 ?轉換與整理數據后，運用R 3.6.3軟件的ggplot2包對正常癌旁組織與胃癌組織的數據進行PAEP基因表達的差異分析.進一步對臨床數據分析，根據不同TNM分期的患者進行基因表達差異性比較.同時繪制ROC曲線，計算曲線下面積AUC值以評估PAEP診斷胃癌的準確性.

2.2.2 生存分析 ?為了探究PAEP的表達水平是否影響胃癌患者的臨床結果，本研究使用R 363軟件的survival包對患者的生存資料進行統計分析，并通過survminer包作可視化處理，構建Kaplan-Meier（K-M）生存曲線來比較PAEP高低表達患者間的生存差異.

2.2.3 單因素和多因素Cox回歸分析 ?使用R 3.6.3軟件的survival包進行Cox回歸分析，進一步確定PAEP表達在胃癌患者中的影響.為控制混合偏倚，聯合單因素與多因素Cox回歸分析來評估與胃癌患者生存率相關的預后因素.當 P 值小于0.05時，該預后因素在回歸分析中具有統計學顯著性.

2.2.4 預測因素Nomogram分析 ?為了提供一種預測胃癌患者預后的定量方法，基于單因素及多因素回歸模型的結果，選擇其中的預后因素建立列線圖，個性化分析1、3、5年的預測生存概率.運用R 3.6.3軟件的RMS包與survival包對獨立預后因素的數據進行校準與Nomogram分析，生成包含顯著臨床特征和校準圖的列線圖.校準曲線通過將列線圖預測概率與觀測到的概率相映射以進行圖形評估，45°線代表最佳預測值.使用一致性指數以確定列線圖的區分度，并比較列線圖和單獨預后因素的預測準確性.所有統計學檢驗均為雙尾檢驗，研究的統計學顯著性水平設置為0.05.

2.2.5 免疫浸潤相關分析 ?利用R 3.6.3軟件的GSVA包進行免疫浸潤相關分析，具體算法為GSVA包的內置算法ssGSEA，相關性分析方法選用Spearman分析.

2.2.6 細胞培養 ?將人胃癌HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS細胞株以及正常胃上皮細胞株GES-1（細胞均購自中國科學院上海細胞庫）接種至加有加10%胎牛血清，青霉素（100 U/mL）以及鏈霉素（100 U/mL）的1640-DF12培養基中培養，置于5% CO 2，37 ℃，飽和濕度的培養箱中培養，隔天更換培養基.

2.2.7 qRT-PCR法檢測PAEP mRNA表達 ?將人胃癌HHGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS細胞株以及正常胃上皮細胞株GES-1培養后，Trizol試劑（貨號15596026，Thermo Fisher Scientific）用于提取各細胞株的總mRNA，并按照試劑盒說明進行逆轉錄操作，合成cDNA，利用qRT-PCR法檢測PAEP mRNA表達水平，在qRT-PCT儀（ABI 7500 Fast Real-Time PCR System，Thermo Fisher Scientific）以95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s進行循環，循環40次.取PCR產物8 μL加 5× Loading Buffer 2 μL 2%瓊脂糖凝膠電泳 120 V ，100 mA，30min溴化乙錠染色，凝膠成象儀成象并保存結果.采用2-△△CT法計算mRNA的相對表達量.

2.2.8 Western Blot檢測細胞中PAEP蛋白表達 ?提取細胞株總蛋白，并使用BCA法進行蛋白濃度定量操作.細胞裂解液置于聚丙烯酰胺凝膠泳道中，電泳分離并利用轉膜儀轉膜過夜，將蛋白質轉移到PVDF膜上，利用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入以1∶1000稀釋的一抗，在4 ℃溫度下過夜，內參基因為GAPDH.TBST洗膜3次，加入1∶1000稀釋的二抗，室溫下震蕩1 h，TBST洗滌3次，化學發光法顯色、顯影，蛋白條帶采用化學發光成像系統進行分析.

2.2.9 統計學分析 ?實驗數據以均數±標準差（ ?x±ｓ ） 表示，利用SPSS 25.0進行統計學分析，多組之間比較利用單因素方差分析，組間兩兩比較利用t檢驗.差異有統計學意義的標準為 P <0.05.

3 結 果

3.1 臨床特征

來自TCGA的375個胃癌樣本和32個正常癌旁組織樣本的RNA測序數據和詳細的臨床信息資料被納入本研究中.在去除重復樣本后，表2總結了胃癌患者中PAEP高表達與低表達的臨床信息，包括TNM分期、病理階段、主要治療效果、性別、年齡、殘留腫瘤、組織學分級等信息.

3.2 基因差異分析結果

圖1中，A為非配對樣本的差異基因分析，腫瘤組PAEP的表達量明顯高于正常對照組，且差異具有統計學意義（ P ＜0.001）.B為配對樣本的差異基因分 析，來自同一個病人的樣本同樣表現出??PAEP表達量胃癌組織高于正常組織，進一步能說明PAEP的表達與胃癌相關.圖2的亞組分析對TNM不同分期的正常人與胃癌患者進行差異性分析，結果顯示正常人與不同分期的胃癌患者的PAEP表達均有顯著差異，胃癌患者的樣本中PAEP呈高表達.在TNM分期的早期（T1期、N0期、M0期），PAEP的表達量就明顯高于正常對照組，提示PAEP可能有利于胃癌患者的早期篩查.繪制ROC曲線進一步評價PAEP診斷胃癌的準確性，曲線下面積AUC值為0.889，說明PAEP對于胃癌診斷的準確性較高，見圖3.

3.3 生存分析結果

借助K-M生存曲線評估預測模型的預測能力，結果表明PAEP表達較高的胃癌患者總體生存率、疾病特異性生存率、無進展生存率均較低，預后較差，且差異具有統計學意義（ P ≤0.001），見圖4.

3.4 預后因素Nomogram分析

在基于多因素Cox回歸分析的列線圖中，將胃癌患者TNM期、年齡與PAEP表達的積分相加得 到總分，總分越高，胃癌患者在1年、3年和5年的生存概率越低（圖5a），并通過模型擬合分析列線圖的預測效率（圖5b）.結果表明，TNM分期越晚，年齡越大，PAEP表達越高，胃癌患者生存概率越低.校準圖中的偏差校正線接近理想曲線（45°），顯示預測結果良好，且1年的生存概率更接近理想情況.

3.5 基因PAEP與浸潤性免疫細胞的相關性分析

腫瘤相關的浸潤性淋巴細胞會影響腫瘤患者的生存率，本研究分析了PAEP的表達與24種浸潤性免疫細胞的相關性.結果顯示PAEP的表達與中性粒細胞（ P ＜0.001）、巨噬細胞（ P ＜0.05）、B細胞（ P ＜0.001）、中央記憶型T細胞（ P ＜0.001）、T細胞（ P ＜0.001）密切相關，前二者為正關聯關系，后三者為負關聯關系.

3.6 胃癌細胞中PAEP表達情況

qRT-PCR結果顯示，胃癌（HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS）細胞mRNA表達比正常胃上皮（GES-1）細胞中表達高，經組間t檢驗比較得出，升高具有統計學意義（ P <0.01）.Western blot結果顯示，PAEP蛋白條帶在胃癌（HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS）細胞中明顯，通過化學發光成像系統以及灰度統計進行分析，發現胃癌（HGC-27、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和AGS）細胞相較于正常胃上皮（GES-1）細胞PAEP蛋白表達明顯升高（ P <001），如圖8.

4 討 論

胃癌作為我國最常見的惡性腫瘤之一，已成為困擾我國人民的一個重要公共衛生問題 ?［13，14］ .胃癌在世界上的發病率和死亡率也一直處于居高不下的地位，因其早期癥狀的隱匿性，導致很多患者錯失治療最佳時期，是危及人民生命健康，全世界關注并且急需早日解決的的重大難題 ?［15］ .

許多研究 ?［16-19］ 發現，PAEP異常表達于多種惡性腫瘤組織，且與腫瘤的多種重要生物學行為息息相關，但其中與胃癌相關的報道較少，PAEP在胃癌的分期、預后中的關系仍不甚明確.胃癌一旦發生轉移，治療就將會變得十分困難.Riker等提出在在腫瘤發展的不同階段，一些基因會過表達而另一些則會低表達，如胃蛋白酶，骨髓增生異常白血病因子1相互作用蛋白等表達就與胃癌發生發展有關 ?［20-22］ .這為探索胃癌發展過程中的分子機制，嘗試找出PAEP與胃癌診斷、免疫和預后的聯系提供了新的線索.

本研究基于TCGA數據庫進行生物信息學分析，對PAEP表達與胃癌發生發展、預后及免疫之間的關系進行探究.結果表明，PAEP可能是胃癌早期診斷、預后的潛在標志物，與正常對照組相比，其在胃癌組中呈高表達，且兩組差異具有統計學意義（ P ＜0.001）.PAEP表達與生存時間、預后相關，PAEP表達越高，胃癌患者生存概率越低，預后越差，尤其在早期的胃癌（T1期、N0期、M0期）中有較顯著的預測效應.ROC曲線是一種用于預測準確率情況的統計學模型，在醫學上常用于判斷某種因素對于某種疾病的診斷是否有診斷價值 ?［23］ .ROC曲線下面積（AUC）常用作評價預測模型優劣的定量指標，一般而言，AUC為0.5時表示無預測意義，0.7至0.8被認為是可接受的，0.8至0.9被認為是優秀的，超過0.9被認為杰出的 ?［24］ .本研究構建了PAEP診斷胃癌的預測模型，ROC曲線下面積為0.889，介于0.8～0.9之間，說明PAEP作為診斷早期胃癌的標志物，準確性較高.

生存分析結果表明，PAEP高表達的胃癌患者預后較差.在臨床影響因素方面，本研究納入了影響因素進行單因素和多因素Cox回歸分析，結果顯示年齡＞65歲和治療結果中的完全緩解指標（CR）是影響TCGA胃癌患者預后的獨立危險因素.Nomogram分析是基于回歸分析的結果預測某臨床事件發生可能性的統計學方法 ?［25］ .本研究根據多因素Cox回歸分析構建了Nomogram模型，并以模型擬合分析評價Nomogram模型，校準圖中偏差校正線接近理想曲線，說明擬合度良好，可對疾病進程進行預測.預測結果表明，TNM分期越晚，年齡越大，PAEP表達越高，胃癌患者生存概率越低.

免疫浸潤方面，本研究發現PAEP的表達水平與胃癌中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤水平有顯著一致的相關性，整體呈正相關趨勢，而B細胞、中央記憶型T細胞、T細胞則與PAEP的表達水平呈顯著的負相關趨勢.Weber等 ?［26］ 經研究發現PAEP在癌癥中作為預后生物標志物具有可行性并且其作為免疫系統調節劑具有潛在的作用.有研究 ?［27，28］ ?表明，PAEP的表達與巨噬細胞有強相關性，糖蛋白A（Glycodelin A， GdA）屬于PAEP亞型的一種，其能抑制單核細胞的增殖，并誘導單核細胞凋亡.PAEP與T細胞、B細胞的表達水平也有較強相關性，整體呈顯著的負相關趨勢，如GdA使T細胞不能對IL-2作出反應，從而刺激細胞周期停滯、效應功能喪失和不同T細胞亞群的凋亡 ?［29］ ；GdA能抑制B細胞的增殖，但是不能誘導其凋亡 ?［30］ .

為進一步驗證PAEP在胃癌中的作用，本研究利用qRT-PCR和Western blot的實驗方法檢測了PAEP基因與蛋白表達在胃癌細胞與正常胃上皮細胞中的差異，qRT-PCR結果顯示胃癌細胞中PAEP基因的表達明顯升高.Western blot結果顯示胃癌細胞中PAEP蛋白的表達明顯升高.

綜上所述，PAEP的高表達與胃癌的進展、預后不良以及免疫細胞浸潤有關，可作為胃癌潛在的早期診斷、預后及免疫標志物.但本研究尚待進一步的臨床實驗以驗證預測結果.

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收稿日期： ?2023-02-17

基金項目： ?福建省中醫藥科研課題（2017FJZYLC502）

作者簡介： ??張保根（1986-）， 男， 江西吉安人， 碩士研究生， 研究方向為中西醫結合防治腫瘤疾病.E-mail： 395085502@qq.com

通信作者： ?楊澍. E-mail： 775648951@qq.com