核桃青皮不同溶劑提取物抗氧化和抑菌活性對比研究

摘" " 要：為探究核桃青皮潛在的功能活性，以90%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸餾水為溶劑，采用系統溶劑法對核桃青皮活性物質進行了提取，并對不同溶劑萃取物進行了體外抗氧化能力和抑菌活性測定。結果表明：90%乙醇對核桃青皮的提取率為36.79%，總酚和胡桃醌提取量分別為70.36、1.38 mg·g-1。乙酸乙酯萃取物對·OH和O2 - ·清除率分別為37.52%、56.53%，高于其他溶劑萃取物。在抑菌活性方面，不同溶劑萃取物對5種供試菌表現出不同的抑菌效果，正丁醇萃取物gt;90%乙醇提取物gt;乙酸乙酯萃取物gt;萃余水萃取物gt;石油醚萃取物。綜上，核桃青皮提取物表現出良好的潛在抗氧化和抗菌活性，具有開發植物源抗氧化劑和抑菌劑的潛力。

關鍵詞：核桃青皮；提取物；抗氧化活性；抑菌活性；對比

中圖分類號：TS209" " " " "文獻標識碼：A" " " " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.02.010

A Comparative Study on the Antioxidant and Antibacterial Activities of Different Solvent Extracts from Walnut Green Husk

WANG Qianning1，2，DU Yanhui1，ZHANG Nan1，YAO Kailin1

（1. Tianshui Normal University， Tianshui， Gansu 741000， China; 2.Gansu Key Laboratory for Utilization of Agricultural Solid Waste Resources， Tianshui， Gansu 741000， China）

Abstract： In order to explore the potential functional activity of walnut green husk， this study used 90% ethanol， petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol and distilled water as solvents to extract the active substances of walnut green husk by system solvent method，and the in vitro antioxidant capacity and bacteriostatic activity of the different solvent extracts were determined. The results showed that the extraction rate of walnut green husk by 90% ethanol was 36.79%， and the extraction amounts of total phenol and juglone were 70.36 mg·g-1 and 1.38 mg·g-1， respectively. The clearance rates of ·OH and O2 - · of ethyl acetate extract were 37.52% and 56.53%， which were higher than those of other solvent extracts. In terms of antibacterial activity， different solvent extracts showed different antibacterial effects on 5 tested bacteria， n-butanol extractgt;90% ethanol extractgt;ethyl acetate extractgt;raffinate water extractgt;petroleum ether extract. In conclusion， walnut green husk extract showes good potential antioxidant and antibacterial activities， and has the potential to develop plant-derived antioxidants and antibacterial agents.

Key words： walnut green husk; extracts; antioxidant activity; antibacterial activity; comparison

核桃青皮又稱青龍衣，是核桃（Juglans regia L.）未成熟時外層包裹的綠色果皮，屬核桃仁生產過程中的副產品，產量約為干果的1.5倍[1]。僅少量核桃青皮用作農業堆肥、染料和制備核桃利口酒的材料，大多數被廢棄在田間或堆積在溝旁，造成了資源浪費，還會造成化感效應，影響動植物的生存，給生態環境帶來了嚴重污染[2-4]。

近幾十年來，由于化學合成抗氧化劑、抗菌劑成本增加和環境污染等問題的突顯，消費者趨向使用天然物質代替化學合成物質，特別是植物源抗氧化劑和抗菌劑的開發[5]。天然抗氧化劑，如酚類物質，可通過減少氧化應激和抑制大分子氧化來降低退行性疾病的風險。酚類化合物存在于核桃的所有部位，并以其抗菌作用而聞名。Carvalho等[6]已證明核桃葉、青皮和果仁的甲醇提取物具有良好的抗氧化作用，并對人腎癌細胞和結腸癌細胞均表現出一定的生長抑制作用。Oliveira等[5]研究顯示，核桃青皮提取物對革蘭氏陽性菌的生長有抑制作用。因此，核桃的副產品可以作為天然抗氧化劑和抗菌劑的來源[7]。

本研究以核桃青皮為原料，90%乙醇提取濃縮的浸膏，利用不同極性溶劑進行萃取，對提取物的總酚含量、胡桃醌含量和自由基清除作用進行比較，并評價了其對自由基的清除能力和對細菌的抑制能力，以期提升核桃綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

核桃青皮于2022年8月購自甘肅省天水市。核桃青皮用自來水清洗后，再用蒸餾水沖洗2遍，切碎，放入壓力15 Pa，溫度-45 ℃的冷凍室進行冷凍干燥，粉碎并過100目篩，備用。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、阪崎腸桿菌和沙門氏菌均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 主要儀器與設備

ZRD-7080干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；RE100-Pro旋轉蒸發儀，北京大龍興創實驗儀器有限公司；SP-I920紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；ZQTY-70S搖床，上海知楚儀器有限公司；SB-5200DTS超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3E雷磁pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；AL204天平，梅特勒托利多集團；PTC-4恒溫水浴鍋，天津科諾儀器設備有限公司；LDZX-30FB高壓滅菌鍋，上海滬粵明科學儀器有限公司；ZHJH-2112B超凈工作臺，深圳市朗普電子科技有限公司；INFINITE 200 Pro多功能酶標儀，瑞士帝肯集團公司。

1.3 核桃青皮提取物的制備

核桃青皮按料液比1∶15 g·mL-1加入90%乙醇溶液，靜置5 min后超聲處理。超聲條件為：溫度30 ℃，功率200 W，時間30 min。浸提后的物料于40 ℃下減壓蒸餾，濃縮為稠糊狀物至恒質量，置于棕色瓶中冷藏保存。

稱取10 g核桃青皮上述乙醇浸膏，加入200 mL蒸餾水，倒入分液漏斗中，混合均勻后按順序用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取4次，每次加入50 mL提取溶劑后充分振搖30 min，靜置30 min，最后合并各萃取液，減壓濃縮至浸膏狀。按下式計算各溶劑核桃青皮提取率。

E=（m/M）×100%" "（1）

式中，E為提取率（%）；M為核桃青皮粉末質量（g）； m為浸膏質量（g）。

1.4 核桃青皮提取物中總酚含量的測定

沒食子酸標準曲線的建立[8]：精確吸取不同濃度的沒食子酸標準溶液1 mL（10、20、30、40、50、60、70 μg·mL-1）至比色管內，依次加入1 mL福林酚試劑、5 mL蒸餾水，3 mL Na2CO3溶液，30 ℃水浴1 h后，在波長764 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。

總酚含量的測定：精確吸取1 mL不同溶劑核桃青皮提取液到至比色管內，依次加入1 mL FC試劑、5 mL蒸餾水、3 mL Na2CO3溶液，30 ℃水浴1 h后，在波長764 nm處測定吸光值，重復試驗3次，按下式計算總酚含量：

總酚含量（μg·g-1）=（c×V×N）/m" （2）

式中，c為提取液中總酚的含量（μg·mL-1）；V為提取液的總體積（mL）；N為稀釋倍數；m為核桃青皮的實際質量（g）。

1.5 核桃青皮提取物中胡桃醌含量的測定

將各溶劑提取物浸膏用蒸餾水定容到50 mL，作為試驗母液。取試驗母液1 mL，用甲醇定容至25 mL，4 000 r·min-1離心10 min，在426 nm波長處測定上清液吸光值。參照張立華[9]的方法，繪制標準曲線，重復試驗3次，按下式計算胡桃醌含量：

胡桃醌含量（μg·g-1）=（1 000×c×V×N）/m" （3）

式中，c為提取液中胡桃醌的含量（mg·L-1）；V為提取液的總體積（L）；N為稀釋倍數；m為核桃青皮的實際質量（g）。

1.6 核桃青皮提取物抗氧化活性測定

1.6.1 ·OH清除率的測定 利用芬頓體系法測定并稍作改進[10-11]。吸取濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的不同溶劑核桃青皮提取液各2 mL，加入含0.1 mmol·L-1 EDTA、2.8 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液和0.1 mmol·L-1三氯化鐵混合液3 mL、0.7 mL H2O2，37 ℃水浴40 min后，在波長532 nm處測定吸光度（A1）。蒸餾水作為陰性對照（A2），相同濃度梯度的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene， BHT）溶液作為陽性對照，重復試驗3次，按下式計算·OH的清除率。

清除率=（1-A1/A2）×100%" （4）

1.6.2 DPPH·清除率的測定 采用2，2-二苯基-1-苦肼基（2，2-dipheny-1-pic-rylhydrazy， DPPH）法測定自由基清除率。吸取濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1的不同溶劑核桃青皮提取液各0.3 mL和DPPH乙醇溶液2.7 mL，混勻后，避光條件下，靜置30 min，在波長517 nm處測定OD1；此外，取0.3 mL蒸餾水和2.7 mL DPPH溶液，混勻后，避光條件下，靜置30 min，測吸光值ODDPPH；取0.3 mL提取液和2.7 mL蒸餾水在相同試驗條件下測吸光值OD2。相同濃度梯度的BHT溶液作為陽性對照，重復試驗3次，按下式計算DPPH·的清除率[12]。

清除率=ODDPPH-（OD1-OD2）/ODDPPH×100%" （5）

1.6.3 O2 - ·清除率的測定 參照Wu等[13]的方法，吸取 0.05 mol·L-1 Tris-HCl緩沖液（pH =8.2）4 mL，滴至比色管中，25 ℃水浴20 min，分別加入濃度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的不同溶劑核桃青皮提取液各1 mL和 80 mmol·L-1鄰苯三酚20 mL充分混勻。25 ℃水浴反應5 min，再加入10 mol·L-1鹽酸溶液200 μL 終止反應，在波長325 nm處測定吸光度。相同濃度梯度的BHT作為陽性對照，重復試驗3次，按下式計算O2 - ·的清除率。

清除率=［1-（A1-A2）/A3］×100%（6）

式中，A1為4 mL Tris-HCl+20 μL焦性沒食子酸+1 mL待測溶液+200 μL鹽酸；A2為4 mL Tris-HCl+20 μL蒸餾水+1 mL待測溶液+200 μL鹽酸；A3為4 mL Tris-HCl+20 μL焦性沒食子酸+1 mL蒸餾水+200 μL鹽酸。

1.7 核桃青皮提取物抑菌活性測定

1.7.1 核桃青皮提取物抑菌圈直徑的測定 采用牛津杯法測定不同溶劑提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、阪崎腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑。將提取物用相應溶劑稀釋至500 mg·mL-1。用無菌移液管吸取濃度為108 CFU·mL-1的5種菌懸液0.1 mL，滴至NA培養基上，用一次性無菌涂布棒將菌懸液輕輕涂勻。無菌操作在培養基表面放置牛津杯并輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，分別向牛津杯中加入150 μL不同溶劑的待測液。以150 μL相應溶劑作為空白對照，以濃度為100 μg·mL-1鏈霉素150 μL作為陽性對照，其他操作相同，37 ℃培養24 h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，記錄結果，重復試驗3次。

1.7.2 核桃青皮提取物最小抑菌濃度的測定 采用吳瑩等[12]的方法測定提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、阪崎腸桿菌和沙門氏菌的MIC。取不同溶劑稀釋后的核桃青皮提取物溶液0.1 mL，加入55 ℃滅菌NA固體培養基1 mL，充分混勻。移取上述培養基200 μL至無菌96孔板，待所有孔中的培養基凝固后，向每孔中加入濃度為108 CFU·mL-1的菌懸液20 μL，37 ℃培養24 h。以培養24 h后未見菌體生長的最低濃度作為抑制該細菌的MIC值，以0.5 mL相應提取溶劑作為空白對照，以濃度為100 μg·mL-1的鏈霉素鈉溶液0.5 mL作為陽性對照，其他操作相同，記錄結果，重復試驗3次。

2 結果與分析

2.1 核桃青皮不同溶劑提取物的提取率

本試驗采用減壓蒸餾法對核桃青皮進行系統溶劑提取，使其活性成分得到最大程度保留。從表1可知，核桃青皮90%乙醇、乙酸乙酯和萃余水提取率分別為36.79%、6.64%和3.48%，表明核桃青皮中大部分活性物質極性較大，也存在少量極性較小的活性物質。

2.2 桃青皮提取物總酚和胡桃醌的含量

由表2可知，各提取物中總酚和胡桃醌含量由大到小為：90%乙醇gt;正丁醇gt;石油醚gt;乙酸乙酯gt;萃余水。90%乙醇提取物中總酚和胡桃醌含量最高，分別為70.36、1.38 mg·g-1，并極顯著高于其他溶劑。正丁醇萃取物次之，且極顯著高于石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。萃余水萃取物中總酚和胡桃醌含量最低，分別為0.37、0.02 mg·g-1。

張鵬飛等[14]研究得出，核桃鮮樣種仁中的總酚提取量為0.50 mg·g-1，明顯低于本試驗90%乙醇提取物中的含量，說明核桃青皮比核桃果仁中總酚的提取量高。魏歡等[15]研究得出，核桃青皮總酚含量為73.297 mg·g-1，與本試驗90%乙醇提取物中含量相近，說明利用福林酚比色法操作簡單、化學干擾少且穩定性高。馮遲等[16]研究發現，超聲輔助提取核桃楸青果皮中胡桃醌，最高提取率為1.72 mg·g-1，低于本試驗中90%乙醇和正丁醇萃取物中胡桃醌的總量，說明系統溶劑提取法效率更高。

2.3 核桃青皮提取物抗氧化活性測定

2.3.1 ·OH清除率 羥基自由基是ROS家族中最活潑的自由基，具有極強的電子能力，可以和任何生物分子發生化學反應，造成氧化損傷，對生物體危害巨大[17]。由圖1可見，隨著核桃青皮不同溶劑提取物濃度的增加，·OH清除率均逐漸增加，且這種增加趨勢差異顯著（Plt;0.05）。當提取物質量濃度為1.0 mg·mL-1時，乙酸乙酯萃取物對·OH的清除率為37.52%，低于BHT的清除率54.3%。對比同濃度下黃瓜多糖和黃桃果肉中水溶性多糖對·OH的清除率分別為4.5%和16.02%[10，18]，說明核桃青皮提取物對·OH的清除能力更高。

2.3.2 DPPH·清除率 DPPH自由基是一種以氮為中心的自由基，可快速并穩定地評價抗氧化活性，且清除率越高，物質的抗氧化活性也隨之增大[19-20]。由圖2可以看出，隨著核桃青皮不同溶劑提取物濃度的增加，DPPH·清除率均呈現上升趨勢，且這種上升趨勢差異顯著（Plt;0.05）。當提取物質量濃度為1.0 mg·mL-1時，石油醚萃取物對DPPH·的清除率為7.61%，BHT的清除率為8.02%，二者的清除率非常接近，而BHT是公認的抗氧化劑，說明核桃青皮提取物具有較強的體外抗氧化能力。對比同濃度下陳皮揮發油和綠茶多酚對DPPH·的清除率分別為1.10%和3.66%[21-22]，說明核桃青皮提取物對DPPH·有較好的清除作用。

2.3.3 O2 - ·清除率 超氧陰離子自由基（O2 - ·）是一種弱氧化劑，可生成·OH和單線態氧等其他自由基，造成機體氧化脅迫，從而引發多種疾病[23]。由圖3可知，隨著核桃青皮不同溶劑提取物濃度逐漸增大，對O2 - ·的清除率也隨之增強，且這種上升趨勢差異顯著（Plt;0.05）。當提取物質量濃度為1.0 mg·mL-1時，乙酸乙酯萃取物對O2 - ·的清除率達到56.53%，BHT的清除率為57.95%，二者的清除率無顯著差異。同濃度下沙棘多糖和綠茶多酚對O2 - ·清除率分別為18.0%和49.33%[24-25]，說明核桃青皮提取物對O2 - ·清除作用效果更好，核桃青皮提取物具有作為新型抗氧化劑的潛質。

2.4 核桃青皮提取物抑菌活性測定

2.4.1 核桃青皮提取物抑菌效果比較 從表3可知，90%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物對5種供試菌均表現出較弱的抑菌效果；正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌效果強烈，抑菌圈直徑分別為29.09、26.38 mm，對大腸桿菌、阪崎腸桿菌和沙門氏菌顯示出高抑菌活性，抑菌圈直徑分別為16.23、25.41、25.11 mm。由此可知，正丁醇萃取物對革蘭氏陽性菌抑菌效果強于革蘭氏陰性菌，原因可能是革蘭氏陰性菌細胞壁由肽聚糖和外膜組成，外膜又由脂蛋白、脂質雙層、脂多糖等復合組成。這種高脂多糖含量的雙層膜結構比革蘭氏陽性菌的單層膜結構更能抵制親水性和疏水性物質的侵入[26]。石油醚萃取物對大腸桿菌和阪崎腸桿菌抑制效果較弱，對其他3種供試菌無抑制效果。萃余水對大腸桿菌無抑菌效果，對其他4種供試菌有微弱的抑菌效果。

2.4.2 核桃青皮提取物最小抑菌濃度（MIC） 由表4綜合對比，核桃青皮正丁醇萃取物和90%乙醇提取物對5種供試菌表現出較好的抑菌效果，其中正丁醇萃取物對5種供試菌的MIC值均為0.28 mg·mL-1，90%乙醇提取物對阪崎腸桿菌和沙門氏菌的MIC值均為1.14 mg·mL-1。乙酸乙酯萃取物對5種供試菌也具有較好的抑菌效果，對枯草芽孢桿菌、阪崎腸桿菌和沙門氏菌抑菌MIC值均為4.55 mg·mL-1；萃余水除不能有效抑制大腸桿菌的生長外，對其他4種供試菌抑菌效果較好；石油醚萃取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌抑制作用稍差。綜合抑菌圈直徑和MIC值結果，可見正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。

3 討論與結論

3.1 核桃青皮提取物抗氧化性能

核桃青皮富含氨基酸、多酚、揮發油和生物堿等活性成分[27-29]。其中多酚類活性成分主要包括槲皮素、胡桃醌、扁蓄苷、咖啡酸和阿魏酸等[30]。這些有機物均有良好的抗氧化性能。研究結果顯示，大部分活性物質能夠溶于極性較大的90%乙醇，少量溶于乙酸乙酯和萃余水。因為核桃青皮主要活性成分多酚易溶于極性大的溶劑，如水、乙醇等，可溶于乙酸乙酯[31]。其中90%乙醇提取物總酚和胡桃醌含量分別為（70.36±0.01） mg·g-1和（1.38±0.02）mg·g-1，均高于路振康等[30]以50%乙醇為溶劑提取物中總酚和胡桃醌的含量，說明高濃度乙醇對核桃青皮中總酚等活性成分的提取效果更好。在體外條件下，不同溶劑提取物表現出不同的抗氧化能力，說明改變提取溶劑可獲得不同的活性成分。本試驗中，乙酸乙酯萃取物對O2 - ·的清除率（56.53%）高于劉猛等[32]以40%甲醇為溶劑的提取液對O2 - ·的清除率（47.39%），說明乙酸乙酯核桃青皮萃取物具有作為新型抗氧化劑的潛質。

3.2 核桃青皮提取物抑菌性能

研究結果表明，不同溶劑核桃青皮提取物對5種供試菌均有一定的抑制效果，與何涵茜等[33]關于核桃青皮提取物抑菌活性的研究結果相似。核桃青皮90%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物對細菌的抑制能力較強，對大腸桿菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為2.27/9.09、4.55/9.09、2.27/4.55、1.14/4.55和1.14/4.55 mg·mL-1；同時，桃青皮90%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物對·OH清除能力也最強。這說明核桃青皮提取物抗菌能力與其抗氧化能力可能存在相關性。已有研究發現，植物源多酚具有廣譜的抗菌活性[28，34-36]，且生物活性依賴多酚的構型和構象，具有較強收斂性的多酚，其清除自由基的能力和藥理活性也較強[37]。由此可見，核桃青皮不同溶劑提取物均有一定的抗氧化和抗菌活性，具有開發植物源抗氧化劑和保鮮劑的潛力。

本研究以核桃青皮為原料，采用超聲波輔助減壓蒸餾法以及萃取法獲得不同極性溶劑提取物。結果表明，大部分活性物質能夠溶于極性較大的90%乙醇，少量溶于乙酸乙酯和萃余水。核桃青皮不同溶劑提取物對·OH、DPPH·、O2 - ·都有一定的清除能力，隨著樣品質量濃度的增加而增加，呈現良好的量效關系。當提取物質量濃度為1.0 mg·mL-1時，乙酸乙酯提取物對·OH和O2 - ·清除率高于其他提取物，分別為37.52%和56.53%；在所有提取物中石油醚提取物對DPPH·清除率最高（7.61%）。這說明極性較小的核桃青皮提取物中抗氧化活性更強。不同提取物對5種供試菌表現出不同的抑菌活性，其中正丁醇提取物對所有供試菌的抑菌圈直徑最大，表現出較強的抗菌活性，且對革蘭氏陽性菌抑菌效果強于革蘭氏陰性菌。正丁醇提取物對5種供試菌的MIC值最小，均為0.28 mg·mL-1。綜合抑菌圈直徑和MIC值結果，可見正丁醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。研究表明，核桃青皮不同溶劑提取物有著較好的抗菌和抗氧化活性，具有開發天然抗氧化劑和抑菌劑的潛力。本研究雖然建立了核桃青皮活性成分的系統溶劑提取法，且不同溶劑核桃青皮提取物顯示了較好的抗菌和抗氧化活性，但對于提取物種活性成分的結構分析及抑制細菌的機理還需進一步探索。

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收稿日期：2023-11-21

基金項目：甘肅省科技廳青年科技基金項目（21JR1RE297）；天水師范學院創新基金項目（CXJ2020-13）；甘肅省教育廳創新基金項目（2023B-139）；甘肅省科技廳科技專員專項項目（23CXGE0009）

作者簡介：王倩寧（1990—），女，陜西西安人，講師，碩士，主要從事天然活性物質與功能性食品研究。