基于GC-IMS 分析新疆不同寄主肉蓯蓉揮發性物質

彭旭陽，陳君然，崔瀚元 ，胡立武，張子迪，朱星宇，陳存坤

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市農業科學院農產品保鮮與加工與技術研究所，天津 300000；3.新疆優產農業科技發展有限公司，新疆和田 848300；4.天津天獅學院，天津 301700）

肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma.）列當科屬高大草本植物，主要分布于中國的內蒙古阿拉善、新疆和田、寧夏和甘肅昌馬等干燥地區[1]。肉蓯蓉是稀有而珍貴中藥材，有補腎陽，益精血，潤腸通便，大補壯陽等功能，被譽為“沙漠人參”[2]。2018 年肉蓯蓉被收錄于“藥食兩用”目錄[3]，現代藥理學證明其富含多種生物活性物質，具有包括抗氧化、抗衰老、緩解疲勞、增強記憶力、保護神經、預防骨質疏松等功效[4-5]。肉蓯蓉是一種全寄生植物根部，寄主有梭梭樹和紅柳灌木林，品質差異較大，‘紅柳’肉蓯蓉莖深，質地柔軟表面光滑，橫切面為暗紅色，味略苦?！笏蟆馍惾乜购敌阅茌^好，橫截面有不規則紋路，味甘甜[6-7]。

目前對肉蓯蓉的研究重點主要集中在種植技術[8]、抗氧化活性[9]、生物活性成分[10]等方面。然而，伴隨市場需求的不斷增加，肉蓯蓉產品的質量參差不齊，甚至存在偽造現象，這給監管部門帶來了極大的挑戰。目前，鑒別不同肉蓯蓉藥材仍然面臨相當大的困難，因此需要一種高效、快速、直觀的分析鑒別方法來解決這一問題。

氣味掃描儀（電子鼻）、氣相色譜-質譜聯用（GCMS）是目前分析揮發性物質常用的技術手段，但是在分析過程中需要對原材料進行加熱、蒸餾、萃取等操作，過程繁瑣，且過長的分析時間和過高的進樣溫度容易造成不穩定揮發性物質的結構改變[11-14]。氣相離子遷移色譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）是一門新興揮發性物質分析技術，其具有分離高效、操作簡便、靈敏度高、維護成本低等優勢。GC-IMS 通過頂空進樣分析樣品的特征成分，最大程度保留樣品的氣味，并通過譜圖中的信號積分實現風味物質的可視化，該方法具有直觀穩定、操作便捷等優勢。近年來被廣泛用于中藥[15-17]、果蔬[18-20]、調味品[14,21]、酒產品[22-24]、添加劑[25]、香精香料[26-28]等方面。而在中藥材料鑒別領域，郭鳳柳等[29]通過GC-IMS 對川貝母以及其他貝母進行了鑒別，為川貝母的快速鑒別提供全新思路及技術支持。嚴愛娟等[30]通過GC-IMS 技術分析，比較了覆盆子和可能混淆的山莓之間揮發性特異氣味成分的差異，為覆盆子和山莓的鑒別提供了新的方法和手段。而對肉蓯蓉揮發性成分相關研究較少?；诖耍狙芯坎捎肎C-IMS 對‘梭梭’和‘紅柳’寄主肉蓯蓉的揮發性成分進行了分析，探討兩種不同寄主肉蓯蓉揮發性成分間的差異，將為新疆肉蓯蓉揮發性成分分析及品種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉蓯蓉 新疆和田地區策勒縣的‘紅柳’肉蓯蓉（寄生在紅柳植物根部）和‘梭梭’肉蓯蓉（寄生藜科植物梭梭的根部），挑選外表無損傷、新鮮的肉蓯蓉用于分析（圖1）；外標物正構酮C4～C9 山東海能科學儀器有限公司。

圖1 新疆不同寄主肉蓯蓉外觀及切面圖Fig.1 Appearance and section of different hosts of Cistanche deserticola in Xinjiang

FA1004 電子天平 上海天平儀器廠；Flavour-Spec?氣相-離子遷移譜儀 配備MXT-5 色譜柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm），德國G.A.S 公司；20 mL頂空瓶 上海希言科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將兩種肉蓯蓉洗凈，去除表皮并切碎成丁，用天平準確稱取0.6 g，分別放入20 mL 頂空瓶中，60 ℃孵化20 min 后進樣，每個樣品進行3 次平行測定。

1.2.2 GC-IMS 分析 參考Zhou 等[31]的方法，并略有修改。

進樣條件：頂空進樣針溫度85 ℃；進樣體積300 μL；孵化轉速500 r/min。

GC條件：色譜柱：MXT-5（15 m×0.53 mm，1.0 μm）；色譜柱溫60 ℃；分析時間20 min。

IMS 條件：IMS 溫度45 ℃，漂移氣流量75 mL/min；高純氮氣N2（純度≥99.999%）作為漂移載氣。載氣流速：初始流速為2 mL/min，保持2 min 不變，2～10 min 之間逐漸增加至10 mL/min，10～20 min 內逐漸增加至100 mL/min。

保留指數計算公式：

式中，t 為保留時間；Z 和Z+1 分別為目標化合物（X）流出前后的正構酮所含碳原子的數目。

1.3 數據處理

GC-IMS 儀器自帶LAV（laboratory analytical viewer）分析軟件，采用正構酮C4～C9 作為外標來計算揮發性物質的保留指數，并根據保留指數和相對遷移時間，與NIST 氣相數據庫和IMS 離子遷移譜數據庫進行檢索對揮發性風味物質進行定性分析。使用插件Gallery Plot 構建指紋圖譜、利用Reporter 繪制二維差異譜圖、Dynamic PCA 進行主成分分析，根據揮發性物質峰體積使用Origin 2023 繪制聚類熱圖；香氣特征來自好香味公司（The Good Scents Company）。

2 結果與分析

2.1 不同寄主肉蓯蓉中揮發性物質的差異分析

根據保留時間、相對遷移時間和離子峰強度，利用LAV 分析軟件中Report 插件功能，分別生成了三維圖譜（圖2）和二維差異圖譜（圖3），圖譜背景呈現藍色，相對遷移時間1.0 處紅色豎線為經過歸一化處理的反應離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP 右側的點代表肉蓯蓉所含的揮發性成分，顏色越深代表所含物質的峰強度越高。由圖2 可以看出，不同寄主肉蓯蓉所含揮發性成分已被有效分離，并且揮發性成分的差異可以明顯觀察到，如黑色框中所示，不同寄主肉蓯蓉中的揮發性物質種類存在差異，同一揮發性物質的含量也有不同。

圖2 不同寄主肉蓯蓉中揮發性物質GC-IMS 三維譜圖Fig.2 GC-IMS three-dimensional spectrum of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

圖3 不同寄主肉蓯蓉中揮發性物質GC-IMS 二維譜圖（A）和GC-IMS 二維差異譜圖（B）Fig.3 GC-IMS two-dimensional spectra (A) and GC-IMS twodimensional difference spectrum (B) of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

采用Reporter 二維差異譜圖模式，可以更清晰直觀地比較不同樣本間揮發性物質的差異。圖3B差異譜圖是以‘紅柳’樣品為基準扣除‘梭梭’樣品所形成的譜圖，扣除背景后呈現白色。由圖可知，‘紅柳’肉蓯蓉和‘梭梭’肉蓯蓉中大多數揮發性物質的相對遷移時間在1.10～1.60 ms 范圍內，‘紅柳’在1.10～1.60 ms 出現較強信號，‘梭梭’則在1.10～1.30 ms 出現較強信號，‘紅柳’在保留時間100～800 s 范圍內，‘梭梭’則在100～400 s 范圍內。從圖中可以看出，‘紅柳’肉蓯蓉中揮發性物質濃度明顯高于‘梭梭’肉蓯蓉。

2.2 不同寄主肉蓯蓉揮發性物質的定性分析

本研究在兩種肉蓯蓉中共檢出35 個信號峰。通過GC-IMS 中VOCal 軟件內置的NIST 數據庫和IMS 數據庫進行定性分析，圖4 顯示了不同寄主肉蓯蓉的揮發性物質特征峰點位圖。其中共定性出27 種揮發性成分，包括8 種醛類、5 種醇類、4 種酯類和1 種酮類。由于數據庫的數據有限，目前有8 種物質無法定性。但需要注意的是，有些化合物同時檢測出單體和二聚體（部分揮發性物質濃度較高會形成二聚體，并出現對應的遷移峰），具體成分詳見表1。

表1 ‘紅柳’肉蓯蓉與‘梭梭’肉蓯蓉中揮發性成分定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile components in 'Red Willow' and 'Haloxylon' Cistanche deserticola

圖4 不同寄主肉蓯蓉的揮發性物質特征峰點位圖Fig.4 Characteristic peak locations of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

2.3 不同寄主肉蓯蓉揮發性風味物質聚類熱圖及指紋圖譜分析

圖5 是將兩種肉蓯蓉揮發性物質成分的峰體積繪制聚類熱圖，由圖可知，‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉各自聚為一類，兩種不同寄主肉蓯蓉揮發性物質存在差異。為了進一步方便觀察比較，利用Gallery Plot 插件繪制肉蓯蓉樣品中揮發性風味成分指紋圖譜（圖6），圖中每一行代表一個樣品中選取的信號峰，每一列代表同一揮發性有機物在不同樣品中的信號峰。信號峰顏色越亮，含量越高。從圖6 指紋圖譜可知，紅框中揮發性物質在‘紅柳’肉蓯蓉中信號峰強度較高，包括2-苯基乙醛、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、3-甲硫基丙醛、1-己醛、3-甲基-2-丁烯醛、庚醛、乙酸甲酯、乙酸己酯等。黃框中揮發性物質在‘梭梭’肉蓯蓉中信號峰強度較高，包括1-己醇、異丁醇、乙酰妥英、乙酸乙酯等。醛類化合物是肉蓯蓉中重要的香氣物質，由于其不飽和脂肪酸的氧化產生的醛類物質會帶來獨特的芳香[32]，醛類物質含量的不同使兩者的風味產生較大差異?！t柳’肉蓯蓉中的2-苯基乙醛（蜂蜜味）、苯甲醛（苦杏仁味）、（E）-2-庚烯醛（柑橘味），3-甲硫基丙醛（洋蔥味）等醛類化合物信號峰強度較高，且3-甲硫基丙醛會呈現較強烈洋蔥味，低濃度時則會呈現愉快的肉湯香味[33]，因此‘紅柳’肉蓯蓉可能比‘梭梭’肉蓯蓉有著更強烈的味道。而醇類和酯類物質的香氣特征賦予肉蓯蓉花草香氣和果香[34]。‘梭梭’肉蓯蓉中信號峰強度較高的1-己醇（花香和果香）、乙酰妥英（甜甜的奶香味）、異丁醇（清新的香草味）、乙酸乙酯（令人愉快的水果香）會給果實帶來青香，這可能是‘梭梭’肉蓯蓉聞起來更加清新的原因。

圖5 不同寄主肉蓯蓉揮發性成分聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map of volatile components of Cistanche deserticola in different hosts

圖6 不同寄主肉蓯蓉揮發性成分指紋圖譜Fig.6 Fingerprints of volatile components of Cistanche deserticola in different hosts

2.4 不同寄主肉蓯蓉揮發性成分主成分分析

主成分分析（PCA）是一種有效的化學計量學方法。在充分利用大部分原始變量信息的基礎上，該方法能將多個指標簡化為多個綜合指標，進一步簡化數據并揭示變量之間的關系[35]。通過GC-IMS 獲取的肉蓯蓉關于揮發性成分的基礎上，利用PCA 統計學對兩種肉蓯蓉進行分析，Dynamic PCA 插件分析結果見圖7。由圖7 可知PC-1 貢獻率為83%，PC-2貢獻率為8%，所累計貢獻率為91%，遠大于可信值60%以上，因此PC-1 和PC-2 主成分足以反映肉蓯蓉樣品香氣特征信息。另外由圖7 可以直觀看出不同寄主肉蓯蓉之間有明顯區分度，且平行樣品之間相互聚集，因此，可以根據特征揮發性物質來區分不同寄主肉蓯蓉。

圖7 不同寄主肉蓯蓉的主成分分析（PCA）圖Fig.7 Principal component analysis (PCA) graph of different hosts of Cistanche deserticola

此外，本實驗采用VOCs 軟件分析方法—“最近鄰”指紋相似度進行了分析，該功能可對樣本進行快速比較，通過計算樣本的之間的歐式距離，從而可以通過檢索最小距離來找到“最近鄰”。此功能可根據所選評估區域中化合物的強度對A、B 兩種不同寄主的肉蓯蓉樣品進行快速比較。從圖8 可以看出A‘紅柳’肉蓯蓉和B‘梭梭’肉蓯蓉中揮發性物質差異明顯。

圖8 不同寄主肉蓯蓉的“最近鄰”指紋分析Fig.8 "Nearest neighbor finger" fingerprint analysis of different hosts of Cistanche deserticola

3 結論

本研究采用GC-IMS 分析可知，‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉中共檢測出35 種揮發性風味物質（包括單體、二聚體），由于內置NIST 數據庫不夠完善，目前只定性出其中的27 種揮發性物質，包括醛類、醇類、酯類、酮類化合物等，以醛類、醇類為主。‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉主要差異物質為2-苯基乙醛、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、3-甲硫基丙醛、1-己醛、庚醛、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸甲酯、乙酸己酯、1-己醇、乙酰妥英、異丁醇、乙酸乙酯。然而本文僅僅只對兩種不同寄主肉蓯蓉的揮發性成分進行了定性分析，雖然通過指紋圖譜和聚類熱圖能夠直觀地分辨出不同寄主肉蓯蓉之間的揮發性物質的差異，但是并不能代表肉蓯蓉所有的揮發性物質，后續可增加更多品種肉蓯蓉的分析以及GC-MS 對其揮發性物質的定量分析，探討其他寄主肉蓯蓉揮發性物質之間的區別與聯系。

總之，通過構建肉蓯蓉GC-IMS 揮發性物質聚類熱圖、指紋圖譜以及PCA 主成分分析，能夠很好地分辨出兩種不同寄主肉蓯蓉的揮發性物質的差異，可為‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉的快速鑒定和揮發性風味物質研究提供理論參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).