潤肺益腎飲對肺癌荷瘤大鼠的抑瘤作用和腫瘤免疫微環境的影響

摘要：目的 探討潤肺益腎飲對肺癌荷瘤大鼠的抑瘤作用和腫瘤免疫微環境的影響。方法 將Lewis肺癌細胞接種于大鼠右季肋部皮下建立肺癌大鼠模型，隨機分為模型組、潤肺益腎飲低劑量（潤肺益腎飲-L）組（3.5 g/kg）、潤肺益腎飲中劑量（潤肺益腎飲-M）組（7.0 g/kg）、潤肺益腎飲高劑量（潤肺益腎飲-H）組（14.0 g/kg）以及陽性藥組（6 mg/kg順鉑），并以正常大鼠為對照組；干預結束后，計算各組大鼠肺指數、脾臟指數及抑瘤率；收集血液，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中轉化生長因子（TGF）-β、白細胞介素（IL）-2、γ干擾素（IFN-γ）水平；流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群；分離肺腫瘤組織，HE染色檢測其病理學變化，Western blot檢測腫瘤組織程序性死亡受體1（PD-L1）和B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）表達。結果 與對照組相比，模型組病理損傷嚴重，肺指數、TGF-β、CD8+、PD-L1、Bcl-2表達水平升高，脾指數、IL-2、IFN-γ、CD3+、CD4+及CD4+/CD8+降低（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組病理損傷逐漸得到改善，肺指數、瘤質量、CD8+、TGF-β、PD-L1、Bcl-2表達水平降低，脾指數、IL-2、IFN-γ、CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組各指標與陽性藥組差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 潤肺益腎飲可顯著抑制肺癌荷瘤大鼠的腫瘤生長，改善腫瘤免疫微環境。

關鍵詞：癌，Lewis肺；腫瘤微環境；潤肺益腎飲；抑瘤

中圖分類號：R734.2 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20230694

The anti-tumor effect of Runfei Yishen drink on lung cancer bearing rats and its impact on tumor immune microenvironment

ZHANG Caidie， JIN Yan， ZHANG Dede

Emergency Department， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430014， China

Abstract： Objective To explore the anti-tumor effect of Runfei Yishen drink on lung cancer bearing rats and its impact on tumor immune microenvironment. Methods A lung cancer rat model was established by injecting Lewis lung cancer cells subcutaneously into right quarter rib of rats， and model rats were randomly divided into the model group， the low dose Runfei Yishen drink （Runfei Yishen drink-L） group （3.5 g/kg）， the medium dose Runfei Yishen drink （Runfei Yishen drink-M） group （7.0 g/kg）， the high dose Runfei Yishen drink （Runfei Yishen drink-H） group （14.0 g/kg） and the positive drug group （6 mg/kg cisplatin）. Normal rats were used as the control group. After the intervention， lung index， spleen index and tumor inhibition rate of rats were calculated in each group. Blood samples were collected， and serum levels of transforming growth factor-β （TGF-β）， interleukin （IL）-2 and interferon g （IFN-g） were detected by ELISA. T lymphocyte subsets in peripheral blood were detected by flow cytometry. Lung tumor tissue was isolated and its pathological changes were detected by HE staining. The expression levels of programmed death receptor 1 （PD-L1） and B-lymphoblastoma-2 （Bcl-2） were detected by Western blot assay. Results Compared with the control group， the pathological injury of the model group was serious， the lung index， TGF-β， CD8+， and the expression levels of PD-L1 and Bcl-2 were increased， and the spleen index， IL-2， IFN-γ， CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ were decreased （P＜0.05）. Compared with the model group， the pathological damage of the Runfei Yishen drink-L group， the Runfei Yishen drink-M group and the Runfei Yishen drink-H group gradually improved， the lung index， tumor weight， CD8+， TGF-β and the expression levels of PD-L1 and Bcl-2 were decreased， and spleen index， IL-2， IFN-γ， CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+ were increased （P＜0.05）. There were no significant differences in above indexes between the Runfei Yishen drink-H group and the positive drug group （P＞0.05）. Conclusion Runfei Yishen drink can obviously inhibit tumor growth and improve the tumor immune microenvironment in lung cancer bearing rats.

Key words： carcinoma， Lewis lung; tumor microenvironment; Runfei Yishen drink; tumor suppression

肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中后者占所有肺癌的80%～85%［1］。目前肺癌的常規治療方法包括手術、化療、放療和靶向治療等。肺癌患者確診時多處于中晚期，已出現轉移和局部侵襲。而晚期肺癌患者對常規治療反應較差，5年生存率不足15%［2-3］。因此尋找有效的治療藥物對于抑制腫瘤生長，改善患者預后意義重大。研究顯示，中草藥在腫瘤治療領域具有多靶點、不良反應少的優勢，應用前景較好［4］。潤肺益腎飲是由西洋參、茯苓、冬蟲夏草、枸杞、紅參等構成，具有補腎益精、固肺防感等藥理作用，無明顯不良反應，對治療慢性阻塞性肺疾病療效顯著［5］，但其在治療肺癌方面尚鮮見報道。鑒于中醫藥在調節腫瘤免疫微環境方面起關鍵作用，而腫瘤免疫微環境又在腫瘤形成過程中發揮重要作用［6-7］，因此關注中醫藥對腫瘤免疫微環境的調節，可為藥物應用于腫瘤的臨床治療提供依據。本研究旨在探討潤肺益腎飲對肺癌荷瘤大鼠的抑瘤作用和腫瘤免疫微環境的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞及動物 Lewis肺癌細胞系由中國科學院上海細胞庫提供，將細胞維持在含有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素RPMI-1640培養基中，取對數生長期細胞進行實驗。60只雄性Wistar大鼠，7周齡，體質量200～230 g，購自導科醫藥技術（廣東）有限公司，動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0060。大鼠飼養于動物飼養房，室內溫度保持在（22±2）℃，大鼠自由獲取食物、水。本研究已獲得動物護理和使用委員會的批準（批準號：H20220604）。

1.1.2 實驗試劑 潤肺益腎飲為武漢市中醫醫院制劑；順鉑注射液購自南京制藥廠有限公司；轉化生長因子（TGF）-β、白細胞介素（IL）-2、γ干擾素（IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（ELSIA）試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；兔抗鼠程序性死亡受體1（PD-L1）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）一抗及羊抗兔二抗購自Abcam公司；CD4+、CD8+抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；CD3+抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司。電子精密天平購自Sartorius公司；ELX800酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌荷瘤大鼠模型的制備及干預 按隨機數字表法抽取大鼠制備肺癌荷瘤大鼠模型［8］：取對數生長期的Lewis肺癌細胞，制備細胞懸液，取0.2 mL（2×106個）細胞懸液接種于大鼠右季肋部皮下，4 d后觀察大鼠腫瘤生長狀況，有明顯的腫瘤包塊標志造模成功。將造模成功的50只大鼠依據隨機數字表法分為模型組、潤肺益腎飲低劑量（潤肺益腎飲-L）組、潤肺益腎飲中劑量（潤肺益腎飲-M）組、潤肺益腎飲高劑量（潤肺益腎飲-H）組和陽性藥組，并以正常大鼠作為對照組，每組10只。其中潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組參考換算給藥劑量［9］分別給予大鼠3.5、7.0、14.0 g/kg潤肺益腎飲灌胃（相當于體質量60 kg成人每日用量的3、6、12倍），同時腹腔注射等量生理鹽水；陽性藥組給予6 mg/kg順鉑腹腔注射干預［10］，同時灌胃等量生理鹽水；模型組及對照組灌胃和腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續給藥7 d。

1.2.2 樣本收集及肺指數、脾臟指數檢測 末次干預后24 h，各組稱取體質量，腹主動脈采血2 mL，頜下靜脈采血1 mL，于4 ℃冰箱冷藏備用。然后腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，立即脫頸處死、解剖大鼠，暴露胸腔和腹部，取出肺、脾，于-20 ℃冰箱保存備用。肺指數和脾臟指數以組織質量/體質量表示。

1.2.3 ELISA檢測各組大鼠血清中TGF-β、IL-2、IFN-γ水平 將1.2.2收集的1 mL大鼠頜下靜脈血靜置30 min，3 000×g離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明書檢測血清TGF-β、IL-2、IFN-γ水平。

1.2.4 外周血T淋巴細胞亞群檢測 取1.2.2收集的2 mL腹主動脈血，用PBS稀釋，使用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，PBS洗滌后重懸，加入含10 μL CD3+、CD4+、CD8+單抗的離心管中，之后以紅細胞裂解液混勻，孵育10 min，3 000×g離心10 min后取沉淀，固定并重懸后，分析T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比，并計算CD4+/CD8+。

1.2.5 大鼠瘤質量及抑瘤率 取出肺臟中的瘤塊，稱質量，計算抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤質量-用藥組平均瘤質量）/模型組平均瘤質量×100%。

1.2.6 HE染色觀察肺腫瘤組織病理學變化 取部分肺腫瘤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水、固定后，進行常規連續切片（厚度5 μm），經HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肺組織病變情況。

1.2.7 Western blot檢測肺組織中PD-L1、Bcl-2蛋白表達水平 將剩余肺腫瘤組織用裂解液勻漿、離心，取上清液采用BCA法進行蛋白定量。取60 μg蛋白上樣，經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓120 V）分離，以0.65 mA/cm2的電流將分離的蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加PD-L1、Bcl-2抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃過夜，第2日用羊抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG二抗室溫孵育2 h，然后用ECL化學發光劑分析蛋白表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 27.0軟件進行數據分析。計量資料以[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺指數、脾臟指數比較 與對照組相比，模型組肺指數增加，脾臟指數降低（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組肺指數降低，脾臟指數增加，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血清中TGF-β、IL-2水平比較 與對照組相比，模型組TGF-β水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組TGF-β水平降低，IL-2、IFN-γ水平升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 各組外周血T淋巴細胞亞群變化比較 與對照組相比，模型組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平降低，CD8+水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平升高，CD8+水平降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 各組大鼠瘤質量及抑瘤率變化比較 與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組瘤質量降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組抑瘤率逐步升高（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

2.5 各組大鼠肺腫瘤組織病理學變化比較 對照組無顯著病理學變化；模型組炎性細胞浸潤嚴重；潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組病變程度依次減輕；其中潤肺益腎飲-H組與陽性藥組病變程度相似，見圖1。

2.6 各組大鼠肺組織中PD-L1、Bcl-2蛋白表達水平比較 與對照組相比，模型組PD-L1、Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，潤肺益腎飲-L組、潤肺益腎飲-M組、潤肺益腎飲-H組PD-L1、Bcl-2蛋白表達水平降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；潤肺益腎飲-H組與陽性藥組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表3。

3 討論

肺癌的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一［11］。目前雖然肺癌治療方法提高了部分患者的生存率，但肺癌患者的總體生存率仍很低［12］。因此，篩選治療肺癌的新型藥物非常重要。

中醫藥在改善預后方面具有潛在的治療價值［13］。中醫認為肺癌以氣陰兩虛證、肺脾氣虛為主，臨床癥狀主要是胸悶、咳嗽、氣短為主，其藥物的選用要以化痰止咳藥、清熱藥、活血化瘀、補虛藥為首［14］。潤肺益腎飲由西洋參、茯苓、冬蟲夏草、枸杞子、紅參等構成；其中，紅參具有補脾益肺、大補元氣之功效；冬蟲夏草則可補肺止咳平喘、補精益髓；枸杞補腎陰、茯苓健脾祛濕，兩者結合可補腎陰、益精氣；西洋參清熱生津，益精養血，諸藥結合，通過調節免疫功能，抑制肺部疾病發展［15-16］。本研究采用右季肋部皮下接種Lewis肺癌細胞的方法制備肺癌模型，結果顯示，模型組大鼠炎性細胞浸潤，肺指數顯著增加，脾臟指數顯著降低，與既往研究報道［17］類似，提示肺癌大鼠模型構建成功。經不同劑量潤肺益腎飲干預后，其病理損傷得到改善，肺指數顯著降低，脾臟指數顯著增加，抑瘤率增加，且呈劑量依賴性，表示潤肺益腎飲具有抑制腫瘤生長的作用，且高劑量潤肺益腎飲的抑制效果更好，且與陽性藥順鉑的作用相近。

腫瘤微環境由免疫細胞、非免疫基質細胞和細胞外基質蛋白組成，是腫瘤生長、進展和轉移以及抗腫瘤免疫反應的關鍵調節劑，被視為腫瘤的“第七大標記性特征”［18］。研究表明，免疫檢查點分子（PD-L1）和免疫細胞（CD3+、CD4+、CD8+）可作為腫瘤微環境的標志物，其中CD4+/CD8+值變化可以作為監測免疫狀態的指標；而PD-L1可結合T細胞表面受體，促進細胞凋亡，進而發生免疫逃逸［19］。T細胞Treg細胞因子可產生TGF-β等細胞因子，有助于腫瘤細胞的遷移和侵襲［10］。IL-2是T細胞在體外長期生長所必需的因子，在抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用［20］。IFN-γ是反映T細胞功能的指標，對細胞免疫應答具有促進作用［21］。本研究結果顯示，模型組大鼠TGF-β、PD-L1、Bcl-2表達水平增加，IL-2、IFN-γ、CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平顯著降低，CD8+水平顯著增加，與王宏君等［22］的研究一致，提示肺癌大鼠免疫功能紊亂；而經不同劑量潤肺益腎飲干預后，可逆轉上述指標變化，提示潤肺益腎飲能夠改善肺癌大鼠免疫系統功能，減輕肺癌病理損傷，且劑量越高改善效果越好；高劑量潤肺益腎飲對上述指標的作用與陽性藥順鉑相近，均能改善肺癌大鼠的免疫功能，抑制相近腫瘤組織生長。既往研究顯示，順鉑通過激活ERK通路調控PD-L1表達［23］。故本研究推測潤肺益腎飲可能亦可通過ERK通路抑制PD-L1表達，但這需要進一步研究證實。

綜上所述，潤肺益腎飲可通過改善肺癌荷瘤大鼠腫瘤免疫微環境，抑制腫瘤生長，可能與下調PD-L1表達，促進細胞凋亡有關，但其機制有待進一步研究。

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基金項目：武漢市科學技術局2022年度知識創新專項項目（2022020801020587）

作者單位：武漢市中醫醫院急診科（郵編430014）

作者簡介：張彩蝶（1989），女，主治醫師，主要從事中西醫結合治療腫瘤方面研究。E-mail：fwn0iaf@163.com

（本文編輯 陳麗潔）