小球藻提取物促進糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用研究

摘要：目的 探討小球藻提取物（CE）對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的愈合作用。方法 細胞毒性實驗設(shè)置空白對照組（CON組），CE低（1 mg/L）、中（10 mg/L）和高（100 mg/L）劑量組；抗氧化實驗分組增加了H2O2（100 μmol/L）組，各實驗組增加了100 μmol/L H2O2；抗炎實驗分組增加了脂多糖（1 mg/L），各實驗組增加了1 mg/L脂多糖干預。采用MTT法檢測CE的細胞毒性；熒光探針法檢測CE的抗氧化作用；熒光定量PCR檢測CE的抗炎作用。設(shè)置空白CON組、CE低（0.5 g/L）、中（5 g/L）和高（50 g/L）劑量組，采用平板菌落計數(shù)法檢測CE的抗菌能力。腹腔注射鏈脲佐菌素法誘導糖尿病小鼠模型，并采用隨機數(shù)字表法分為CON組、CE低（0.5 g/L）、中（5 g/L）和高（50 g/L）劑量組，每組12只。在小鼠脊柱兩側(cè)對稱性各做一個直徑6 mm的圓形創(chuàng)面進行給藥處理，每日1次，連續(xù)14 d。分別進行拍照并取材，記錄創(chuàng)面愈合情況并對皮膚組織進行組織學（7 d和14 d）及免疫熒光染色（7 d）檢測。結(jié)果 體外實驗：CE各劑量組對NIH-3T3細胞都有良好的細胞相容性；與H2O2組相比，CE低、中和高劑量組的活性氧（ROS）熒光信號依次減弱；與脂多糖組相比，CE低、中和高劑量組CD86的表達降低，CD206的表達升高（P＜0.05）；與CON組相比，CE低、中和高劑量組對細菌生長的抑制作用依次增強（P＜0.05）。體內(nèi)實驗：術(shù)后第7天和第14天，CE組糖尿病小鼠創(chuàng)面的閉合速率加快，創(chuàng)面愈合效果明顯；對創(chuàng)面組織分別進行HE染色和Masson染色發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，CE低、中和高劑量組糖尿病小鼠創(chuàng)面有更多的膠原沉積。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與CON組相比，CE治療后的創(chuàng)面的α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）及巨噬細胞甘露糖受體（CD206）水平升高，而白細胞分化抗原86（CD86）表達水平降低。結(jié)論 CE可有效促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，其機制可能與其抗氧化、抗炎和抗菌有關(guān)。

關(guān)鍵詞：小球藻屬；糖尿病；抗氧化劑；抗菌藥；抗炎；創(chuàng)面愈合

中圖分類號：R587.2，R285.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20230825

Study on the effect of Chlorella extract on promoting skin wound healing in diabetic mice

HUANG Yu1， 2， HE Ruiying3， LIU Sen1， CHEN Kaiyuan1， LI Meiyun1， CHENG Jianye1， WU Yan1

1 School of Life Sciences， Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology， Renmin Hospital of Wuhan University; 3 School of Chemistry and Chemical Engineering， Hubei University

Corresponding Author E-mail： wuyan@mdjmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the effect of Chlorella vulgaris extract （CE） on skin wound healing in diabetic mice. Methods The blank control group （CON group）， CE low （1 mg/L）， medium （10 mg/L） and high （100 mg/L） dose groups were set up in vitro cytotoxicity assay. The additional H2O2 （100 μmol/L） group was set up for antioxidant experiments， and the concentration of H2O2 （100 μmol/L） in each experimental group was also added. The additional lipopolysaccharide （1 mg/L） group was set up for the anti-inflammatory experiments， and the concentration of lipopolysaccharide （1 mg/L） in each experimental group was" also added. The cytotoxicity of CE was detected by MTT method. The antioxidant activity of CE was investigated by fluorescent probe assay. The anti-inflammatory effect of CE was detected by fluorescent quantitative PCR. The blank control group （CON group）， CE low （0.5 g/L）， medium （5 g/L） and high （50 g/L） dose groups were set up， and the antibacterial properties of CE were examined by plate colony counting method. The diabetic mouse model was induced by streptozotocin， and model mice were divided into the control group， the CE low （0.5 g/L）， medium （5 g/L） and high （50 g/L） dose groups using the random number table method， with 12 mice in each group. After the model was successfully established， two 6 mm wounds were symmetrically created on each side of spine of mouse. The wounds were administered once daily for a total of 14 consecutive days. The wound healing was observed and photographed on days 0， 7 and 14 respectively. The wound samples were taken and processed for histology （7 d and 14 d） and immunofluorescence （7 d）. Results In vitro experiments： CE low， medium and high dose groups showed good cytocompatibility with NIH-3T3 cells compared to the control group， and CE low， medium and high dose groups showed weaker reactive oxygen species （ROS） fluorescence signal compared to the H2O2 group. CE low， medium and high dose groups showed lower expression of CD86 and higher expression of CD206 compared to the control group （P＜0.05）. The inhibition of bacterial growth was enhanced in the CE low， medium and high dose groups compared to the control group （P＜0.05） . In vivo experiment results demonstrated that wound healing rates on the 7th and 14th day after operation were accelerated in the CE group， and the wound healing effect was obvious. Results of HE and Masson staining showed that there were more collagen deposition in wound in the CE low， medium and high dose groups compared to the control group. Results of the immunofluorescence assay showed that the higher expression levels of" α-smooth muscle actin （α-SMA）， platelet endothelial cell adhesion molecule-1 （CD31） and macrophage mannose receptor （CD206） after treatment， and the lower levels of leukocyte differentiation antigen 86 （CD86） in wound compared to the control group. Conclusion CE can effectively promote wound healing in diabetic mice， and the mechanism may be related to its antioxidant， anti-inflammatory and antibacterial effects.

Key words： chlorella; diabetes mellitus; antioxidants; anti-bacterial agents; anti-inflammatory; wound healing

糖尿病引起的創(chuàng)面是一種不易愈合、復發(fā)率高的慢性創(chuàng)面。其創(chuàng)面微環(huán)境復雜，具有高糖、活性氧（ROS）過多、免疫功能失調(diào)、易感染以及營養(yǎng)不良等特點［1］。傳統(tǒng)治療糖尿病創(chuàng)面的方法主要包括控制血糖［2］、徹底清創(chuàng)［3］和控制感染［4］等，而采用外源性生長因子［5］、富血小板血漿［6］和高壓氧［7］等療法效果也多不盡理想。小球藻是存在于淡水和海洋生態(tài)系統(tǒng)中的單細胞綠色微藻，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類、核酸和維生素等營養(yǎng)成分［8］。由于其生物相容性好，具有抗氧化［9］、調(diào)節(jié)免疫［10］和抑菌［11］等多種作用，故將小球藻有效成分進行提取，可以更好地發(fā)揮其藥理作用。目前關(guān)于小球藻提取物（chlorella extract，CE）對糖尿病創(chuàng)面愈合的研究較少。本研究擬通過體內(nèi)體外實驗探討CE對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響，為CE用于糖尿病創(chuàng)面治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞與動物 小鼠成纖維細胞NIH-3T3和RAW 264.7巨噬細胞購于上海酶研生物科技有限公司；SPF級雄性C57BL/6小鼠共48只，8～10周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2019-003］。將小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房［實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2019-006］，溫度（23±2）℃，濕度55%±5%，12 h交替照明，自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)1周后進行分組實驗，動物實驗流程經(jīng)牡丹江醫(yī)學院動物倫理委員會審查批準（倫理號：IACUC-20230215-97）。

1.1.2 主要試劑與儀器 小球藻購自陜西省正禾藥業(yè)生物工程有限公司；聚乙二醇（PEG）購自中國上海阿拉丁生化科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、蘇木素-伊紅（HE）染色液、改良Masson三色染色試劑盒、鏈脲佐菌素（STZ）購自北京索萊寶科技有限公司；H2O2、2′-7′二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、脂多糖（LPS）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二苯基四氮唑溴鹽購自廣州賽國生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒購自瑞士Roche公司；金黃色葡萄球菌和大腸桿菌購自湖南豐暉生物科技有限公司；甲醛購自遼寧泉瑞試劑有限公司；二甲苯購自天津市富宇精細化工有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IGg抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Sigma公司；白細胞分化抗原86（CD86）抗體、巨噬細胞甘露糖受體（CD206）抗體購自美國proteintech公司；異氟烷購于深圳瑞沃德公司；白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-10、精氨酸酶（ARG）-1、β-actin購自生工生物工程（上海）股份有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自上海力申科學儀器有限公司；多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；生物顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；熒光顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 CE的制備 將1 g小球藻粉加入10 mL PEG中，80 ℃，4 h，5 000 r/min離心5 min。收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組 NIH-3T3細胞和RAW 264.7巨噬細胞分別置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞融合度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。細胞毒性實驗分組：對照組（CON組，PEG）、CE低（1 mg/L）、CE中（10 mg/L）和CE高（100 mg/L）劑量組。抗氧化實驗分組：CON組（PEG）、H2O2（100 μmol/L）組、H2O2（100 μmol/L）+CE低（1 mg/L）劑量組、H2O2（100 μmol/L）+CE中（10 mg/L）劑量組和H2O2（100 μmol/L）+CE高（100 mg/L）劑量組。抗炎實驗分組：CON組（PEG）、LPS（1 mg/L）組、LPS" （1 mg/L）+CE低（1 mg/L）劑量組、LPS（1 mg/L）+CE中（10 mg/L）劑量組和LPS（1 mg/L）+CE高（100 mg/L）劑量組。

1.2.3 MTT法檢測CE的細胞毒性 將對數(shù)生長期的NIH-3T3細胞制成細胞懸液，接種于96孔板中（5×103個細胞/孔），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h。按照1.2.2實驗分組進行加藥，無細胞的PEG溶液作為空白組，每組設(shè)置6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT染料，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后加入DMSO，最后使用多功能酶標儀于490 nm波長處檢測光密度（OD490）并計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組OD490-空白組OD490）/（對照組OD490-空白組OD490）×100%。

1.2.4 熒光探針法檢測CE的抗氧化作用 取6孔板加入少量培養(yǎng)基，將消毒玻片小心擺放在其中，將對數(shù)生長期的NIH-3T3細胞制成細胞懸液，并按照4×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h。按照1.2.2實驗分組進行加藥，每組設(shè)置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，清洗細胞，用10 μmol/L DCFH-DA孵育30 min。激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)熒光信號并拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測CE的抗炎作用 將對數(shù)生長期的RAW 264.7巨噬細胞配置細胞懸液，按照4×105個/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h，按照1.2.2實驗分組進行加藥，每組設(shè)置6個復孔。孵育24 h后收集細胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA。qPCR檢測細胞中CD86、IL-1β、TNF-α、CD206、IL-10、精氨酸酶（ARG）?1的mRNA水平。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)源性參照基因。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，實驗重復3次。

1.2.6 體外抗菌實驗 采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌研究CE的抑菌作用。實驗分4組，分別為CON組（PEG）、CE低（0.5 g/L）、CE中（5 g/L）和CE高（50 g/L）劑量組，每組加入菌液1 mL（6×105 CFU/mL），再按照上述實驗分組加藥1 mL，每組設(shè)3個重復樣本。放入37 ℃恒溫搖床震蕩18 h后，用細菌培養(yǎng)基將細菌懸液稀釋1 000倍，取40 μL菌液，均勻涂布在LB瓊脂平板上。在37 ℃下培養(yǎng)24 h，對LB瓊脂平板上的細菌進行拍照并計數(shù)，統(tǒng)計細菌存活率。細菌存活率=實驗組細菌數(shù)/對照組細菌數(shù)×100%。

1.2.7 糖尿病創(chuàng)面小鼠模型的制備與分組干預 48只C57BL/6小鼠禁食12 h后，腹腔注射50 mg/kg STZ，連續(xù)注射3 d，每日1次。2周后全自動血糖監(jiān)測儀測量血糖，連續(xù)3 d血糖水平≥16.7 mmol/L為造模成功。將造模成功的48只小鼠按照隨機數(shù)字表法分成CON組、CE低（0.5 g/L）、中（5 g/L）和高（50 g/L）劑量組，每組12只。術(shù)前用異氟烷麻醉小鼠，剃除背部毛發(fā)并用70%乙醇擦拭。在小鼠背部區(qū)域沿著脊柱兩側(cè)分別做2個6 mm直徑的全層皮膚缺損創(chuàng)面。CON組和各CE組小鼠均在創(chuàng)面部位注射，0.5 mL/孔，1次/d，連續(xù)14 d，其中CON組注射相同體積的PEG。用濕紗布進行覆蓋，創(chuàng)面四周用手術(shù)縫線進行固定，并且于第7天和第14天取材，每次每組6只。

1.2.8 創(chuàng)面愈合狀況測定 在第0、7、14天觀察并拍照，Image J軟件統(tǒng)計創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合率=（第0天的創(chuàng)面面積-特定日期的創(chuàng)面面積）/第0天的創(chuàng)面面積×100%。

1.2.9 HE染色、Masson染色及免疫熒光染色 分別于實驗第7、14天頸椎脫臼處死小鼠，取創(chuàng)面皮膚組織固定于4%多聚甲醛48 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，包埋，切片，厚度為4 μm，進行HE染色和Masson染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。另取第7天創(chuàng)面皮膚組織進行免疫熒光染色，冷凍切片，固定、漂洗、封閉、用一抗（α-SMA、CD31、CD86、CD206）抗體對切片進行染色，4 ℃過夜，然后與二抗一起孵育，并用DAPI染色。使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0.1統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（[x] ±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CE的細胞毒性 CON組和CE低、中、高劑量組細胞存活率分別為100.00%、98.76%±1.23%、98.74%±2.47%和99.49%±1.64%，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.865，P＞0.05），結(jié)果顯示不同濃度CE處理無明顯細胞毒性。

2.2 CE的體外抗氧化作用 CON組，H2O2組和H2O2+CE低、中、高劑量組ROS熒光強度分別為0.00±0.00、50.97±1.80、35.55±2.32、2.65±0.06、0.00±0.00（F=992.400，P＜0.01）。與CON組相比，加入H2O2后細胞內(nèi)熒光信號增強。與H2O2單獨處理相比，H2O2和CE共同處理條件下CE濃度越高，細胞內(nèi)的熒光強度越低（P＜0.05）。見圖1。

2.3 CE的抗炎作用 與CON組相比，加入LPS后，CD86、IL-1β及TNF-α的mRNA水平明顯升高，CD206、IL-10及Arg-1的mRNA水平明顯降低，顯示巨噬細胞炎癥模型構(gòu)造成功。與LPS單獨處理相比，LPS和CE共同處理后，隨著CE濃度的升高，CD86、IL-1β及TNF-α的表達依次減少，而CD206、IL-10及Arg-1的表達依次增加，見表2。

2.4 CE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的影響 與CON組相比，隨著CE濃度的升高，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落數(shù)量依次減少，高劑量組無細菌生長（P＜0.05）。見表3、圖2。

2.5 CE對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的影響 與CON組相比，隨著CE濃度的升高，創(chuàng)面愈合依次加快（均P＜0.05）。在第7天時，CE高劑量組創(chuàng)面愈合最快，創(chuàng)緣處可見結(jié)痂。在第14天，CON組創(chuàng)面縮小，顏色加深呈褐色，CE高劑量組創(chuàng)面面積顯著縮小，見表4、圖3。

2.6 皮膚愈合創(chuàng)面組織學分析 HE染色顯示，術(shù)后7 d，與CON組相比，CE各治療組創(chuàng)面肉芽組織更為豐富，有較多成纖維細胞及新生毛細血管。術(shù)后14 d，CE各治療組較CON組有更多的皮膚附屬結(jié)構(gòu)的再生。Masson染色顯示，術(shù)后第14天，與CON組相比，CE治療組可以改善膠原蛋白在創(chuàng)面部位的沉積，從而加速皮膚再生。見圖4。

2.7 愈合創(chuàng)面組織免疫組織熒光變化 與CON組相比，隨著CE濃度的升高，α-SMA、CD31及抑炎因子CD206表達依次升高，促炎因子CD86表達依次降低（P＜0.05）。見表5，圖5、6。

3 討論

糖尿病足潰瘍是糖尿病較為常見的并發(fā)癥之一。其創(chuàng)面存在愈合及治療時間長、反復發(fā)作等問題，給患者造成沉重的身心和經(jīng)濟負擔［12］。高糖環(huán)境可導致創(chuàng)面過度氧化應激、異常炎癥反應和細菌感染等，使創(chuàng)面不易愈合［13］。小球藻是一種富含多種營養(yǎng)成分的微藻，具有抗氧化和一定的抗炎作用，可調(diào)節(jié)創(chuàng)面微環(huán)境［14］。本研究采用聚乙二醇對小球藻的有效成分進行提取，分別從抗氧化、抗炎和抗菌方面評估其對糖尿病創(chuàng)面的治療作用。

3.1 CE的抗氧化作用 氧化應激參與了糖尿病創(chuàng)面的發(fā)生和發(fā)展。有研究顯示，糖尿病創(chuàng)面由于持續(xù)的高血糖、感染和炎癥引起高水平的ROS積聚，顯著增加了創(chuàng)面環(huán)境中的氧化應激，導致創(chuàng)面愈合延遲［15］。Li等［16］研究表明，采用三步法（己烷、乙酸乙酯和水）提取微藻的有效成分，通過總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）評估提取物的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)微藻可能是天然抗氧化劑的豐富來源。本研究結(jié)果顯示，與CON組相比，給予CE治療后小鼠成纖維細胞內(nèi)ROS水平明顯降低，提示CE可能通過降低ROS水平來減弱氧化應激，進而促進創(chuàng)面愈合。

3.2 CE的抗炎作用 炎性細胞也是影響糖尿病創(chuàng)面愈合的原因之一。其中巨噬細胞是高度可塑性的細胞，M1型和M2型可以相互轉(zhuǎn)換。高血糖條件下的創(chuàng)面中促炎細胞因子表達增強，而抗炎細胞因子則相反。有研究表明，微藻中的一些類胡蘿卜素、多不飽和脂肪酸和碳水化合物顯示出抗炎活性［17］。Zhang等［18］研究表明蛋白核小球藻中的色素蛋白復合物可抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中炎性細胞因子TNF-α和IL-6以及炎癥介質(zhì)一氧化氮（NO）的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，CE組較CON組可以顯著降低促炎因子CD86、IL-1β和TNF-α的表達，提高抗炎因子CD206、IL-10和Arg-1的表達，提示CE可能通過調(diào)控炎癥反應來促進糖尿病創(chuàng)面的愈合。

3.3 CE的抗細菌感染作用 糖尿病創(chuàng)面通常還會伴隨細菌感染。本研究發(fā)現(xiàn)CE對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長均有較強的抑制作用。Hwang等［19］研究發(fā)現(xiàn)CE降低了齲齒中的變形鏈球菌生物膜的活/死細胞比率，提示CE可以通過減少糖尿病創(chuàng)面的細菌感染促進糖尿病創(chuàng)面愈合。

在體內(nèi)實驗中，CE低、中、高劑量組較CON組呈現(xiàn)出更高的創(chuàng)面愈合率，更多的皮膚附屬器和膠原沉積，CE高劑量組療效更好。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，CE治療組的α-SMΑ、CD31、CD206表達增強、CD86表達減弱，提示應用CE可以通過改善糖尿病創(chuàng)面微環(huán)境誘導高水平的血管生成，調(diào)節(jié)免疫反應，進而有效促進創(chuàng)面愈合。本實驗使用聚乙二醇對小球藻的有效成分進行提取，顯示出更高的創(chuàng)面愈合率，可能與提取出的小球藻有效成分（濃度更高或種類更多）有關(guān)。

綜上所述，CE可劑量依賴性地減少糖尿病創(chuàng)面的氧化應激、炎癥反應及細菌感染，從而促進糖尿病創(chuàng)面愈合，本研究為探索CE治療糖尿病創(chuàng)面的可能性提供了理論依據(jù)。

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基金項目：牡丹江市指導性科技計劃項目（HT2022JG125）

作者單位：1牡丹江醫(yī)學院生命科學學院（郵編157011）；2武漢大學人民醫(yī)院婦產(chǎn)科；3湖北大學化學化工學院

作者簡介：黃玉（1995），女，碩士在讀，主要從事糖尿病創(chuàng)面方面研究。E-mail：18208946170@126.com

通信作者 E-mail：wuyan@mdjmu.edu.cn

（本文編輯 李鵬）