隱丹參酮調節HIF-1α/BNIP3信號通路對兔膝骨關節炎模型軟骨細胞自噬和凋亡的影響

摘要：目的 探究隱丹參酮調節缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3（BNIP3）信號通路對兔膝骨關節炎（KOA）模型軟骨細胞自噬和凋亡的影響。方法 取新西蘭兔并以改良Videman法構建兔KOA模型，隨機分為模型組、空載組、隱丹參酮組、HIF-1α敲低組、隱丹參酮+HIF-1α敲低組，每組9只；另取9只新西蘭兔為對照組。分組干預后以Lequesne MG的膝關節級別評估法對兔膝關節臨床癥狀（局部疼痛、步態、關節活動、關節腫脹）進行評分；HE染色檢測兔膝關節軟骨組織的退變情況并進行改良Mankin's評分；TUNEL染色檢測兔膝關節軟骨組織細胞凋亡情況；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測兔血清炎性因子白細胞介素（IL）-6、IL-18、IL-10水平；蛋白免疫印跡實驗檢測兔膝關節軟骨組織自噬（LC3、Beclin-1）、凋亡（Bax、Cleaved Caspase-3）和HIF-1α/BNIP3信號通路相關蛋白表達。結果 與對照組比較，模型組兔膝關節軟骨組織出現明顯退變癥狀，局部疼痛、步態、關節活動及關節腫脹評分、改良Mankin's評分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、軟骨組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表達水平升高，血清IL-10水平、軟骨組織HIF-1α蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，隱丹參酮組兔膝關節軟骨組織退變癥狀減輕，局部疼痛、步態、關節活動及關節腫脹評分、改良Mankin's評分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、軟骨組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表達水平降低，血清IL-10水平、軟骨組織HIF-1α蛋白表達水平升高（P＜0.05）；HIF-1α敲低組兔膝關節軟骨組織退變癥狀加重，局部疼痛、步態、關節活動及關節腫脹評分、改良Mankin's評分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、軟骨組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表達水平升高，血清IL-10水平、軟骨組織HIF-1α蛋白表達水平降低（P＜0.05）；空載組兔各指標無明顯變化（P＞0.05）。隱丹參酮+HIF-1α敲低組較隱丹參酮組兔膝關節軟骨組織退變癥狀加重，局部疼痛、步態、關節活動及關節腫脹評分、改良Mankin's評分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、軟骨組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表達水平升高，血清IL-10水平、軟骨組織HIF-1α蛋白表達水平降低（P＜0.05）；較HIF-1α敲低組上述指標變化相反。結論 隱丹參酮可通過上調HIF-1α、下調BNIP3表達，抑制炎癥及自噬，減輕KOA兔膝關節軟骨組織退變，改善其臨床癥狀。

關鍵詞：隱丹參酮；骨關節炎，膝；軟骨細胞；自噬；凋亡；HIF-1α/BNIP3

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20230861

Impacts of cryptotanshinone on autophagy and apoptosis of chondrocytes in rabbit model of knee osteoarthritis by regulating HIF-1α/BNIP3 signaling pathway

WANG Ke1， YE Hanlu2

1 Department of Orthopedics and Traumatology， 2 Department of Endocrinology， Wuhan Traditional Chinese Medicine Hospital， Wuhan 430014， China

Corresponding Author E-mail： jueax516@163.com

Abstract： Objective To investigate the impact of cryptotanshinone on autophagy and apoptosis of chondrocytes in a rabbit knee osteoarthritis （KOA） model by regulating the hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）/BCL2 and adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein 3 （BNIP3） signaling pathway. Methods New Zealand rabbits were selected to construct the rabbit KOA model using the improved Videman method. Rabbits were randomly divided into the model group， the empty group， the cryptotanshinone group， the HIF-1α knockdown group and the cryptotanshinone+HIF-1α knockdown group， with 9 rabbits in each group. Another 9 New Zealand rabbits were taken as the control group. After grouping and intervention， Lequesne MG knee joint level assessment method was used to score clinical symptoms of knee joints （local pain， gait， joint activity and joint swelling） of rabbits. HE staining was used to detect the cartilage degeneration of rabbit knee joint cartilage tissue， and modified Mankin's score was performed. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of articular cartilage histiocytes of rabbits. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method was used to detect serum levels of inflammatory cytokines interleukin-6 （IL-6）， IL-18 and IL-10 in rabbits. Western blot experiment was used to detect the expression of autophagy （LC3， Beclin-1）， apoptosis （Bax， Cleaved Caspase-3） and HIF-1α/BNIP3 signaling pathway related proteins in knee cartilage tissue of rabbits. Results Compared with the control group， the knee joint cartilage tissue of rabbits showed obvious degenerative symptoms， the scores of local pain， gait， joint activity and joint swelling， the modified Mankin's score， apoptosis rate， levels of serum IL-18 and IL-6， and the expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and Beclin-1， Bax， Cleaved Caspase-3， BNIP3 proteins in cartilage tissue were increased in the model group， and the serum level of IL-10 and the expression of HIF-1α protein in cartilage tissue were decreased （P＜0.05）. Compared with the model group， the symptoms of cartilage tissue degeneration in knee joint of rabbits were alleviated， scores of local pain， gait， joint activity and joint swelling， the modified Mankin's score， apoptosis rate， serum levels of IL-18 and IL-6， and the expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin-1， Bax， Cleaved Caspase-3， BNIP3 proteins in cartilage tissue were decreased in the cryptotanshinone group， and the serum level of IL-10 and the expression of HIF-1α protein in cartilage tissue were obviously increased （P＜0.05）. There was no obvious changes in all indicators of rabbits in the empty group （P＞0.05）. Compared with the cryptotanshinone group， the symptoms of cartilage tissue degeneration in knee joint of rabbits worsened in the cryptotanshinone+HIF-1α knockdown group， and scores of local pain， gait， joint activity and joint swelling， the modified Mankin's score， apoptosis rate， serum levels of IL-18 and IL-6 and the expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin-1， Bax， Cleaved Caspase-3， BNIP3 proteins in cartilage tissue were increased， the level of serum IL-10 and the expression of HIF-1α protein in cartilage tissue were decreased （P＜0.05）. Changes were opposite to those of the HIF-1α knock-down group. Conclusion Cryptotanshinone can up-regulate HIF-1α to down-regulate BNIP3 expression， inhibit inflammation and autophagy， reduce the degeneration of knee joint cartilage tissue in KOA rabbits， and improve its clinical symptoms.

Key words： cryptotanshinone; osteoarthritis， knee; chondrocytes; autophagy; apoptosis; HIF-1α/BNIP3

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是膝關節的一種退行性疾病，其病理特點為關節軟骨變性退變、關節邊緣和軟骨下骨增生及骨贅生成，可造成患者關節畸形、疼痛和功能障礙，病情嚴重者會引發肢體殘疾［1-3］。軟骨細胞是構成關節軟骨的唯一細胞成分，能維持軟骨形態和正常功能，軟骨細胞發生變性損傷是KOA發病機制的重要環節，抑制其自噬及凋亡可減輕其變性損傷，進而延緩KOA進展［4-5］。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）與KOA軟骨細胞自噬、凋亡和衰老關系密切，可對軟骨起到保護作用，穩定其表達可減輕軟骨細胞的凋亡、衰老和KOA小鼠軟骨降解［6］。腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3（BNIP3）是重要的自噬調控因子，在骨關節炎（osteaarth ritis，OA）軟骨細胞中表達高于正常軟骨細胞，抑制BNIP3表達可減少OA誘導的軟骨細胞凋亡［7］，而沉默HIF-1α可激活BNIP3信號和線粒體自噬，從而導致OA軟骨細胞凋亡級聯反應的激活［8］，由此推測通過阻斷HIF-1α/BNIP3信號傳導來抑制軟骨細胞自噬和凋亡可能是KOA的潛在治療措施。隱丹參酮是丹參中的一種主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗衰老等作用，可抑制慢性不可預見應激聯合脂多糖所致小鼠過強的氧化應激與神經炎癥反應，并通過減輕神經元損傷而緩解其抑郁癥狀［9］。隱丹參酮還可抑制軟骨細胞凋亡，進而緩解OA小鼠關節疼痛［10］。但隱丹參酮是否可通過調節HIF-1α/BNIP3信號影響KOA軟骨細胞自噬和凋亡目前尚未明確。本文通過制備兔KOA模型，對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級新西蘭兔，6月齡，雄性，體質量1.6～2.4 kg，瑞陽制藥股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（魯）2021-0004，在本院動物房中進行單籠飼養，房內溫度設定在22～25 ℃，濕度設定在50%～60％，自然照明，兔自由進食飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器 隱丹參酮（純度99.0%，批號110852-201807）購自中國食品藥品檢定研究院；HIF-1α siRNA質粒及空載質粒購自江蘇賽索飛生物科技有限公司；HE與TUNEL染色試劑盒、兔白細胞介素（IL）-6、IL-18及IL-10酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯驢抗小鼠IgG二抗、小鼠抗兔β?actin、HIF-1α、BNIP3、LC3、Beclin-1、Bax與Cleaved Caspase-3一抗購自漢恒生物科技（上海）有限公司。LS-2065型輪轉式石蠟切片機購自達科為（深圳）醫療設備有限公司；EVOSTM M7000型顯微成像系統、VarioskanTM LUX型多功能酶標分析儀、XCell SureLock Mini-Cell型垂直蛋白電泳系統、XCell Ⅱ Blot Module型小型蛋白轉印系統購自賽默飛世爾科技中國有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備KOA兔模型及分組治療干預 參照文獻［11］，以改良Videman法制備兔模型：將新西蘭兔以仰臥位固定后，將石膏托放置在兔左后肢膝前，保持踝關節背曲60°且膝關節伸直中立位0°的同時，用高分子石膏繃帶螺旋纏繞進行固定。6周后進行Lequesne MG的膝關節級別評估［12］。局部疼痛：以棉簽擠壓患處，兔無疼痛反應，為1級，評0分；患肢出現收縮，為2級，評1分；患肢出現收縮、痙攣并伴有如回頭舔吮、全身顫抖等輕微全身反應，為3級，評2分；患肢劇烈收縮、痙攣并伴有如掙扎、全身顫抖、亂竄等明顯全身反應，為4級，評3分。步態：患肢蹬地有力，跑動正常且未出現跋行，為1級，評0分；患肢蹬地有力，跑動時出現輕度跋行，為2級，評1分；患肢可參與行走，但出現明顯跋行，為3級，評2分；患肢不能觸地及蹬地，且不能參與行走，為4級，評3分。關節活動：設定肢體伸直時關節活動度為0°，兔患肢活動度＞90°，為1級，評0分；患肢活動度45°～90°，為2級，評1分；患肢活動度15°～＜45°，為3級，評2分；患肢活動度＜15°，為4級，評3分。關節腫脹：兔患肢關節未發生腫脹且有清楚骨性標記，為1級，評0分；患肢關節發生輕度腫脹且骨性標記變淺，為2級，評1分；患肢關節發生嚴重腫脹且骨性標記消失不見，為3級，評2分。若上述4種膝關節級別評分均較正常兔升高，且X線片可見兔患肢膝關節間隙變小、軟骨表面變粗糙，即表明KOA模型制備成功?？偣苍炷?8只兔，以固定松脫導致失敗3只，成功45只。采用隨機數字表法將其分為模型組、空載組、隱丹參酮組、HIF-1α敲低組、隱丹參酮+HIF-1α敲低組，每組9只；另取9只新西蘭兔作為對照組。

空載組、HIF-1α敲低組分別經尾靜脈注射空載質粒與HIF-1α siRNA質粒（劑量遵照其說明書指導，每周2次），隱丹參酮組兔灌胃7 mg/kg隱丹參酮（1次/d）［10］，同時空載組、HIF-1α敲低組兔灌胃與隱丹參酮組等劑量的生理鹽水（1次/d），隱丹參酮組兔尾靜脈注射與HIF-1α敲低組等劑量的生理鹽水（每周2次）；隱丹參酮+HIF-1α敲低組兔尾靜脈注射HIF-1α siRNA質粒（每周2次），灌胃7 mg/kg隱丹參酮（1次/d）；對照組、模型組兔同時尾靜脈注射與灌胃生理鹽水，各組兔均處理3周。

1.2.2 膝關節癥狀評估及取材 干預處理結束后24 h，根據Lequesne MG膝關節級別評估法對兔膝關節臨床癥狀進行評分，具體評分標準見1.2.1。評分結束后通過腹腔注射戊巴比妥鈉對各組兔進行麻醉，自頸靜脈內采集約2 mL血液進行離心（500×g、4 ℃、10 min），吸出上清液存于-80 ℃備用。以空氣栓塞法處死各組兔，解剖患肢（對照組兔解剖對應側肢體），取出膝關節軟骨組織，剪下約0.7 g進行脫鈣后存于液氮內備用，剩余軟骨組織進行脫鈣處理后以4%多聚甲醛固定，常規脫水、透明后進行石蠟包埋，切為5 μm厚的切片備用。

1.2.3 HE染色檢測兔膝關節軟骨退變情況并進行改良Mankin's評分 取1.2.2中的兔膝關節軟骨組織切片，脫蠟、水化后行HE染色，進行中性樹脂封片，采用顯微成像系統觀察并采集各組兔膝關節軟骨組織圖像，以改良Mankin's法［13］對軟骨退變癥狀進行評分，分值越大表示退變癥狀越嚴重。

1.2.4 TUNEL染色檢測膝關節軟骨組織細胞凋亡 取1.2.2中的兔膝關節軟骨組織切片，脫蠟、水化處理后行TUNEL染色，中性樹脂封片后采用顯微成像系統觀察并采集各組兔膝關節軟骨組織圖像，運用Image-Pro Plus軟件分析圖像定量各組兔膝關節軟骨組織細胞凋亡數及總細胞數，計算凋亡率。凋亡率=細胞凋亡數/總細胞數×100%。

1.2.5 ELISA檢測血清炎性因子IL-18、IL-6、IL-10水平 取1.2.2中存于-80 ℃的兔血清放入冰水浴中解凍，采用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-18、IL-10水平，具體步驟參照各自試劑盒說明書操作。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗檢測軟骨組織自噬（LC3、Beclin-1）、凋亡（Bax、Cleaved Caspase-3）和HIF-1α/BNIP3信號通路相關蛋白表達 取1.2.2中存于液氮內的兔軟骨組織，剪碎后與RAPI緩沖液混勻，高速研磨勻漿后離心（1 000×g、4 ℃、20 min），吸出上清液，BCA法測定兔軟骨組織蛋白樣品液中總蛋白濃度。于100 ℃水浴中變性蛋白，每組取30 μg總蛋白樣本于120 V恒壓下電泳，然后以40 mA恒流濕轉90 min將各組蛋白轉印到PVDF膜上。膜上蛋白于室溫下孵育，5%脫脂奶粉進行封閉，分別加入β-actin、HIF-1α、BNIP3、LC3、Beclin-1、Bax與Cleaved Caspase-3一抗（均以1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗后，于室溫下以HRP偶聯驢抗小鼠IgG二抗（1∶2 000稀釋）孵育2 h，用化學發光試劑對HRP進行顯色后拍照，采用Image-Pro Plus軟件分析圖像定量各組蛋白灰度值。蛋白相對表達量=待測蛋白灰度值/內參蛋白β-actin灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間多重比較行Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隱丹參酮對膝關節臨床癥狀評分的影響 與對照組比較，模型組兔局部疼痛、步態、關節活動、關節腫脹評分升高（P＜0.05）。與模型組比較，隱丹參酮組兔局部疼痛、步態、關節活動、關節腫脹評分降低（P＜0.05）；HIF-1α敲低組兔局部疼痛、步態、關節活動、關節腫脹評分升高（P＜0.05）；空載組兔局部疼痛、步態、關節活動、關節腫脹評分無明顯變化（P＞0.05）。隱丹參酮+HIF-1α敲低組兔局部疼痛、步態、關節活動、關節腫脹評分高于隱丹參酮組，低于HIF-1α敲低組（P＜0.05），見表1。

2.2 隱丹參酮對膝關節軟骨組織退變癥狀及細胞凋亡的影響 對照組兔膝關節軟骨表層光滑平整、潮線清晰、基質染色均勻且細胞排列整齊，關節軟骨組織無退變表現。模型組兔膝關節軟骨組織出現明顯退變癥狀，軟骨層變薄且表層出現很多裂隙，細胞排列紊亂且數目稀少，潮線斷裂。與對照組比較，模型組改良Mankin's評分、軟骨組織細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與模型組比較，隱丹參酮組兔膝關節軟骨組織退變癥狀減輕，改良Mankin's評分、軟骨組織細胞凋亡率降低（P＜0.05）；HIF-1α敲低組兔膝關節軟骨組織退變癥狀加重，改良Mankin's評分、軟骨組織細胞凋亡率升高（P＜0.05）；空載組兔膝關節軟骨組織退變癥狀及改良Mankin's評分、軟骨組織細胞凋亡率變化差異無統計學意義（P＞0.05）。隱丹參酮+HIF-1α敲低組較隱丹參酮組兔膝關節軟骨組織退變癥狀加重，改良Mankin's評分、軟骨組織細胞凋亡率升高；較HIF-1α敲低組上述改變相反（P＜0.05）。見圖1、2，表2。

2.3 隱丹參酮對血清炎性因子IL-18、IL-6、IL-10水平的影響 與對照組比較，模型組兔血清IL-18、IL-6水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，隱丹參酮組兔血清IL-18、IL-6水平降低，IL-10水平升高（P＜0.05）；HIF-1α敲低組兔血清IL-18、IL-6水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；空載組兔血清IL-18、IL-6、IL-10水平無明顯變化（P＞0.05）。隱丹參酮+HIF-1α敲低組較隱丹參酮組兔血清IL-18、IL-6水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；較HIF-1α敲低組上述指標變化相反（P＜0.05）。見表3。

2.4 隱丹參酮對膝關節軟骨組織自噬和凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組兔膝關節軟骨組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，隱丹參酮組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低（P＜0.05）；HIF-1α敲低組上述指標表達水平升高（P＜0.05）；空載組上述指標表達水平無明顯變化。隱丹參酮+HIF?1α敲低組上述指標表達水平高于隱丹參酮組，低于HIF-1α敲低組（P＜0.05）。見圖3、表4。

2.5 隱丹參酮對兔膝關節軟骨組織HIF-1α/BNIP3通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組兔膝關節軟骨組織HIF-1α蛋白表達水平降低，BNIP3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，隱丹參酮組HIF-1α蛋白表達水平升高，BNIP3蛋白表達水平降低（P＜0.05）；HIF-1α敲低組HIF-1α蛋白表達水平降低，BNIP3蛋白表達升高（P＜0.05）；空載組HIF-1α、BNIP3蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05）。隱丹參酮+HIF-1α敲低組較隱丹參酮組HIF-1α蛋白表達水平降低，BNIP3蛋白表達水平升高；較HIF-1α敲低組上述指標變化相反（P＜0.05）。見圖4、表5。

3 討論

目前KOA的臨床治療方案包括手術和非手術治療，手術治療費用高，而非甾體類、阿片類等藥物療效有限且存在較多不良反應，因此積極探尋治療KOA的新型藥物具有重要意義［14-15］。本研究采用改良Videman法構建兔KOA模型，結果顯示，造模兔血清促炎因子IL-18、IL-6水平升高，抗炎因子IL-10水平降低，引發體內炎癥，導致其膝關節軟骨組織出現軟骨層變薄且表層裂隙密布、細胞排列紊亂且數目稀少、潮線斷裂等明顯退變癥狀，且兔關節出現疼痛、腫脹、活動受限癥狀，表明KOA模型制備成功。

軟骨細胞自噬和凋亡的過度激活在KOA發生及病情進展中起到關鍵作用，對其進行限制可有效保護軟骨并延緩關節損傷，是KOA的重要防治策略［4-5，16］。隱丹參酮是從丹參根中提取的一種具有抗炎、抗衰老及抗凋亡活性的化合物，在肺纖維化、肺癌和骨關節炎等疾病治療中具有一定療效，可減輕缺血性腦卒中引發的腦梗死［17］，減少脂多糖誘導的重癥急性胰腺炎小鼠炎性細胞浸潤，減輕其組織炎癥損傷［18］，還可減少OA小鼠軟骨細胞凋亡并改善其關節疼痛癥狀［10］。本研究結果顯示，以隱丹參酮干預KOA兔可降低其局部疼痛、步態、關節活動及關節腫脹評分，降低改良Mankin's評分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、軟骨組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平，升高血清IL-10水平，與以往研究結果［17-18］相似。本研究結果亦表明隱丹參酮具有抗炎作用，可增加抗炎因子產生并減少促炎因子產生，證實隱丹參酮能夠抑制KOA兔體內炎癥，與Yue等［10］研究結果相似。本研究結果亦表明隱丹參酮能減輕KOA兔軟骨細胞凋亡，緩解其關節疼痛、軟骨退變、功能障礙等癥狀，提示隱丹參酮在KOA臨床治療中具有開發應用價值。另外，本研究結果表明隱丹參酮能減輕KOA兔軟骨組織自噬，證實自噬可參與隱丹參酮對軟骨細胞凋亡及軟骨組織退變的減輕過程。

HIF-1α是介導軟骨發育或損傷過程的關鍵介質，上調其表達可促進厭氧糖酵解，并提升軟骨細胞活力［19］。低氧誘導HIF-1α表達能引起OA成纖維細胞樣滑膜細胞凋亡增加和線粒體自噬抑制。抑制BNIP3表達可通過誘導OA成纖維細胞樣滑膜細胞線粒體自噬減少和凋亡增加來改善OA癥狀［20］；過表達BNIP3可激活線粒體自噬，并通過上調軟骨降解酶和軟骨細胞死亡來刺激軟骨降解［21］。另外Lu等［8］研究顯示，沉默HIF-1α可上調BNIP3表達并誘導線粒體自噬，從而激活OA軟骨細胞凋亡反應，因此HIF-1α/BNIP3可能是防治KOA并抑制其軟骨細胞自噬和凋亡的潛在作用靶點。本研究結果顯示，與正常兔相比，KOA兔關節軟骨組織HIF-1α蛋白表達降低且BNIP3蛋白表達升高，敲低HIF-1α可促進兔軟骨細胞自噬及凋亡，并加重其關節軟骨退變、疼痛、功能障礙等癥狀，而隱丹參酮處理KOA兔可逆轉其蛋白變化趨勢，提示HIF-1α/BNIP3信號通路可能參與介導了隱丹參酮對KOA兔軟骨細胞自噬和凋亡的抑制過程；以隱丹參酮干預KOA兔的同時敲低HIF-1α可減弱隱丹參酮單獨處理的抗炎功效，消除其對兔軟骨細胞自噬及凋亡的抑制作用，并逆轉其對兔關節軟骨退變、疼痛、功能障礙等癥狀的改善作用，提示隱丹參酮抑制兔KOA模型軟骨細胞自噬和凋亡是通過促進HIF-1α表達實現的。

綜上所述，隱丹參酮可通過上調HIF-1α并降低BNIP3表達，阻止KOA兔體內炎癥，抑制兔KOA模型軟骨細胞自噬與凋亡，減輕膝關節軟骨組織退變、疼痛、功能障礙等癥狀，其可能通過調節HIF-1α/BNIP3信號通路發揮上述藥理功效的。

參考文獻

［1］ SUKERKAR P A，DOYLE Z. Imaging of osteoarthritis of the knee［J］. Radiol Clin North Am，2022，60（4）：605-616. doi：10.1016/j.rcl.2022.03.004.

［2］ 中華醫學會骨科學分會關節外科學組，中國醫師協會骨科醫師分會骨關節炎學組，國家老年疾病臨床醫學研究中心湘雅醫院，等. 中國骨關節炎診療指南（2021年版）［J］. 中華骨科雜志，2021（18）：1291-1314. The Joint Surgery Branch of the Chinese Orthopaedic Association，The Subspecialty Group of Osteoarthritis of the Chinese Association of Orthopaedic Surgeons，The National Clinical Research Center for Geriatric Disorders （Xiangya Hospital），et al. Chinese guideline for diagnosis and treatment of osteoarthritis （2021 edition）［J］. Chin J Orthop，2021，41（18）：1291-1314. doi：10.3760/cma.j.cn121113-20210624-00424.

［3］ SHIMIZU H，SHIMOURA K，IIJIMA H，et al. Functional manifestations of early knee osteoarthritis：a systematic review and meta-analysis［J］. Clin Rheumatol，2022，41（9）：2625-2634. doi：10.1007/s10067-022-06150-x.

［4］ ZHANG S L，ZHANG K S，WANG J F，et al. Corresponding changes of autophagy-related genes and proteins in different stages of knee osteoarthritis：an animal model study［J］. Orthop Surg，2022，14（3）：595-604. doi：10.1111/os.13057.

［5］ JIANG L，MOQBEL SAA，ZHU J，et al. Nesfatin-1 suppresses autophagy of chondrocytes in osteoarthritis via remodeling of cytoskeleton and inhibiting RhoA/ROCK signal pathway［J］. J Orthop Surg Res，2023，18（1）：153-166. doi：10.1186/s13018-023-03539-5.

［6］ HU S，ZHANG C，NI L，et al. Stabilization of HIF-1α alleviates osteoarthritis via enhancing mitophagy［J］. Cell Death Dis，2020，11（6）：481-496. doi：10.1038/s41419-020-2680-0.

［7］ WANG W F，LIU S Y，QI Z F，et al. MiR-145 targeting BNIP3 reduces apoptosis of chondrocytes in osteoarthritis through Notch signaling pathway［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2020，24（16）：8263-8272. doi：10.26355/eurrev_202008_22622.

［8］ LU J，PENG Y，ZOU J，et al. Hypoxia inducible factor-1α is a regulator of autophagy in osteoarthritic chondrocytes［J］. Cartilage，2021，13（2_suppl）：1030S-1040S. doi：10.1177/19476035211035434.

［9］ 陳明珠，黃幼霞，廖婉婷，等. 隱丹參酮對慢性不可預見應激聯合脂多糖所致抑郁小鼠氧化應激和炎癥反應的影響［J］. 現代藥物與臨床，2022，37（7）：1439-1444. CHEN M Z，HUANG Y X，LIAO W T，et al. Effects of cryptotanshinone on oxidative stress and inflammatory response in depressed mice induced by chronic unpredictable stress combined with lipopolysaccharide［J］. Drugs amp; Clinic，2022，37（7）：1439-1444.

［10］ YUE S，SU X，TENG J，et al. Cryptotanshinone interferes with chondrocyte apoptosis in osteoarthritis by inhibiting the expression of miR?574?5p［J］. Mol Med Rep，2021，23（6）：424-433. doi：10.3892/mmr.2021.12063.

［11］ 劉晶，林巧璇，盧莉銘，等. 針刀干預對膝骨關節炎兔股直肌組織形態及超微結構的影響［J］. 中國骨傷，2022，35（3）：281-286. LIU J，LIN Q X，LU L M，et al. Effect of acupotomy intervention on the morphology and ultrastructure of rectus femoris muscle in rabbits with knee osteoarthritis［J］. China Journal of Orthopaedics and Traumatology，2022，35（3）：281-286.

［12］ LEQUESNE M G，SAMSON M. Indices of severity in osteoarthritis for weight bearing joints［J］. J Rheumatol Suppl，1991，27：16-18.

［13］ 鄧紫婷，文麗，賈英. 體外沖擊波對兔膝骨關節炎軟骨組織中轉化生長因子β1和白介素1β表達的影響［J］. 中華物理醫學與康復雜志，2022，44（1）：18-24. DENG Z T，WEN L，JIA Y. The effects of extracorporeal shock wave treatment on the expression of TGF-β1 and IL-1βin the cartilage of an osteaoarthritic knee［J］. Chin J Phys Med Rehabil，2022，44（1）：18-24. doi：10.3760/cma.j.issn.0254-1424.2022.01.003.

［14］ CURRY Z A，BELING A，BORG-STEIN J. Knee osteoarthritis in midlife women：unique considerations and comprehensive management［J］. Menopause，2022，29（6）：748-755. doi：10.1097/GME.0000000000001966.

［15］ MENG Z，LIU J，ZHOU N. Efficacy and safety of the combination of glucosamine and chondroitin for knee osteoarthritis：a systematic review and meta-analysis［J］. Arch Orthop Trauma Surg，2023，143（1）：409-421. doi：10.1007/s00402-021-04326-9.

［16］ XU K，HE Y，MOQBEL S A A，et al. SIRT3 ameliorates osteoarthritis via regulating chondrocyte autophagy and apoptosis through the PI3K/Akt/mTOR pathway［J］. Int J Biol Macromol，2021，175（3）：351-360. doi：10.1016/j.ijbiomac.2021.02.029.

［17］ ZHU F，CHEN H，XU M，et al. Cryptotanshinone possesses therapeutic effects on ischaemic stroke through regulating STAT5 in a rat model［J］. Pharm Biol，2021，59（1）：465-471. doi：10.1080/13880209.2021.1914672.

［18］ 石昊，陳浩，譚鵬，等. 隱丹參酮緩解雨蛙素聯合脂多糖誘導的小鼠重癥急性胰腺炎的作用探討［J］. 中國中西醫結合雜志，2022，42（1）：83-88. SHI H，CHEN H，TAN P，et al. Mitigation effects of cryptotanshinone on severe acute pancreatitis in mice induced by cerulein combined with lipopolysaccharides［J］. Chin J Integr Tradit West Med，2022，42（1）：83-88.

［19］ WANG P，XIONG X，ZHANG J，et al. Icariin increases chondrocyte vitality by promoting hypoxia-inducible factor-1α expression and anaerobic glycolysis［J］. Knee，2020，27（1）：18-25. doi：10.1016/j.knee.2019.09.012.

［20］ DENG R，WANG Y，BU Y，et al. BNIP3 mediates the different adaptive responses of fibroblast-like synovial cells to hypoxia in patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis［J］. Mol Med，2022，28（1）：64-77. doi：10.1186/s10020-022-00490-9.

［21］ KIM D，SONG J，JIN E J. BNIP3-dependent mitophagy via PGC1α promotes cartilage degradation［J］. Cells，2021，10（7）：1839. doi：10.3390/cells10071839.

基金項目：武漢市中醫藥科研項目（wz22c62）

作者單位：1武漢市中醫醫院骨傷科（郵編430014），2內分泌科

作者簡介：王柯（1981），男，主治醫師，主要從事膝關節骨性關節炎臨床研究。E-mail：emf3q7@sina.com

通信作者 E-mail：jueax516@163.com

（本文編輯 陳麗潔）