寡糖鏈、甲胎蛋白對乙型肝炎病毒相關肝細胞癌風險篩查與診斷價值研究

【摘要】 背景 肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌（PLC）的主要病理分型，與乙型肝炎病毒（HBV）感染密切相關，HCC早期無明顯癥狀，發現時多進展至中晚期階段，有肝內、門靜脈或其他部位轉移，預后較差。在疾病早期對高風險人群進行定期篩查及早期診斷，對臨床治療及預后有重大意義。目的 探究寡糖鏈和甲胎蛋白（AFP）在HBV相關HCC的風險人群及患者中的應用價值，為臨床診斷提供參考。方法 納入2022年1—11月就診于蘇州大學附屬第一醫院的慢性HBV感染患者165例為研究對象，其中非HCC患者123例，HCC患者42例。通過電子病歷系統收集患者一般資料（年齡、性別、肝硬化情況）、實驗室檢查指標［總膽紅素（TB）、白蛋白（ALB）、血小板計數（PLT）、AFP］，計算慢性肝病患者肝癌風險預測模型評分（aMAP評分），收集寡糖鏈標志物檢測結果（G-Test）。將HCC患者作為HCC組（42例），非HCC患者根據aMAP評分進行分組，lt;50分為低風險組（40例）、50～60分為中風險組（44例）、gt;60分為高風險組（39例）。繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析AFP、G-Test及兩者聯合診斷HCC的效能，計算ROC曲線下面積（AUC），并用DeLong檢驗比較聯合指標與單個指標AUC的差異。采用Kappa一致性檢驗分析AFP、G-Test與臨床診斷結果的一致性。結果 HCC組患者AFP、G-Test高于低風險組、中風險組、高風險組，年齡、肝硬化比例高于低風險組、中風險組，ALB低于低風險組、中風險組，TB低于高風險組，PLT低于低風險組（Plt;0.05）；高風險組患者年齡、TB、G-Test高于低風險組、中風險組，ALB、PLT低于低風險組、中風險組，肝硬化比例高于低風險組（Plt;0.05）；中風險組患者的年齡、肝硬化比例高于低風險組，PLT低于低風險組（Plt;0.05）。AFP和G-Test診斷HCC的AUC分別為0.796（95%CI=0.706～0.886，Plt;0.001）、0.878（95%CI=0.813～0.943，Plt;0.001），兩者聯合診斷HCC的AUC為0.901（95%CI=0.844～0.957，Plt;0.001）。DeLong檢驗結果顯示，聯合診斷HCC的AUC高于AFP（Z=2.104，P=0.035）。一致性分析結果顯示，AFP與臨床診斷結果的一致率為84.8%（140/165），一致性中等（Kappa值=0.539，Plt;0.001），G-Test與臨床診斷結果的一致率為89.5%（145/165），一致性較高（Kappa值=0.704，Plt;0.001）。G-Test診斷AFP陰性HCC的AUC為0.895（95%CI=0.839～0.952，Plt;0.001）。結論 寡糖鏈作為一種潛在血清生物標志物，對HBV相關HCC患者的診斷效能優于AFP，可作為AFP陰性HCC患者的補充檢測標志物。

【關鍵詞】 癌，肝細胞；乙型肝炎病毒；甲胎蛋白類；寡糖鏈檢測；癌癥篩查；早期診斷；受試者工作特征曲線

【中圖分類號】 R 730.261 R 730.4 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0239

Study on the Value of Oligosaccharide Chain and Alpha-fetoprotein for Risk Screening and Diagnosis of Hepatitis B Virus-related Hepatocellular Carcinoma

ZHANG Yun1，CAI Xinyi1，DING Jingnuo1，LU Shengwei1，CHEN Cuiying2，WU Tingting3，ZHANG Junli3，ZHAO Weifeng1*

1.Department of Infectious Diseases，the First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006，China

2.Sysdiagno Biomedtech Co，Ltd.，Taizhou 225300，China

3.Sysdiagno Biomedtech Co，Ltd.，Nanjing 210000，China

*Corresponding author：ZHAO Weifeng，Chief physician/Doctoral supervisor；E-mail：zhaoweifeng@suda.edu.cn

【Abstract】 Background Hepatocellular carcinoma（HCC）is the main pathological type of primary liver cancer（PLC）and is closely associated with Hepatitis B virus（HBV）infection. HCC in its early stages often presents no significant symptoms and is usually discovered at an advanced stage with liver，portal vein，or other site metastases，leading to a poor prognosis. Regular screening and early diagnosis in high-risk populations in the early stages of the disease are of great significance for clinical treatment and prognosis. Objective To explore the application value of oligosaccharides and alpha-fetoprotein（AFP）in the risk population and patients of HBV-related HCC，providing a reference for clinical diagnosis. Methods The study included 165 chronic HBV infection patients treated at the First Affiliated Hospital of Soochow University from January to November 2022，comprising 123 non-HCC and 42 HCC patients. Patient data（age，gender，cirrhosis status），laboratory indices［total bilirubin（TB），albumin（ALB），platelet count（PLT），AFP］were collected through electronic medical records，and a liver cancer risk prediction model score for chronic liver disease patients（aMAP score）was calculated，along with oligosaccharide marker test results（G-Test）. HCC patients were classified as the HCC group（42 cases），and non-HCC patients were divided based on aMAP scores into low-risk（lt;50 points，40 cases），medium-risk（50-60 points，44 cases），and high-risk（gt;60 points，39 cases）groups. Receiver operating characteristic（ROC）curves were plotted to analyze the efficacy of AFP，G-Test，and their combined diagnosis of HCC，calculating the area under the ROC curve（AUC），and the DeLong test was used to compare the differences between combined and single indicator AUCs. Kappa consistency tests were used to analyze the consistency of AFP and G-Test with clinical diagnostic results. Results In patients with HCC，levels of AFP and G-Test were higher compared to those in the low-risk，medium-risk，and high-risk groups（Plt;0.05）. Additionally，age and the proportion of liver cirrhosis were higher than those in the low-risk and medium-risk groups，ALB levels was lower than that of low risk group and medium risk group and TB levels were lower than those in the high-risk group，while PLT was lower than that in the low-risk group（Plt;0.05）. In the high-risk group，patients exhibited higher age，TB，and G-Test levels compared to the low-risk and medium-risk groups，whereas ALB and PLT levels were lower than those in the low-risk and medium-risk groups，and the proportion of liver cirrhosis was higher than that in the low-risk group（Plt;0.05）. Patients in the medium-risk group showed higher age and liver cirrhosis proportion compared to the low-risk group，and PLT was lower than that in the low-risk group（Plt;0.05）. The AUCs for diagnosing HCC using AFP and G-Test were 0.796 （95%CI=0.706-0.886，Plt;0.001） and 0.878 （95%CI=0.813-0.943，Plt;0.001），respectively. The AUC for the combined diagnosis was 0.901 （95%CI=0.844-0.957，Plt;0.001）. DeLong test results showed that the AUC for combined diagnosis was higher than AFP alone（Z=2.104，P=0.035）. Consistency analysis showed that the concordance rate of AFP with clinical diagnosis was 84.8%（140/165），with moderate consistency（Kappa=0.539，Plt;0.001），and for G-Test，it was 89.5%（145/165），indicating higher consistency（Kappa=0.704，Plt;0.001）. The AUC of G-Test in diagnosing AFP-negative HCC was 0.895 （95%CI=0.839-0.952，Plt;0.001）. Conclusion Oligosaccharide chain markers can be used as a complementary detection marker for AFP-negative HCC patients as a potential serum biomarker with better diagnostic efficacy than AFP in patients with HBV-related HCC.

【Key words】 Carcinoma，hepatocellular；Hepatitis B virus；Alpha-fetoproteins；G-test；Cancer screening；Early diagnosis；ROC curve

原發性肝癌（PLC）是常見的惡性腫瘤之一，據統計，2020年全球約有905 700人診斷為PLC，死亡人數達到830 200人，到2050年預計發病例數可達到100萬例［1］。肝細胞癌（HCC）是PLC最常見的病理分型，在患有慢性肝病的人群中發病率較高，但由于起病隱匿，早期檢出率不高，多數HCC患者發現時已進展至中晚期，錯失最佳治療時機。因此，開發新的生物標志物，對HCC的危險人群進行定期篩查，早期發現與診斷HCC是當前研究的熱點。腫瘤中多種發生糖鏈特異性改變的糖蛋白被確定為HCC的血清學標志物，包括甲胎蛋白異質體（AFP-L3）、高爾基體糖蛋白73（GP73）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC-3）等；基于這些發現，推測檢測糖蛋白質的特定寡糖鏈對診斷HCC可能具有更高的靈敏度和特異度。本研究納入2022年1—11月就診于蘇州大學附屬第一醫院的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者為研究對象，將非HCC患者按照慢性肝病患者肝癌風險預測模型評分（aMAP評分）［2］劃分為低、中、高風險組，檢測低風險、中風險、高風險組及HCC患者中寡糖鏈及甲胎蛋白（AFP）的表達情況，分析兩者對HBV相關HCC早期診斷的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2022年1—11月就診于蘇州大學附屬第一醫院的慢性HBV感染患者165例為研究對象，其中非HCC患者123例，HCC患者42例。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2022版）》［3］中慢性HBV感染的診斷標準；（3）HCC患者診斷符合以下兩項中任一項①病理證實為HCC，②肝內結節直徑≤2 cm，動態增強MRI、動態增強CT、超聲造影或肝細胞特異性對比劑釓塞酸二鈉（Gd-EOB-DTPA）增強MRI四項檢查中至少有兩項顯示動脈期病灶明顯強化、門靜脈期和/或平衡期肝內病灶強化低于肝實質，即“快進快出”的肝癌典型特征，肝內結節直徑gt;2 cm，4種影像學檢查中存在1項肝癌典型特征；（4）臨床資料齊全。排除標準：（1）有其他實體腫瘤或血液系統腫瘤病史；（2）合并其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、血吸蟲肝病；（3）妊娠及合并生殖系統腫瘤；（4）接受手術、介入、靶向或免疫治療；（5）出現溶血、污染、反復凍融的不合格標本；（6）肝功能衰竭。本研究已通過蘇州大學附屬第一醫院倫理審批委員會審批［批件號：（2022）倫審批第061號］，研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 數據收集

通過電子病歷系統收集患者一般資料（年齡、性別、肝硬化情況）、實驗室檢查指標［總膽紅素（TB）、白蛋白（ALB）、血小板計數（PLT）、AFP］，計算aMAP評分。aMAP評分={0.06×年齡（歲）+0.89×性別+0.48×［lgTB（μmol/L）×0.66+ALB（g/L）×-0.085］-0.01×PLT（×109/L）+7.4}/14.77×100，其中男=1，女=0。使用促凝管留取患者靜脈血1～2 mL，室溫下靜置1 h后，3 000～3 500 r/min離心10 min（最大相對離心力：2 150×g）獲得血清樣本，置于-20 ℃冰箱儲存。使用寡糖鏈檢測試劑盒（江蘇先思達生物科技有限公司，批號：20220816、20221025）檢測血清樣本的寡糖鏈，具體步驟如下：（1）寡糖鏈釋放；（2）寡糖鏈標記；（3）唾液酸去除；（4）寡糖鏈數據分析［4］。

1.3 分組

將HCC患者作為HCC組（42例），非HCC患者根據aMAP評分進行分組，lt;50分為低風險組（40例）、50～60分為中風險組（44例）、gt;60分為高風險組（39例）。

1.4 統計學方法

應用SPSS 27.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni法。繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析AFP、寡糖鏈標志物檢測結果（G-Test）及兩者聯合診斷HCC的效能，計算ROC曲線下面積（AUC），并用DeLong檢驗比較聯合指標與單個指標AUC的差異。采用Kappa一致性檢驗分析AFP、G-Test與臨床診斷結果的一致性：Kappa值≤0.20，一致性較差；Kappa值0.21～0.40，一致性一般；Kappa值0.41～0.60，一致性中等；Kappa值0.61～0.80，一致性較高；Kappa值0.81～1.00，一致性高［5］。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組患者一般資料及實驗室檢查指標比較

4組患者年齡、肝硬化比例、TB、ALB、PLT、AFP、G-Test比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），其中HCC組患者AFP、G-Test高于低風險組、中風險組、高風險組，年齡、肝硬化比例高于低風險組、中風險組，ALB低于低風險組、中風險組，TB低于高風險組，PLT低于低風險組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；高風險組患者年齡、TB、G-Test高于低風險組、中風險組，ALB、PLT低于低風險組、中風險組，肝硬化比例高于低風險組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；中風險組患者的年齡、肝硬化比例高于低風險組，PLT低于低風險組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。4組患者性別比例比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表1。

2.2 AFP、G-Test及兩者聯合對HCC的診斷價值

繪制AFP、G-Test及兩者聯合診斷HCC患者的ROC曲線，結果顯示AFP和G-Test診斷HCC的AUC分別為0.796（95%CI=0.706～0.886，Plt;0.001）、0.878（95%CI=0.813～0.943，Plt;0.001），最佳截斷值分別為5.58 μg/L和5.06。兩者聯合診斷HCC的AUC為0.901（95%CI=0.844～0.957，Plt;0.001）。DeLong檢驗結果顯示，聯合診斷HCC的AUC高于AFP，差異有統計學意義（Z=2.104，P=0.035），聯合診斷與G-Test的AUC差異無統計學意義（Z=1.436，P=0.151），AFP、G-Test及兩者聯合診斷HCC的ROC曲線見圖1。

2.3 AFP、G-Test與臨床診斷結果的一致性檢驗

本研究以AFP≥20 μg/L為陽性，lt;20 μg/L為陰性［6］；G-Test≥5.06為陽性，lt;5.06為陰性。一致性分析結果顯示，AFP與臨床診斷結果的一致率為84.8%（140/165），一致性中等（Kappa值=0.539，Plt;0.001），G-Test與臨床診斷結果的一致率為89.5%（145/165），一致性較高（Kappa值=0.704，Plt;0.001），見表2～3。

2.4 G-Test對AFP陰性HCC的診斷價值

繪制G-Test診斷AFP陰性HCC的ROC曲線，結果顯示，G-Test診斷AFP陰性HCC的AUC為0.895（95%CI=0.839～0.952，Plt;0.001），最佳截斷值為5.06，靈敏度為0.857，特異度為0.878，G-Test診斷AFP陰性HCC的ROC曲線見圖2。

3 討論

肝癌的早期癥狀隱匿，患者出現肝區不適、肝功能損害、黃疸、消瘦等癥狀就診時多數腫瘤已明顯進展，出現肝內外轉移、淋巴結轉移、門脈癌栓等，無法行根治性治療。為早期發現HCC，提高患者預后及延長生存時間，國際上建立了多種HCC臨床預測模型，對HCC風險人群進行分層管理。aMAP評分是我國學者首次提出的應用范圍最廣泛的肝癌預測模型，在白蛋白-膽紅素（ALBI）評分的基礎上添加了性別、年齡、PLT等指標，按照分數劃分為不同肝癌風險等級的人群（低風險lt;50分，中風險50～60分，高風險gt;60分），在不同病因的肝病患者中均具有良好的預測能力，優于其他預測模型，評分lt;50分的低風險組，HCC的5年發病率為0.8%，評分gt;50分的高風險組，5年發病率為19.9%［2］。因此，本文分析AFP和G-Test在不同aMAP評分的肝癌風險人群與HBV相關HCC患者中的表達差異，探究新的血清學指標對HCC的診斷價值。

N-糖基化在真核和原核生物的生命體內廣泛存在，是糖基化最常見的修飾形式。人體內大多數血清N-糖蛋白在肝臟或B淋巴細胞內合成，血清N-聚糖結構和數量的變化可以反映肝臟或B淋巴細胞生理功能的變化。因此，測定血清中N-聚糖譜可用于肝臟疾病的無創診斷。近年來，糖鏈分離技術的進步使N-聚糖的應用更為廣泛，采用不同的分離技術可得到不同的糖鏈譜，從而獲得不同的生物標志物。2010年，FANG等［7］使用二乙基亞硝胺（DENA）構建大鼠肝癌模型，采用DNA測序輔助熒光團輔助碳水化合物電泳（DSA-FACE）技術獲得N-聚糖譜進行分析，發現峰P5隨著肝纖維化進展逐漸減低，可作為監測DENA大鼠模型纖維化的生物標志物，而R5a與P1的比值和R5b與P1的比值在HCC大鼠中特異性升高，可作為診斷DENA大鼠模型HCC的特異性指標。HIGASHI等［8］采用簡化的熒光標記N-聚糖制備方法從血清樣本中檢測出5個有意義的N-聚糖譜［A2G0、M5A、A2G0B、A2G1（6）FB和A2G2B］，發現丙型肝炎病毒（HCV）感染的HCC組以上N-聚糖譜均顯著高于健康對照組、肝炎組和肝硬化組（P均lt;0.05），證實了N-聚糖是HCV相關HCC的潛在標志物。此外，A2G1（6）FB與AFP、異常凝血酶原（DCP）無明顯相關性，可作為AFP、DCP均陰性HCC的良好補充指標。本研究采用DSA-FACE技術獲得了165例HBV感染患者血清的寡糖鏈結果，對比分析結果發現，G-Test在非HCC組中經aMAP評分為低、中、高風險的肝癌風險人群與HCC患者間存在顯著差異（Plt;0.001）；在低/中風險-高風險-HCC疾病進展過程中，寡糖鏈水平呈升高趨勢，高危組顯著高于低危組和中危組（Plt;0.001）；HCC患者的G-Test明顯高于非HCC患者。因此，寡糖鏈可能與HCC的發生密切有關，是否可作為預測肝癌發生風險的標志物尚需進一步探討。

正常生理狀態下，AFP由胎兒的卵黃囊和肝臟產生，出生后迅速下降［9］。既往研究在患有HCC小鼠的體內發現AFP升高，證明其為HCC的血清學標志物，隨后迅速應用到人類HCC的診斷中［10］。近年來，研究發現AFP的分子糖鏈具有異質性［11］，在乙酰氨基葡萄糖的氨基還原末端有1～6個巖藻糖殘基的亞型被稱為甲胎蛋白異質體3（AFP-L3）［12］，此亞型與小扁豆凝集素（LCA）具有良好的結合能力，若患者血清中AFP-L3占AFP總量的百分比（AFP-L3%）≥10%提示為HCC的可能性較大［13］。既往糖蛋白腫瘤標志物的檢測更多的是針對蛋白質成分，AFP-L3就聚糖成分進行檢測，被發現是診斷HCC更為特異的標志物。因此，疾病中糖鏈的變化可能早于蛋白質，更具有特異性。本研究將基于N-聚糖測定的G-Test與傳統血清學標志物AFP進行比較，發現AFP單獨診斷HCC的效能明顯劣于G-Test，G-Test是鑒別HBV相關HCC患者和慢性HBV感染患者的優良指標，可作為一種有價值的非侵入性血清學標志物。本研究中聯合診斷具有更高的AUC值，DeLong檢驗顯示AFP、G-Test聯合診斷檢出HCC的能力明顯高于AFP（P=0.035）。本研究將AFP、G-Test分別與臨床診斷結果進行一致性檢驗，發現AFP與臨床診斷結果的一致率為84.8%，一致性為0.539（Plt;0.001）；G-Test與臨床診斷結果的一致率為89.5%，一致性為0.704（Plt;0.001）。與AFP的檢測結果相比，G-Test檢測結果與臨床診斷結果符合率更高。因此，在慢性HBV感染的患者中若檢測出G-Test≥5.06，應考慮HCC的可能，進一步完善增強CT/MRI等檢查。

與AFP陽性患者相比，AFP陰性的HCC患者腫瘤分化良好、直徑更小，常具有完整的腫瘤包膜，肝移植術后往往復發率更低、預后更好［14］。因此，許多學者致力于發現一種優良的血清學標志物，可以從良性肝?。ǜ斡不?、慢性肝炎等）人群中篩選出AFP陰性的HCC。DCP、AFP-L3、高爾基體糖蛋白73（GP73）等已經被確定可用于AFP陰性HCC的診斷和預后評估［15］。LIU等［16］發現DCP可以區分AFP陰性的HBV相關HCC與慢性HBV感染及肝硬化患者。ZHANG等［17］證實AFP-L3和GP73均可作為診斷AFP陰性HCC的生物標志物，50%AFP陰性HCC患者AFP-L3陽性，66%AFP陰性HCC患者GP73陽性。HUANG等［18］采用N-聚糖指紋圖譜（NGFP）技術分析血清N-聚糖結構豐度，并運用Logistic回歸算法定義了由13個有意義的N-糖基結構組成的生物標志物面板，發現N-聚糖生物標志物與AFP具有良好的互補性，可用于診斷AFP陰性的HCC。因此，進一步分析了G-Test診斷AFP陰性HCC的ROC曲線，發現G-Test對AFP陰性HCC的診斷能力良好，AUC為0.895（95%CI=0.839～0.952，Plt;0.001），靈敏度、特異度分別為0.857、0.878。因此，可作為診斷AFP陰性HCC的有效血清學標志物。

AFP作為臨床最常見的肝癌血清學標志物，單獨診斷HCC的準確率并不理想，在急性和慢性肝炎、肝內膽管細胞癌和胚胎源性腫瘤等患者血清中均發現升高的AFP，削弱了對肝癌診斷的特異性。AFP單獨診斷HCC的靈敏度為41%～65%［19］，與DCP聯合檢測可將靈敏度提高到84%［20］。本研究發現G-Test對HBV相關HCC的診斷能力明顯優于AFP，具有良好的靈敏度和特異度，與國外多項研究結果相符［21-22］，但由于本研究人群局限為慢性HBV感染患者，在HCV感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等其他病因的肝癌風險人群中的診斷HCC的價值尚需進一步證實。

本研究存在以下局限性：（1）本研究的樣本量較少，入組對象均來自同一家醫院，存在選擇偏倚，可能會對試驗結果產生影響；（2）本研究受試者，并非均以病理結果作為診斷依據，尤其是肝硬化患者多以臨床資料及影像資料作為診斷標準，可能會使結果出現偏倚。

綜上所述，寡糖鏈作為一種潛在血清學標志物，對HBV相關HCC患者的診斷效能明顯優于AFP，并可作為AFP陰性HCC患者的補充標志物。本研究未對HCC患者進行治療后的隨訪，無法分析寡糖鏈與腫瘤預后間的相關性，在后續研究中會進一步就相關問題進行探討。

作者貢獻：張蕓負責研究的設計、實施與論文的撰寫；張蕓、蔡欣奕、丁靖諾負責數據、標本的收集與整理；張蕓、吳婷婷、張軍利負責數據的統計學處理，圖、表的繪制；陸圣威、陳萃英、趙衛峰進行論文的修訂；趙衛峰負責文章的質量控制與審查，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2023-03-27；修回日期：2023-05-23）

（本文編輯：鄒琳）

引用本文：張蕓，蔡欣奕，丁靖諾，等. 寡糖鏈、甲胎蛋白對乙型肝炎病毒相關肝細胞癌風險篩查與診斷價值研究［J］. 中國全科醫學，2024，27（15）：1855-1860. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0239. ［www.chinagp.net］

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? Chinese General Practice Publishing House Co.，Ltd. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.

*通信作者：趙衛峰，主任醫師/博士生導師；E-mail：zhaoweifeng@suda.edu.cn