小麥莖基腐病原菌定量檢測(cè)方法構(gòu)建及應(yīng)用

摘 """要：為進(jìn)一步明確天津地區(qū)小麥莖基腐病發(fā)病狀況并開展防控預(yù)測(cè)，針對(duì)小麥莖基腐兩大主要病原菌假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌，建立病原菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)體系。基于病原菌ITS序列設(shè)計(jì)并篩選出特異性引物Fpg-qrt-F/R和Bs-qrt-F/R，擴(kuò)增片段大小分別為298 bp和116 bp。以病原菌基因組為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了病原菌含量檢測(cè)方法，并對(duì)天津地區(qū)小麥莖基腐發(fā)病田小麥根際土壤及麥種中攜帶假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌的含量進(jìn)行了定量檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明：天津地區(qū)發(fā)病田塊小麥根際土壤中假禾谷鐮刀菌基因組含量為0.343 8～77.686 7 pg.g-1，小麥根腐離蠕孢基因組含量為1.685 3～844.229 0 pg.g-1。此外對(duì)15個(gè)不同地區(qū)的小麥種子進(jìn)行檢測(cè)，其中假禾谷鐮刀菌檢出率為40%，麥種帶菌量為0.261 7～0.269 0 pg.g-1，未檢出小麥根腐離蠕孢。本研究建立了病原菌熒光定量檢測(cè)體系，摸清了天津地區(qū)小麥莖基腐的發(fā)病情況，確定了病田土壤中小麥莖基腐病原菌菌量的最低閾值，為相關(guān)土傳病害的發(fā)生提供早期預(yù)警。

關(guān)鍵詞：小麥莖基腐；假禾谷鐮刀菌；小麥根腐離蠕孢菌；熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S432.1 """""""""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """"""""DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.02.002

Construction and Application of Quantitative Detection Method for Pathogenic Bacteria in Wheat Stem Base Rot

LI Guangsheng1， LI Yuejiao1， SUN Shuqin1， WANG Li2， FENG Xueliang2， YANG Xiurong1

（1. Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China;2.Agricultural Development service Center of Tianjin， Tianjin 300061，China）

Abstract： To further identify the incidence of wheat crown rot in Tianjin area and preform disease prevention and control， areal-time PCR for quantitative detection of Fusarium pseudograminis and Bipolaris sorkiniana was established. The specific primers Fpg-qrt-F/R and Bs-qrt-F/R amplified the fragment of 298 bp and 116 bp were designed based on the rDNA ITS sequence of F.pseudograminis and B.sorkiniana. A standard curve established using genome of pathogens， was used to investigate the content of F.pseudograminis and B.sorkinianain wheat rhizosphere soil and seed samples in Tianjin area. Using real-time PCR detection system， thegenomic content of F.pseudograminis and B.sorkiniana in wheat rhizosphere soil was 0.343 8-77.686 7 pg.g-1 and 1.685 3-844.229 0 pg.g-1. In addition， the detection rate of F. pseudograminis in wheat seeds samples of 15different areas was 40%， with pathogen content range of 0.261 7-0.269 0 pg.g-1. And there was no B.sorkiniana dectected. The results indicated the incidence of wheat crown rot in Tianjin area and determined the minimum threshold of pathogen in soil， which provide an early warning of the occurrence of soil-borne diseases.

Key words： wheat stem base rot; Fusarium pseudograminis; Bipolaris surkiniana; fluorescence quantitative PCR

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的三大主要糧食作物之一，年產(chǎn)量約占主要糧食作物總產(chǎn)量的20%[1]。天津市每年種植小麥面積為10～11.33萬hm2，主要集中在武清區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、薊州區(qū)和北辰區(qū)等。近年來，氣候變暖、秸稈還田等因素導(dǎo)致土壤中病原菌的積累，加上耕作制度演變等諸多因素的影響，小麥土傳病害的發(fā)生與危害不斷加重[2]。小麥莖基腐病是一種典型的土傳性病害，目前許多學(xué)者研究結(jié)果顯示其可由多種病原菌侵染發(fā)病[3-6]，在天津地區(qū)小麥莖基腐、小麥根腐和小麥紋枯病為主要發(fā)生的小麥土傳病害。其中小麥莖基腐作為近年來發(fā)病程度逐年上升的一種土傳病害受到廣泛關(guān)注，其可減產(chǎn)35%左右，甚至導(dǎo)致部分麥田絕收，嚴(yán)重威脅小麥安全生產(chǎn)。目前防治小麥莖基腐病主要是依賴化學(xué)藥劑，生產(chǎn)中尚無抗病品種推廣[7-8]。因此，小麥莖基腐已成為制約小麥高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)的重要限制因素[9]。

據(jù)調(diào)查，近年來天津市小麥土傳病害發(fā)生普遍，特別是小麥莖基腐病的發(fā)生有逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重地塊已經(jīng)引起死苗死蘗現(xiàn)象，造成減產(chǎn)30%以上。筆者前期對(duì)引發(fā)天津地區(qū)小麥莖基腐病原菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果表明優(yōu)勢(shì)菌株為假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌。目前，針對(duì)作物病原菌檢測(cè)多數(shù)學(xué)者以qPCR作為研究方法，其具有精準(zhǔn)度高，特異性強(qiáng)并且可以做到定量檢測(cè)[10-12]，已在植物病原菌快速定量檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用[13-14]。張麗霞等[15]通過熒光定量檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建了蘋果褐斑病菌定量檢測(cè)體系，用于該病害早期無癥狀快速檢測(cè)。徐娜娜[16]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)土壤中小麥紋枯病菌的含量及動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究。曹學(xué)仁[17]開發(fā)了基于qPCR技術(shù)的捕捉器中小麥白粉菌孢子濃度的定量檢測(cè)技術(shù)，為小麥白粉病的病情動(dòng)態(tài)變化提供監(jiān)測(cè)預(yù)警。潘娟娟等[18]應(yīng)用qPCR技術(shù)構(gòu)建的小麥條銹菌定量檢測(cè)技術(shù)，對(duì)處于潛育狀態(tài)下的病葉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，對(duì)該病害的預(yù)測(cè)、防治提供了科學(xué)依據(jù)。為確保小麥生產(chǎn)保質(zhì)保量，本研究以天津地區(qū)小麥莖基腐病害為內(nèi)容，運(yùn)用熒光定量實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建發(fā)病田土壤環(huán)境和種子中病原菌含量快速檢測(cè)方法，確定引發(fā)小麥莖基腐發(fā)病的土壤中病原菌最低含量，以此為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中小麥莖基腐病害防治提供預(yù)警技術(shù)，為我國(guó)小麥安全生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：本研究所用供試菌株均為田間采集，實(shí)驗(yàn)室分離純化經(jīng)鑒定后保存，假禾谷鐮刀菌特異性對(duì)照菌株編號(hào)如下： 編號(hào)1和編號(hào)2為不同地區(qū)采集的假禾谷鐮刀菌；編號(hào)3：尖孢鐮刀菌；編號(hào)4：金合歡鐮刀菌；編號(hào)5：玉米莖基腐病原菌；編號(hào)6：小麥赤霉病病原菌；編號(hào)7：小麥紋枯病病原菌；編號(hào)8：麥根腐離蠕孢菌。小麥根腐離蠕孢菌特異性對(duì)照菌株編號(hào)如下：編號(hào)1為小麥根腐離蠕孢菌；編號(hào)2：玉米生平臍蠕孢菌；編號(hào)3：稻平臍蠕孢菌；編號(hào)4：刺腐霉菌；編號(hào)5：小麥赤霉病病原菌；編號(hào)6：小麥紋枯病病原菌；編號(hào)7：假禾谷鐮刀菌。

土壤樣品：樣品取自北辰、武清、寶坻、靜海區(qū)21個(gè)村莊發(fā)病田塊，這些土壤長(zhǎng)期種植小麥，施化肥和農(nóng)家肥，秸稈全部還田，實(shí)行小麥、玉米輪作制度。農(nóng)田土壤類型均為褐土，采樣深度為表層土下10～20 cm，按 5點(diǎn)取樣法，混勻放入無菌容器中，-20 ℃保存。

小麥種子：取自于15份不同來源的小麥品種，取一定量小麥種子研磨成粉狀后待用。

儀器：水浴鍋（DK-80型，上海一恒科技有限公司）、離心機(jī)（D-37520，德國(guó)SIGAM公司）、電泳儀（DYY-60型，北京六一生物科技有限公司）、普通PCR（TC-E-480，杭州博日科技股份有限公司）、熒光定量PCR（QuantStudioTM 1 PLUS，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）、高通量組織研磨器（SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公司）、移液器（德國(guó)eppendorf公司）。

試劑：土壤基因組DNA提取試劑盒（OMEGA soil DNA Kit" D5625-01），TB-MIX（天津?yàn)榭粕锛夹g(shù)有限公司）、CTAB法提取組織DNA相關(guān)試劑。

1.2 提取方法

土壤微生物DNA提取方法：首先將所取土壤樣品中雜質(zhì)去除，包括一些腐敗植物體、昆蟲殘?bào)w等，土壤樣品經(jīng)網(wǎng)篩過篩，過篩后土壤樣品用于DNA提取，提取使用OMEGA soil DNA Kit （D5625-01）土壤DNA提取試劑盒；小麥種子及保存的病原菌使用CTAB法進(jìn)行DNA提取[19]。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)對(duì)天津地區(qū)小麥莖基腐病菌分離鑒定結(jié)果，明確天津地區(qū)小麥莖基腐病原菌的優(yōu)勢(shì)菌株為假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）和小麥根腐離蠕孢菌（Bipolaris sorkiniana）。依據(jù)假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物分別為：

假禾谷鐮刀菌特異性引物：

Fpg-qrt-F：GGGGTAGTTTCACATTTCCG

Fpg-qrt-R： AATGATTTGTGGGAGGAGGG

小麥根腐離蠕孢菌特異性引物：

Bs-qrt-F：CGGATCTCTTGGTTCTGGCAT

Bs-qrt-R：GAATACCAAAGGGCGCAATGT

該引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 引物特異性驗(yàn)證

使用CTAB法對(duì)8種實(shí)驗(yàn)室保存的病原菌DNA進(jìn)行提取，使用ddH2O作為空白對(duì)照，使用由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的2對(duì)引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，以此檢測(cè)所設(shè)計(jì)引物的特異性。

PCR反應(yīng)體系建立如下：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×T5 Direct PCR Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃預(yù)變性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。隨后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。

qPCR反應(yīng)體系建立如下：qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）包括TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL， DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水6 μL。qPCR 擴(kuò)增條件為95 ℃、30 s，然后95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)，于72 ℃時(shí)測(cè)定熒光值。

1.5 引物靈敏度分析

利用稀釋成系列濃度的假禾谷鐮刀菌、小麥根腐離蠕孢菌ITS序列擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物作為模板，采用普通PCR檢測(cè)模板濃度在100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1下能否擴(kuò)增出特異性條帶。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)以假禾谷鐮刀菌DNA和小麥根腐離蠕孢菌DNA為模板擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋至10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1和0.1 fg·μL-1，并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以起始模板濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，以Ct值（Cycle）為Y軸作回歸曲線，分別建立假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 qPCR定量檢測(cè)應(yīng)用

采集21份天津地區(qū)小麥莖基腐發(fā)病田中根際土，收集15份不同來源的小麥品種子，分別采用試劑盒和CTAB的方法進(jìn)行DNA提取，再利用本試驗(yàn)中建立的定量檢測(cè)方法對(duì)其中小麥莖基腐病原菌和小麥根腐離蠕孢病原菌含量進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性與靈敏度分析

根據(jù)針對(duì)假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌分別設(shè)計(jì)的2對(duì)引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示引物Fpg-qrt-F/R和引物Bs-qrt-F/R的特異性良好，分別以假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢的基因組為擴(kuò)增模板，可對(duì)應(yīng)獲得298 bp特異性條帶和116 bp特異性條帶，表明該設(shè)計(jì)引物對(duì)小麥其他致病菌所提取的基因組不產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，特異性良好（圖1-A、圖1-B）。

利用稀釋成系列濃度的假禾谷鐮刀菌ITS序列擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物作為模板，采用普通PCR檢測(cè)模板濃度在100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1下能否擴(kuò)增出特異性條帶。試驗(yàn)結(jié)果表明，普通PCR能夠檢測(cè)假禾谷鐮刀菌DNA樣品的靈敏度為100 pg·μL-1（圖2-A）。

利用稀釋成系列濃度的小麥根腐離蠕孢菌ITS序列擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物作為模板，采用普通PCR檢測(cè)模板濃度在100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1下能否擴(kuò)增出特異性條帶。試驗(yàn)結(jié)果表明，普通PCR能夠檢測(cè)小麥根腐離蠕孢菌DNA樣品的靈敏度為1 ng·μL-1（圖2-B）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)以假禾谷鐮刀菌DNA為模板擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋至10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1和0.1 fg·μL-1，并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3-A所示，以起始模板濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，以Ct值（Cycle）為Y軸作回歸曲線，建立假禾谷鐮刀菌定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.742 7x+

21.688，相關(guān)系數(shù)R2為0.9976，擴(kuò)增效率為85.5%，可用于下一步小麥中假禾谷鐮刀菌含量的檢測(cè)。

對(duì)小麥根腐離蠕孢菌DNA為模板擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋至10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1和0.1 fg·μL-1，并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3-B所示，以起始模板濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，以Ct值（Cycle）為Y軸作回歸曲線，建立小麥根腐離蠕孢的定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.715x+26.28，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率為85.83%，可用于下一步小麥中小麥根腐離蠕孢菌含量的檢測(cè)。

2.3 小麥根際土及種子帶菌量檢測(cè)

利用已構(gòu)建的假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，2020—2022年分別對(duì)北辰、武清、寶坻、靜海區(qū)21個(gè)村莊發(fā)病田塊中小麥根際土中病原菌進(jìn)行了檢測(cè)，均檢測(cè)出假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌，帶菌率為100%。假禾谷鐮刀菌檢出濃度為0.343 8～77.686 7 pg·g-1，小麥根腐離蠕孢檢出濃度為1.685 3～695.860 8 pg·g-1，見表1。

分別對(duì)15份不同來源的小麥品種進(jìn)行了病原菌檢測(cè)，結(jié)果見表2。其中，6份種子檢測(cè)出假禾谷鐮刀菌，檢出率為40%，含量為0.261 7～0.269 0 pg·g-1，未檢出小麥根腐離蠕孢菌。

3 討論與結(jié)論

小麥莖基腐病是一種由多種真菌引發(fā)的土傳性病害。李月嬌等[20]通過采集天津地區(qū)小麥莖基腐發(fā)病樣本進(jìn)行分離鑒定，表明造成天津地區(qū)小麥莖基腐的主要病原菌為假禾谷鐮刀菌，其次為小麥根腐離蠕孢菌。近年來，隨著秸稈還田等耕作方式的倡導(dǎo)，使得地表秸稈中攜帶一定量的病原菌，同時(shí)增加了土壤中病原菌的含量。通過前期調(diào)研，天津地區(qū)小麥莖基腐病發(fā)生趨勢(shì)逐年上升，已經(jīng)對(duì)生產(chǎn)造成一定的影響，限制了產(chǎn)量和品質(zhì)的有效提升。小麥莖基腐病前期發(fā)病癥狀與其他土傳病害癥狀相似無法準(zhǔn)確區(qū)分，后期癥狀明顯，已無防治意義。因此，在發(fā)病初期對(duì)小麥莖基腐病原菌含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)有助于盡早防控，減少損失。常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度不高且無法做到定量檢測(cè)，qPCR檢測(cè)技術(shù)可以做到高特異性和高靈敏度且能夠做到定量檢測(cè)，是目前監(jiān)測(cè)和檢測(cè)病原菌含量的重要技術(shù)手段[21-23]。

本研究通過設(shè)計(jì)假禾谷鐮刀菌和小麥根腐離蠕孢菌兩對(duì)特異性引物，結(jié)合qPCR技術(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，驗(yàn)證并獲得定量檢測(cè)病原菌的方法。運(yùn)用該檢測(cè)方法，對(duì)從21個(gè)小麥莖基腐發(fā)病田中采集的根際土樣進(jìn)行菌量檢測(cè)，結(jié)果顯示假禾谷鐮刀菌最小檢出濃度為0.343 8 pg·g-1，小麥根腐離蠕孢最小檢出濃度為1.685 3 pg·g-1，說明當(dāng)土壤中2種菌的含量分別達(dá)到各自的最低檢出濃度時(shí)，該小麥田塊有可能受到小麥莖基腐病的危害，應(yīng)當(dāng)及時(shí)采取相應(yīng)的防控措施。姜戚[24]利用小麥?zhǔn)覂?nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)盆栽土壤中假禾谷含量達(dá)到200 pg·g-1以上時(shí)，在適宜的條件下可引發(fā)小麥莖基腐病的發(fā)生，本研究為大田環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)，受多種環(huán)境因素影響可能較室內(nèi)盆栽環(huán)境更容易發(fā)病。筆者同時(shí)對(duì)15份不同來源的小麥種子病原菌含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示小麥種子假禾谷鐮刀菌帶菌率為40%，含量為0.261 7～0.269 0 pg·g-1，未檢出小麥根腐離蠕孢菌，小麥種子上只檢測(cè)出假禾谷鐮刀菌。原因可能是后期侵染造成，而小麥根腐離蠕孢不能侵染小麥穗部。

本研究運(yùn)用熒光定量實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建了一種用于定量檢測(cè)小麥莖基腐病原菌含量的方法，并在天津地區(qū)的小麥生產(chǎn)田進(jìn)行了應(yīng)用，通過對(duì)小麥根際土和小麥種子進(jìn)行定量檢測(cè)，掌握了天津地區(qū)小麥莖基腐發(fā)病土壤的最低病原菌含量，同時(shí)也提供了一種防治小麥莖基腐的預(yù)警機(jī)制，為生產(chǎn)上及時(shí)對(duì)小麥莖基腐病進(jìn)行防控提供依據(jù)。

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收稿日期： 2024-02-02

基金項(xiàng)目：重要種子有害生物精準(zhǔn)快速檢測(cè)技術(shù)研究（2022ZYCX017）；“河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展關(guān)鍵共性技術(shù)攻關(guān)專項(xiàng)（19226505D）

作者簡(jiǎn)介：李廣勝（1986—），男，天津人，助理研究員，碩士，主要從事植物病害與綠色防控技術(shù)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：楊秀榮（1972—），女，天津人，正高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事病害發(fā)生發(fā)展規(guī)律、病原菌與品種互作關(guān)系，生防菌控害效能研究。