基于非靶向代謝組學分析不同包裝方式預制烤魚代謝物的差異

張 艷，王圣開，聶青玉，付 勛，馮婷婷，熊春梅，李 翔

（1.重慶三峽職業學院 農林科技學院，重慶 404155；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000）

烤魚營養豐富、風味鮮美，是重慶特色美食。在預制菜高速發展背景下，預制烤魚因打破傳統堂食烤魚消費的時效性和地域性，成為烤魚產業新的經濟增長點[1-3]。包裝方式影響肉品品質和風味[4]。目前，市售預制烤魚主要以普通托盒和真空包裝為主，烤魚多種包裝方式的研究有利于烤魚產品多樣化發展。

近年來，不同包裝方式對肉制品保鮮和風味的影響研究較多[5-6]，據文獻報道，水產及制品的包裝方式主要有真空、充氮、氣調包裝等，用于冰鮮黃顙魚[7]、鱸魚[8]、油炸帶魚[9]、脆肉皖魚[10]及牡蠣肉[11]中，能有效減少脂質氧化，維持魚肉鮮度及延緩風味劣變。Dang 等[12]研究發現真空包裝能更有效地抑制鯰魚片的脂肪氧化，在減少腥味物質、保持魚肉風味方面表現出了較大優勢。氣調包裝結合低溫處理方式可控制魚肉不良風味產生，實現較好的水產品風味保持效果[13-14]。風味是魚肉重要的品質特征，魚肉的風味包括氣味和滋味，魚肉中某些非揮發性物質如氨基酸類、核苷類、有機酸類、脂質類等物質除具有一定的營養功能外，同時是構成熟肉特征風味與口感的前體物質，這類物質的代謝物決定著肉質的滋味，影響魚肉品質[15-16]。目前，預制烤魚主要集中在單一真空包裝方式下質構、水分分布及脂質氧化等品質方面[17-18]及揮發性風味物質分析方面[19-20]的研究，而針對不同包裝方式預制烤魚非揮發性化合物如脂肪酸、氨基酸、核苷酸等的代謝物研究鮮有報道。

非靶向代謝組學可分析魚肉中蛋白質、脂質的代謝及風味變化情況，常用于食品研究中[21-23]。目前，運用非靶向代謝組學探究預制烤魚代謝產物組成的研究較少。本實驗以托盒包裝（tray packaging，TP）、真空包裝（vacuum packaging，VP）和氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP）的預制烤魚為研究對象，利用液相色譜-串聯質譜技術，基于非靶向代謝組學分析不同包裝方式下烤魚非揮發性物質的代謝產物組成，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）進行差異代謝物篩選，探究不同包裝方式下烤魚的代謝產物差異，以期為烤魚包裝多樣化發展及品質評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚（Cyprinus carpio） 梁平養殖基地；食鹽、料酒等香辛料 均購于重慶萬州區家益超市；PA/EVOH/PE 蓋膜 希悅爾（中國）有限公司；PP 包裝托盒、PE 真空袋 福建元晟新材料科技有限公司；甲醇、乙腈、氯仿 色譜純，北京迪科馬科技有限公司；2-氯苯丙氨酸 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PTFE 濾膜（0.22 μm） 天津市津騰實驗設備有限公司。

ACQUITY 型液相色譜儀（色譜柱：Waters,Milford,MA,USA） 美國Waters 公司；Q-Exactive 型質譜儀 美國Thermo 公司；YXD-90C 型電烤箱 廣州市賽思達機械設備有限公司；MAP-430型氣調真空包裝機 浙江瑞寶包裝機械有限公司；H2050R 型冷凍離心機 湘儀儀器有限公司；SCRC MV54 型混勻儀 國藥集團化學試劑有限公司；MB-96S 型組織研磨器 浙江美壁儀器有限公司；XZ-10DTD 型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烤魚樣品制備 鮮活鯉魚（1～1.2 kg）宰殺、清洗，背部剖開，放入6%的食鹽、少許料酒、老姜的腌制液中濕法腌制20 min（魚肉完全浸沒于腌制液），50～60 ℃干燥45 min 后，刷香油，250 ℃電烤箱中烤制20 min[20]。無菌冷卻后，每個包裝中隨機放入1 條烤魚，分別進行氣調包裝（30% CO2+70% N2）、真空包裝和托盒包裝。樣品于-2 ℃條件貯藏。30 d 后，每組樣品分別于魚體兩側的背部、腹部和尾部3 個位置6 個點取樣，混勻。每組樣品平行取樣3 份，液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中，待測。

1.2.2 樣品制備 稱量適量樣品，加入1 mL 提取液（9:1 甲醇-氯仿:H2O=3:1），加入3 顆鋼珠后放入組織研磨器中研磨（50 Hz，1 min），重復操作2 次；超聲（功率200 W）30 min，冰上放置30 min，離心10 min（12000 r/min，4 ℃），取上清液濃縮干燥；準確加入200 μL 2-氯苯丙氨酸（4 ng/mL）復溶樣品，過膜，用于檢測[24]。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。正離子模式流動相：0.1%甲酸乙腈（B1）和0.1%甲酸水（A1）；梯度洗脫程序：0～1 min，8% B1；1～8 min，8%～98% B1；8～10 min，98% B1；10～10.1 min，98%～8% B1；10.1～12 min，8%B1。負離子模式流動相：乙腈（B2）和 5 mol/L 甲酸銨水（A2），梯度洗脫程序：0～1 min，8% B2；1～8 min，8%～98% B2；8～10 min，98% B2；10～10.1 min，98%～8%B2；10.1～12 min，8% B2[25]。

1.2.4 質譜條件 使用電噴霧離子源（ESI），正負離子模式采集數據。正離子噴霧電壓：3.50 kV，負離子噴霧電壓：-2.50 kV；鞘氣40 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度：325 ℃。以分辨率 70000 進行一級全掃描掃描范圍100～1000，并采用HCD 進行二級裂解，碰撞能量為30 eV，二級分辨率為17500，采集信號前3 離子進行碎裂，同時采用動態排除無必要的MS/MS 信息[26]。

1.3 數據處理

采用RXCMS（V3.12.0）軟件包進行峰檢測、過濾、對齊處理，得到代謝物定量列表，通過總峰面積歸一化的方法進行數據矯正。通過諾米代謝自建數據庫及公共數據庫進行檢索比對后定性。使用SIMCA-P14.1 軟件進行PCA 和OPLS-DA 分析，通過VIP 值、P值進行差異物篩選。當VIP＞1 和P＜0.05 時，認為代謝物分子具有統計學顯著差異。通過Origin 繪圖。

2 結果與分析

2.1 預制烤魚代謝物的鑒定概況

對托盒、真空和氣調包裝的烤魚樣品中提取的代謝物進行鑒定，正負離子模式下，分別鑒定出1566、1185 個代謝物。將定量列表中含有二級譜圖的代謝物與數據庫中每個二級譜圖的碎片離子等信息進行比較、匹配，實現代謝物的二級定性鑒定。在二級質譜信息中，3 種包裝的烤魚共鑒定出318 種代謝物。主要包括69 種有機酸及衍生物、48 種氨基酸類及代謝物、35 種脂質及類脂質分子、33 種核苷酸及衍生物、26 種醇胺類、16 種有機氧化合物、11 種苯及衍生物、8 種生物堿及衍生物、4 種醛酮類化合物和68 種其他物質。318 種代謝物的化學分類及數量占比如圖1 所示。由此得出，烤魚中代謝物種類較多的物質為有機酸、氨基酸、脂質、核苷酸及衍生物類，這與Li 等[15]曾報道的熱加工處理的羅非魚肉中代謝物物質種類及數量占比的結果較為相似。魚肉中氨基酸、脂質和核苷酸被認為是味覺相關化合物[23]，對烤魚風味有重要影響。

圖1 烤魚中代謝物種類及數量占比Fig.1 Types and quantity proportion of metabolites in grilled fish

2.2 不同包裝預制烤魚代謝產物的多元統計分析

2.2.1 主成分分析 PCA 可反映各組樣品間的總體差異和組內樣品間的變異程度[27]。對不同包裝方式預制烤魚代謝物進行PCA 分析，如圖2 所示。正離子和負離子模式下PC1 和PC2 累計貢獻率分別為71.1%和71.5%，能反映樣品大部分信息。得分圖中3 組烤魚樣品代謝物分布在不同象限，可明顯區分開，說明3 種包裝預制烤魚代謝產物有一定差異。正負離子模式下，VP 組3 個平行樣代謝物較為聚集，而TP 和MAP 組的3 個平行樣有一定的離散性，這可能是因為組內樣品間烤魚個體差異導致。

2.2.2 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 通過設置預設分類變量來剔除未控制變量對數據造成的影響，能進一步量化各處理組間的差異程度，是一種適用于建立物質表達量與樣品類別間關系模型的有效判別分析方法[28]。TP、VP 和MAP 的烤魚代謝物OPLS-DA得分圖和置換檢驗圖如圖3、圖4 所示。在圖3 中得出，正負離子模式下，TP、VP 和MAP 組均分布于不同象限，3 種包裝的烤魚代謝物具有較好的聚類效果，說明不同包裝方式對預制烤魚代謝物存在較大影響。

圖3 不同包裝預制烤魚代謝產物的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging

圖4 不同包裝預制烤魚代謝產物的置換檢驗圖Fig.4 Permutation test plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging

OPLS-DA 模型中R2Y 代表模型對變量Y 的解釋性，Q2代表模型的可預測性，R2和Q2越接近1，且差值小（差值＜0.3），表明模型準確性好，有較好的解釋和預測能力。由圖4 可知，正離子模式下，R2Y=0.968、Q2=0.804，負離子模式下R2Y=1、Q2=0.938，說明模型可很好解釋不同包裝預制烤魚的代謝物差異。為避免模型出現過度擬合，對模型進行了200次置換檢驗，正負離子模式下，左邊隨機實驗值R2和Q2均低于最右邊的R2和Q2值，即均小于原模型的真實值，并且R2總是大于Q2，說明原模型不存在過擬合現象，能較好分析魚肉的代謝物信息。

2.3 不同包裝預制烤魚差異代謝物篩選

基于OPLS-DA 模型，以VIP＞1、P＜0.05 的代謝物作為3 種包裝烤魚的差異代謝物，結果見表1。由表1 可知，共篩選出47 種差異代謝物，分別為脂肪酸類代謝物10 種，核苷酸類代謝物10 種，氨基酸類代謝物9 種，有機酸及衍生物類7 種，苯及衍生物類3 種，醇胺類2 種，其他類6 種。脂肪酸類代謝物主要由脂肪降解和氧化產生，對魚肉風味有重要影響。3 種不同包裝烤魚樣品中，硬脂酸、棕櫚酸等飽和脂肪酸，亞油酸、9-十四烯酸等不飽和脂肪酸等物質在3 個樣品中差異顯著（P＜0.05），可能與包裝方式影響魚肉脂質水解及氧化程度不同有關；氨基酸具有呈味特性，如L-谷氨酸、氨甲酰天冬氨酸呈鮮味，L-蘇氨酸為甜味，L-酪氨酸、組氨酸呈苦味，這些氨基酸對烤魚滋味形成有重要貢獻作用[29]；核苷酸類代謝物參與滋味物質形成及脂質降解，且AMP、鳥苷酸等為呈味核苷酸，能與谷氨酸等物質有協同增鮮作用，對烤魚風味有促進作用；有機酸類具有呈香作用，部分有機酸因肉質變質而成。脂肪酸、氨基酸、核苷酸及有機酸類代謝物均與魚肉的滋味密切相關[30-31]。

表1 不同包裝預制烤魚的差異代謝物Table 1 Differential metabolites of prefabricated grilled fish with different packaging

2.4 預制烤魚差異代謝物的熱圖分析

對上述47 種差異代謝物定量矩陣數據進行數據標準化，進行差異代謝物聚類，繪制聚類熱圖。如圖5 所示，紅色越深代表該代謝物相對含量越高，藍色越深代表該代謝物相對含量越低。MAP 組烤魚中有8 種代謝物相對含量較高，分別為5 種氨基酸類、2 種核苷酸類和1 種其他類小分子物質。氨基酸類代謝物主要是蛋白質降解生成，具有一定營養價值，也是魚肉重要的滋味物質和香味前體物質[28]。MAP組中相對含量較高的氨基酸分別為L-蘇氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、3-甲基-L-酪氨酸和N-乙酰-組氨酸。這5 種氨基酸在3 組樣品中的相對含量存在差異，可能是因為3 種包裝烤魚的氨基酸代謝程度不同導致。據報道，氣調包裝能有效抑制肉制品中優勢腐敗菌的生長，改變肉品菌群結構，從而降低氨基酸代謝速率，因而表現為氨基酸相對含量較高[10,32]。MAP 組中相對含量較高的核苷酸類代謝物為單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）和肌苷。其中，AMP 是重要的呈味核苷酸，是衡量肉品鮮味物質指標肌苷酸（IMP）的前體物質，由魚肉中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在酶的催化下降解而成。據報道，AMP 對魚肉風味有增強作用，可抑制水產品的苦味，從而對提高肉品滋味有重要作用[15]。AMP 在脫胺酶作用下，生成肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）、肌苷等下游物質，肌苷具有苦味，對魚肉風味亦有重要影響。AMP、肌苷在3 組烤魚樣品中的相對含量存在差異，可能與核苷酸代謝程度有關。綜上所述，MAP 組樣品中，多種呈味氨基酸及鮮味核苷酸AMP 相對含量較高，說明MAP 對烤魚鮮味的保持有積極作用。

圖5 不同包裝預制烤魚差異代謝物的聚類熱圖Fig.5 Heat map of different metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging

VP 組烤魚中有8 種代謝物相對含量高，分別為4 種脂肪酸類，2 種氨基酸類和2 種核苷酸類。脂肪酸氧化形成的醛、酮類物質是形成魚肉風味的主要揮發成分[19]，因此脂肪酸也是烤魚風味的前體物質。VP 組中硬脂酸、9-十四烯酸、亞油酸和棕櫚酸4 種游離脂肪酸相對含量最高，這可能與VP 組烤魚包裝內部缺氧，脂肪氧化程度減緩有關[12]。其次，VP 組中N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、L-谷氨酸相對含量高，對烤魚鮮味有重要貢獻作用。核苷酸代謝物中，尿苷和鳥苷酸（guanylate，GMP）相對含量較高，尿苷是構成動物細胞核酸的有關成分，是尿嘧啶前體物質。GMP 有特殊的香菇鮮味，是重要的呈味核苷酸[33]。

TP 組烤魚的差異代謝物較多，其含量較高的代謝物主要有核苷酸類、有機酸類及醛類等小分子物質。核苷酸類代謝物主要有腺苷、腺嘌呤、次黃嘌呤和尿嘧啶，此類代謝物均為AMP 降解的下游物質，其含量較高，這可能是因為TP 組烤魚核苷酸代謝進程較快，AMP 脫氨降解生成下游產物，表現為AMP相對含量降低，降解產物增加。相較于VP 和MAP組，TP 組烤魚的鮮味物質指標AMP、IMP 相對含量低，鮮味和新鮮度下降。有機酸類代謝物中主要有尿刊酸、脲基琥珀酸、喹啉-4-羧酸、2-羥基戊二酸和α-二嗎啉酸等，因為TP 組中氧氣含量高，微生物增長速度快，導致魚肉產生酸性代謝產物，這與溫冬玲[34]報道的雞肉貯藏中有機酸類物質隨微生物活動增加而含量增高的結果相似。TP 組烤魚中鞘氨醇、3-酮鞘氨醇、硬脂酰胺、谷氨酸半醛、1H-咪唑-4-乙醛相對含量高于VP 和MAP 組，可能是因為TP 組烤魚因包裝內的氧氣，加快烤魚中蛋白質和脂質氧化進程，產生胺類、酸類和醛類等物質，而這些物質的積累，可能導致魚肉風味劣變[35]。此外，TP 組烤魚中吲哚含量明顯高于VP 和MAP 組，吲哚主要為氨基酸代謝的低級產物，產生腐敗的臭味。

綜上所述，3 種不同包裝烤魚的差異代謝物相對含量存在差異。MAP 組中相對含量較高的差異代謝物主要為游離氨基酸、AMP 和肌苷；VP 組的差異代謝物主要為游離脂肪酸；TP 組烤魚脂質氧化、氨基酸代謝及核苷酸代謝程度高，反映出脂質氧化產物如醛類、氨基酸代謝產物如吲哚及核苷酸代謝產物嘌呤等物質相對含量高。因此，3 種包裝烤魚中，MAP能較好保持烤魚鮮味物質，VP 減少了脂質氧化程度，VP 和MAP 組烤魚在指示鮮味的代謝物指標上優于TP 組。

3 結論

采用非靶向代謝組學研究不同包裝預制烤魚的非揮發性物質的代謝物情況。通過多元統計分析，3 種包裝方式烤魚的代謝物具有較大差異，共篩選出47 種差異代謝物，主要有脂肪酸類代謝物10 種，核苷酸類代謝物10 種，氨基酸類代謝物9 種，有機酸及衍生物類7 種，醇胺類2 種，苯及衍生物類3 種，其他類6 種。聚類熱圖分析發現，MAP 組烤魚相對含量較高的代謝物主要為游離氨基酸、鮮味核苷酸AMP 和肌苷；VP 組含量較高的差異代謝物主要為游離脂肪酸；TP 組與MAP、VP 組烤魚相比，氨基酸、脂肪酸和核苷酸代謝程度高，主要表現為其代謝的下游產物含量高。由此得出，相較于傳統的烤魚包裝方式，MAP 能較好保持烤魚的鮮味物質。

風味影響預制烤魚的品質。目前，預制烤魚的研究主要集中在真空包裝下不同原料、不同熱制工藝烤魚的揮發性風味成分等方面，本研究以預制烤魚的不同包裝方式為切入點，進行非揮發性物質代謝物的差異分析，明確了不同包裝預制烤魚的差異代謝物情況，為預制烤魚風味的研究提供理論依據，并為拓展預制烤魚包裝多樣化發展提供數據支撐。后期工作將結合不同包裝方式下烤魚貯藏過程中理化、感官、安全等品質指標進行綜合分析，為預制烤魚包裝優化提供指導依據。

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