miR-582-5p靶向調控FOXO1對新生大鼠缺血缺氧性腦病神經元損傷的影響

摘要：目的 探討微小RNA-582-5p（miR-582-5p）靶向調控叉頭框轉錄因子1（FOXO1）對新生大鼠缺血缺氧性腦病（HIE）神經元損傷的影響。方法 90只新生大鼠按照隨機數字表法均分為對照（NC）組、模型（HIE）組、miRNA對照（LV-miRNA-NC）組、miR-582-5p過表達（LV-miR-582-5p）組、miR-582-5p過表達+mRNA對照（LV-miR-582-5p+LV-NC）組、miR-582-5p過表達+FOXO1過表達（LV-miR-582-5p+LV-FOXO1）組。除NC組外的各組大鼠建立HIE模型，對大鼠進行神經功能缺損評分，TTC染色測定腦梗死體積，Real-time PCR檢測miR-582-5p和FOXO1表達，雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-582-5p和FOXO1靶向關系，HE染色觀察海馬組織病理變化，TUNEL和Neu N熒光雙標共定位檢測海馬組織神經元凋亡，免疫組化染色檢測FOXO1、胱天蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表達。結果 miR-582-5p和FOXO1具有靶向關系，與NC組比較，HIE組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積、FOXO1表達、神經元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表達增加，miR-582-5p表達降低，海馬組織出現病理損傷（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積、FOXO1表達、神經元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表達降低，miR-582-5p表達增加，海馬組織病理損傷好轉（P＜0.05）；LV-FOXO1可以逆轉LV-miR-582-5p對于HIE大鼠神經元損傷的保護作用。結論 miR-582-5p可以直接靶向負調控FOXO1表達，減少HIE新生大鼠神經元凋亡，對神經損傷具有保護作用。

關鍵詞：缺氧缺血，腦；創傷，神經系統；叉頭框蛋白O1；微小RNA-582-5p

中圖分類號：R342，R722.1 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20230591

Effect of miR-582-5p targeting regulation of FOXO1 on neuronal damage in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy

YAN Haifeng1， WU Xiaohong1， LIN Yuqing1， HUO Kaiming1， WANG Yingying2

1 Department of Pediatric Area II， 2 Department of Laboratory， the Second Affiliated Hospital of

Hainan Medical College， Haikou 570311， China

Abstract： Objective To investigate the effect of microRNA-582-5p （miR-582-5p） on neuronal damage in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy （HIE） through targeted regulation of forkhead box transcription factor O1 （FOXO1）. Methods Newborn rats （n=90） were randomly grouped into the control （NC） group， the model （HIE） group， the miRNA non-specific control （LV-miRNA-NC） group， the miR-582-5p overexpression （LV-miR-582-5p） group， the miR-582-5p overexpression+mRNA control （LV-miR-582-5p+LV-NC） group and the miR-582-5p overexpression+FOXO1 overexpression （LV-miR-582-5p+LV-FOXO1） group. HIE model was established in all groups except the NC group， and neurological deficits were scored on rats. TTC staining was applied to measure the volume of cerebral infarction. Real-time PCR was applied to detect miR-582-5p and FOXO1 expression. Dual fluorescence reporter gene experiment was applied to detect the targeting relationship between miR-582-5p and FOXO1. HE staining method was applied to observe pathological changes in hippocampal tissue. TUNEL and NeuN fluorescence dual labeling co localization were applied to detect neuronal apoptosis in hippocampal tissue. Immunohistochemistry was applied to detect expressions of FOXO1 and Caspase-3 proteins. Results There was a targeting relationship between MiR-582-5p and FOXO1. Compared with the NC group， the neurological deficit score， cerebral infarction volume， FOXO1 expression， neuronal apoptosis rate， FOXO1 and Caspase-3 protein expression were increased in the HIE group， and the miR-582-5p expression obviously decreased， the hippocampal tissue showed obvious pathological damage （P＜0.05）. Compared with the LV-miRNA-NC group， the neurological deficit score， cerebral infarction volume， FOXO1 expression， neuronal apoptosis rate， FOXO1 and Caspase-3 protein expression obviously decreased in the LV-miR-582-5p group， and the miR-582-5p expression obviously increased， the pathological damage of" hippocampus tissue was obviously improved （P＜0.05）. LV-FOXO1 was able to reverse the protective effect of LV-miR-582-5p on neuronal damage in HIE rats. Conclusion MiR-582-5p can directly target FOXO1， negatively regulate FOXO1 expression， reduce neuronal apoptosis in HIE neonatal rats， and have a protective effect on neural injury.

Key words： hypoxia-ischemia， brain; trauma， nervous system; forkhead box protein O1; microRNA-582-5p

新生兒缺血缺氧性腦病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是全球新生兒神經系統發病率和病死率高的主要原因之一。研究顯示，15%～20%的HIE新生兒容易在早期死亡，而幸存的新生兒多患有腦癱、癲癇，視力、聽力和認知障礙等嚴重的神經損傷［1-2］。miRNA長度為21～22個核苷酸，在中樞神經系統疾病中發揮重要作用，可與其靶向mRNA的3′-UTR結合，通過沉默mRNA來抑制其轉錄和翻譯［3］。miR-582-5p是一種新發現的非編碼基因，其參與腦缺血再灌注損傷后神經元凋亡的調節［4］。叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，FOXO1）是叉頭轉錄因子家族的成員之一，通過調節下游靶基因的轉錄來調節細胞增殖、凋亡、自噬、氧化應激和能量代謝［5］，抑制其表達可以減少腦缺血再灌注損傷誘導的神經元凋亡［6］。本研究建立新生HIE大鼠模型，探討miRNA-582-5p靶向FOXO1對新生HIE大鼠神經元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 90只7日齡SPF級新生SD大鼠，體質量12～14 g，購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0063。大鼠適應性喂養1周，檢查無異常后用于后續實驗。HEK-293細胞購自武漢尚恩生物技術有限公司；PCR擴增試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；DAB染色試劑盒購自廣州市外顯子生物技術有限公司；雙螢光素酶報告基因試劑盒均購自深圳子科生物科技有限公司；TUNEL（FITC標記）染色液購自廣州威佳科技有限公司；兔抗鼠Neu N抗體、兔抗鼠FOXO1抗體、兔抗鼠胱天蛋白酶3（Caspase-3）抗體、兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、TRITC標記和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分組 將新生大鼠按照隨機數字表法分為對照（NC）組、模型（HIE）組、miRNA對照（LV-miRNA-NC）組、miR-582-5p過表達（LV-miR-582-5p）組、miR-582-5p過表達+mRNA對照（LV-miR-582-5p+LV-NC）組、miR-582-5p過表達+FOXO1過表達（LV-miR-582-5p+LV-FOXO1）組，每組15只。除NC組外，麻醉75只新生大鼠，暴露左側頸動脈并結扎，室溫放置1 h后，置于缺氧倉（37 ℃、8%O2和92%N2）中處理2 h，大鼠出現左旋即為造模成功［7］。NC組只暴露左側頸動脈，不做結扎和缺氧處理；各慢病毒組在造模前分別將LV-miRNA-NC、LV-miR-582-5p、LV-miR-582-5p+LV-NC、LV-miR-582-5p+LV-FOXO1注入側腦室，注射體積10 μL。HIE組在造模前于側腦室注射等量生理鹽水，NC組于暴露左側頸動脈前在側腦室注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積測定 觀察大鼠站立和行走狀態，評分根據5級4分法進行。0分：無明顯神經功能缺損；1分：右前肢伸展障礙；2分：行走時對側旋轉打圈；3分：行走時向對側傾倒；4分：不能自發行走，意識渙散，昏迷。每組隨機取5只大鼠，麻醉取腦，迅速冷凍10 min，將腦組織連續冠狀切片，室溫下使用TTC染色對切片進行染色25 min，Image J軟件測定腦梗死體積。

1.2.3 Real-time PCR檢測大鼠海馬組織miR-582-5p和FOXO1表達 每組繼續隨機取5只大鼠，麻醉處死。取大鼠海馬組織，勻漿后，加入Trizol試劑提取總RNA，根據反轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，取適量cDNA進行擴增。miR-582-5p：上游5′-GCGGTTACAGTTGTTCAACC-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；FOXO1：上游5′-TTTGCCCCAGATGCCTATAC-3′，下游5′-GGAGAGTCAGAAGTCAGCAAC-3′；U6：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；GAPDH：上游5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。FOXO1以GAPDH為內參，miR-582-5p以U6為內參。2-ΔΔCt法檢測miR-582-5p和FOXO1 mRNA相對表達水平。

1.2.4 miR-582-5p和FOXO1的靶向關系驗證 利用生物信息學網站starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn）預測miR-582-5p和FOXO1的結合位點。取對數生長期HEK-293細胞，胰蛋白酶消化后重懸。構建FOXO1野生型（WT）和突變型（MUT）質粒，分別記為FOXO1-WT、FOXO1-MUT，將miR-NC與FOXO1-WT或FOXO1-MUT（miR-NC和FOXO1-WT共轉染組、miR-NC和FOXO1-MUT共轉染組），miR-582-5p" mimics與FOXO1-WT或FOXO1-MUT（miR-582-5p mimics與FOXO1-WT共轉染組、miR-582-5p mimics與FOXO1-MUT共轉染組）分別共轉染至HEK-293細胞懸液中，轉染48 h后根據雙螢光素酶試劑盒檢測各組細胞螢光素酶活性。實驗重復6次。

1.2.5 海馬組織病理變化和海馬神經元細胞凋亡檢測 取每組剩余的5只大鼠，麻醉處死并取腦，分離海馬組織，乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟水化，根據HE試劑盒說明書進行染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。余石蠟切片脫蠟后梯度乙醇脫水，加入不含DNase的蛋白酶K孵育10 min，PBS洗滌后，加入Neu N（1∶500）抗體和TUNEL（FITC標記）染色液（1∶100），置于37 ℃孵育2 h，PBS洗滌后，加入二抗（TRITC標記，1∶1 000），37 ℃孵育45 min，光學顯微鏡下拍照。凋亡神經元顯示綠色熒光，正常神經元顯示紅色熒光。采用Image J軟件進行量化。凋亡率（%）=綠色熒光標記細胞/（綠色熒光標記細胞+紅色熒光標記細胞）×100%。

1.2.6 免疫組化檢測FOXO1、Caspase-3蛋白表達 取1.2.5制備的石蠟切片，常規脫蠟，使用10%過氧化氫甲醇溶液避光處理40 min，胰蛋白酶抗原修復10 min，山羊血清封閉后加入一抗FOXO1（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000），37 ℃放置1 h后，4 ℃過夜。PBS沖洗后加入二抗（1∶500），37 ℃孵育40 min后加入DAB顯色，封片后光學顯微鏡下觀察。目的蛋白陽性表達率=陽性細胞數（染成黃褐色的細胞）/總細胞數×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0進行數據分析。符合正態分布的計量資料用[x] ±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能缺損評分和腦梗死體積變化比較 與NC組比較，HIE組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積增加（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積降低（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積增加（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 各組大鼠海馬組織FOXO1和miR-582-5p表達比較 與NC組比較，HIE組FOXO1表達增加，miR-582-5p降低（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組FOXO1表達降低，miR-582-5p增加（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組FOXO1表達增加（P＜0.05），見表2。

2.3 miR-582-5p和FOXO1靶向關系驗證 生物信息學分析顯示miR-582-5p與FOXO1 3′-UTR存在7個連續的核苷酸結合位點，見圖2。雙螢光素酶報告基因實驗顯示，與miR-NC和FOXO1-WT共轉染組（1.03±0.10）比較，miR-582-5p mimics與FOXO1-WT共轉染組（0.45±0.04）細胞螢光素酶活性降低（n=6，t=13.191，P＜0.05）；與miR-NC和FOXO1-MUT共轉染組（0.99±0.11）比較，miR-582-5p mimics與FOXO1-MUT共轉染組（1.02±0.10）細胞螢光素酶活性差異無統計學意義（n=6，t=0.494，P＞0.05）。

2.4 各組海馬組織病理學變化 NC組大鼠海馬組織結構完整清晰，細胞排列整齊；HIE組和LV-miRNA-NC組大鼠缺血側海馬組織細胞腫脹變形，排列紊亂，大量細胞死亡，部分細胞核固縮；LV-miR-582-5p組和LV-miR-582-5p+LV-NC組大鼠海馬組織病理變化好轉，細胞排列較整齊，細胞死亡數量減少；LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠海馬組織細胞死亡增多，細胞排列紊亂。見圖3。

2.5 過表達miR-582-5p或FOXO1對大鼠海馬組織神經元凋亡的影響 NC組、HIE組、LV-miRNA-NC組、LV-miR-582-5p組、LV-miR-582-5p+LV-NC組、LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組的海馬組織神經元凋亡率（%）分別為1.01±0.02、28.22±4.35、29.05±3.12、17.24±2.01、16.55±2.36、23.21±2.29（n=5，F=73.940，P＜0.01）。與NC組比較，HIE組大鼠海馬組織神經元凋亡率增加（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠海馬組織神經元凋亡率降低（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠海馬組織神經元凋亡率增加（P＜0.05）。見圖4。

2.6 各組海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白相對表達水平比較 與NC組比較，HIE組大鼠海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白表達增加（P＜0.05）；與LV-miRNA-NC組比較，LV-miR-582-5p組大鼠海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白表達降低（P＜0.05）；與LV-miR-582-5p+LV-NC組比較，LV-miR-582-5p+LV-FOXO1組大鼠海馬組織FOXO1、Caspase-3蛋白表達增加（P＜0.05）。見表3、圖5。

3 討論

HIE是由圍產期窒息誘發的中樞神經系統疾病，是引發新生兒死亡的第二大常見原因［8］。HIE不僅影響兒童的智力水平，還會導致嚴重的神經功能障礙，腦缺血損傷后易引起神經元死亡，進而加重神經損傷［9］。本研究結果顯示，與NC組比較，HIE組神經功能缺損評分、腦梗死體積增加，并出現神經元死亡，提示造模成功。

miRNA在身體的發育和代謝過程中起著至關重要的調節作用，中樞神經系統中miRNA與神經細胞的發育、分化和生理功能密切相關，對腦缺氧缺血后的神經病變和功能障礙起重要的調節作用［10］。細胞實驗發現，過表達miR-582-5p可以抑制神經元凋亡［11］。miR-582-5p還可以增強神經球的形成和維持神經干細胞的干性，并且促進其神經干細胞增殖，可為腦病研究和體內神經發生提供新的靶點［12］。本研究結果顯示，過表達miR-582-5p可改善新生HIE大鼠海馬組織病理學改變，并且神經功能缺損評分和腦梗死體積降低，表明過表達miR-582-5p可改善新生HIE大鼠神經功能和腦損傷，提示miR-582-5p可能是臨床治療HIE的潛在靶點。

FOXO1是心臟、骨骼肌、肝臟和大腦自噬的關鍵調節因子，通過去乙酰化FOXO1來抑制炎癥和細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷，在維持自噬降解活性和發育神經元的形態成熟方面起著重要作用［13］。研究發現，FOXO1是miR-582-5p的靶基因，miR-582-5p可靶向下調FOXO1表達來抑制單核細胞凋亡［14］。miRNA可以通過調節其靶基因來影響中樞神經系統疾病的發展，如miR-9通過抑制孤兒核受體Tailless樣蛋白（TLX）表達來抑制神經干細胞增殖并促進神經分化［15］。本研究雙螢光素酶基因報告實驗結果顯示，miR-582-5p可以與FOXO1的3′-UTR結合，并靶向負調控FOXO1表達，過表達miR-582-5p抑制了神經元凋亡，且過表達FOXO1逆轉了過表達miR-582-5p對于神經元損傷的改善作用，提示miR-582-5p可通過調節FOXO1表達來參與HIE大鼠神經元損傷的保護作用。

HIE引發的腦損傷是一個復雜過程，涉及氧化應激和神經元凋亡等病理生理過程，腦缺氧缺血后通常引起氧化應激反應，進而引發神經元凋亡［16］。細胞凋亡在圍產期腦損傷和神經元損傷中具有重要作用，而抑制神經元凋亡并促進腦再生和修復對于HIE治療至關重要［17］。Caspase-3是Caspase家族中的關鍵蛋白酶，是啟動凋亡程序的重要因子［18］。本研究結果顯示，HIE大鼠較NC組大鼠的海馬組織神經元凋亡增加，促凋亡蛋白Caspase-3表達增加；而過表達miR-582-5p抑制了神經元凋亡，下調了Caspase-3表達，并且改善了海馬組織病理損傷，再次證實了miR-582-5p可通過減少神經細胞凋亡來保護HIE大鼠神經元。

綜上所述，miR-582-5p通過靶向下調FOXO1表達來抑制神經元凋亡，發揮對HIE大鼠神經元損傷的保護作用，但是miR-582-5p/FOXO1保護神經元的機制較為復雜，對于FOXO1調節下游蛋白來改善神經元損傷的機制有待進一步研究。

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基金項目：2020年度海南省衛生健康行業科研項目［瓊衛科教（2020）9號389］

作者單位：1海南醫學院第二附屬醫院兒科二區（郵編570311），2檢驗科

作者簡介：顏海峰（1980），男，副主任醫師，主要從事新生兒（早產兒）醫學、重癥醫學、營養與兒童健康方面研究。E-mail：vj3byi2@163.com

（本文編輯 陸榮展）