粳稻苗期惡苗病抗性相關性狀與SSR標記關聯分析

摘要：以來自不同地區的167份水稻品種為供試材料，2021年和2022年連續2年采用芽期接種法進行惡苗病抗性鑒定，在水稻3.0～3.5葉期對得病率（IR）、徒長率（SGR）和苗增重率（WGR）進行統計和測量。利用TASSEL 3.0軟件的GLM將3個表型性狀與154對SSR標記位點進行關聯分析，2021年檢測到22個位點，2022年檢測到13個位點，共有4個位點在2次鑒定中被同時檢測到，分別是位于第6、第3和第4號染色體上與IR顯著關聯的RM527、RM1352和RM1354，位于第7號染色體上與SGR顯著關聯的RM473。同時進一步挖掘出9個優異等位變異及相應載體材料，發現龍稻1號、遼粳912、五優稻1號等是含有2個及以上等位變異的較優材料。

關鍵詞：粳稻；惡苗病抗性；SSR標記；關聯分析；等位變異

中圖分類號：S435.111.4+4" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0051-07

水稻惡苗病是一種種傳病害，主要由惡苗病病菌在種子發芽過程中侵染胚芽導致發病，患病植株主要表現為植株細高，葉片葉鞘細長，葉色淡黃，根系發育不良，部分病苗在移栽前枯萎死亡。水稻生長的任意一個時期都可能感染惡苗病病菌，從而引發惡苗病。水稻惡苗病的大面積發生，可導致作物產量減少40%以上，造成巨大的經濟損失，嚴重制約水稻的安全生產［1］。

防治惡苗病最直接、經濟、有效的方法就是培育抗惡苗病水稻新品種。選育抗惡苗病水稻品種的前提是篩選和挖掘抗性資源。惡苗病的抗性鑒定主要包括病菌的培養、接種和抗性水平的評價。前人關于水稻惡苗病的接種鑒定方法的研究有很多，呂彬對芽期浸菌接種、立針期噴霧接種、芽期加立針期接種、穗期噴霧接種等多種方法進行了比較，結果表明，芽期浸菌接種致病效果最佳，可用此方法區分不同水稻品種的抗感水平［2］。Yadav等發現，惡苗病病菌生長繁殖的最適溫度是20 ℃、最適pH值為5.0，并進一步得出以谷殼作碳源的培養基病菌生長速度最快和以甘蔗作碳源的培養基孢子產量最大的結論［3］。Hossain等在鑒定不同水稻品種抗性試驗中發現，用1.5×105個/mL惡苗病病菌孢子懸浮液浸種36 h處理效果最佳［4］。在惡苗病抗性水平的評價上，出現了多種衡量指標。有的基于發病癥狀對抗性水平進行定級［5-6］，有的通過發病癥狀統計發病率、健康植株率來衡量抗性水平［7-8］。季芝娟在定位惡苗病抗性相關數量性狀位點（QTL）研究中，利用徒長率（SGR）和苗增重率（WGR）來衡量試驗材料的惡苗病抗性水平，并得出2個性狀存在相關性的結論［9］。

關聯分析是以連鎖不平衡（LD）為基礎，分析自然群體材料某目標性狀與分子標記或候選基因間連鎖遺傳關系的一種方法，在水稻、玉米等作物中已被廣泛應用［10-12］。本研究以167份不同地理來源的水稻品種為材料，對其進行連續2次苗期惡苗病抗性鑒定，利用154對簡單重復序列（SSR）標記與得病率（IR）、徒長率、苗增重率等進行關聯分析，旨在挖掘與IR、SGR和WGR等惡苗病抗性性狀相關的SSR標記位點，為高抗惡苗病水稻的選育提供分子理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以167份地理分布廣泛的粳稻品種為供試材料（表1）。其中，來自我國遼寧、吉林、黑龍江的材料分別有14、32、48份，來自日本的材料有47份，來自朝鮮的材料有7份，來自俄羅斯的材料有5份，來自韓國的材料有14份。

1.2 SSR標記分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法進行DNA提取［13］。利用黑芒稻、元子二號、金鉤、東農424和龍粳20的DNA對筆者所在實驗室已有的500對SSR引物進行多態性篩選，從中篩選出154對多態性高的SSR引物，對167份材料進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：2 μL模板DNA（25 ng/μL），2 μL SSR引物（12 ng/μL），3 μL PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2溶液（25 mmol/L），0.3 μL Taq酶（5 U/μL），0.2 μL" dNTP（10 mmol/L），最后加入11 μL ddH2O使總體積達到20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法進行檢測。

1.3 惡苗病病菌的培養

5種惡苗病病菌混合菌株由黑龍江省農業科學院水稻研究所植物保護研究室提供，用高粱培養基進行擴大培養，培養完成后用無菌純凈水將孢子沖洗下來，配制濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液，對其進行鏡檢，以100倍鏡下每個視野約有2 000個孢子為宜。

1.4 芽期接種

本試驗于2021年和2022年連續2年在黑龍江省農業科學院水稻研究所的實驗室進行。采用芽期接種法，試驗設置處理和對照，每組3次重復。先將供試種子裝入有孔膠卷盒中，進行浸種和催芽，再將處理組的種子浸在惡苗病病菌孢子懸浮液中接種12 h，撈出控干水分，采用育苗盤育苗，每個品種播種100粒。在水稻3.0～3.5葉期調查植株得病率，每個品種選5株測量其株高和植株干重，每年鑒定1次。徒長率和苗增重率的計算方法如下：徒長率=（處理株高平均值-對照株高平均值）/對照株高平均值×100%，苗增重率=（處理干重平均值-對照干重平均值）/對照干重平均值×100%。

1.5 數據分析

利用Excel軟件對得病率、徒長率和苗增重率等性狀的平均值、標準差及變異系數進行統計分析。使用Structure 2.3.4軟件進行群體結構分析，群體K值取值范圍為1～10，馬爾科夫鏈蒙特卡洛（MCMC）參數設為100 000，不作數迭代（length of burn-in period）設為10 000，每個K值重復運行10次。依據最大似然值原則確定合適的群體K值，若對數似然值lnP（D）隨亞群數K值增大而增大，則采用ΔK來確定最適K值［14-15］。運用TASSEL 3.0軟件計算兩兩位點之間的D′值，以此來評價供試材料群體的連鎖不平衡（LD）程度（等位基因頻率＜5%的稀有等位基因作為缺失處理）。當P≤0.01時認為該標記與目標性狀的LD達到顯著水平［16］。將Structure 2.3.4軟件運行后得到的Q值作為協變量，利用TASSEL 3.0軟件中的廣義線性模型（GLM）進行相關性狀與標記的關聯分析，當P≤0.01時認為該標記與目標性狀關聯［17］。

1.6 優異等位變異挖掘

在上述關聯分析的基礎上，參照Zhang等的方法［18］進行優異等位變異挖掘。以群體平均值為對照，估算關聯位點等位變異的表型效應值，并列出攜帶該等位基因的3個最佳品種材料。

2 結果與分析

2.1 粳稻苗期惡苗病抗性鑒定

對2021年與2022年鑒定的167份水稻品種的得病率進行統計分析，以2次鑒定的平均得病率為評價指標，平均得病率最小的5個品種分別是雙豐8號、咸南23號、日立23、12346和早晉富，得病率分別為8.7%、8.0%、8.8%、4.8%和6.3%。

2.2 群體結構分析

利用167個供試材料在154對SSR引物擴增下的基因型數據，結合Structure 2.3.4軟件對該自然群體進行結構分析。由圖1可知，對數似然值 lnP（D） 隨亞群數K值的增大而增大，無法確定最適K值，故采用ΔK來確定合適K值。當K=2時，ΔK為最大值，因此判定樣本亞群數為2。利用Structure 2.3.4軟件計算出每個品種歸屬于2個亞群的后驗概率值，以此來劃分每個品種歸屬的亞群，將概率值≥0.8作為亞群分類條件，不符合條件的歸于混合亞群，將亞群分別命名為P1、P2和混合亞群（MIX）。由圖2可以看出，P1包括14份材料，P2包括114份材料，剩余的39份材料被劃分入MIX。利用Structure 2.3.4軟件計算出K=2時各材料的Q值并應用于下一步的關聯分析中。

2.3 連鎖不平衡分析

使用TASSEL 3.0軟件對上述2個亞群154對SSR標記位點的連鎖不平衡狀況進行分析，計算出所有可能位點的D′值和P值，用來評價群體的連鎖不平衡程度，其中稀有等位變異即變異頻率lt;5%作為缺失處理。評價位點間顯著連鎖不平衡的標準是P≤0.01。圖3直觀地顯示出連鎖狀態的位點組合，用不同的顏色表示每對多態性位點間的D′值和Fisher檢驗的P值。結果表明，在11 628個成對SSR位點組合中共線性組合和非共線性組合間均存在一定程度的LD（斜線左下方非白色小格）。統計概率（P＜0.01）支持LD成對的SSR位點有890個，占全部位點組合的7.7%。

2.4 苗期惡苗病抗性相關性狀與SSR位點間的關聯分析

利用TASSEL 3.0軟件的GLM功能模塊分別對惡苗病相關性狀進行關聯分析。由表2可知，第1次（2021年）鑒定檢測到與3個抗病相關性狀顯著關聯的SSR標記位點共22個，其中與IR相關聯的標記7個，與SGR相關聯的位點11個，與SWR相關聯的位點4個；在第2次（2022年）鑒定檢測到與抗病性狀相關聯的位點共13個，其中與IR相關聯的標記7個，與SGR相關聯的位點3個，與WGR相關聯的位點3個。在2次鑒定中共有4個位點被同時檢測到與IR和SGR性狀顯著關聯，分別是與IR顯著關聯的RM527、RM1352和RM1354，分別位于第6、第3和第4號染色體上，且2次鑒定累計表型貢獻率均大于35%；與SGR顯著關聯的位點是RM473，位于第7號染色體上，2次表型貢獻率分別是11.91%和9.10%。

2.5 優異等位基因及載體材料

將本研究在2年鑒定中同時檢測到的4個位點用來進一步挖掘優異等位變異。因為標記間的等位變異表型效應值為負數時才對水稻的惡苗病抗性有積極的促進作用，所以將2年中表型效應值小于零的優異等位變異進行整理，并列出攜帶該等位變異的3個最佳品種。由表3可知，共有9個優異等位變異在2年中均被檢測到，分別是RM473-90、RM473-100、RM527-225、RM527-230、RM527-235、RM527-240、RM1354-205、RM1354-210、RM1354-215，其中RM1354-205在2年里的表型效應絕對值均最大，分別是5.52和7.43。從表3中可以發現，龍稻1號、遼粳912、五優稻1號、東農424、龍盾104等較優材料在2年鑒定中含有2個及以上優異等位變異，且均具有較高惡苗病抗性。

3 討論

3.1 黑龍江水稻惡苗病的發生

有研究指出，催芽階段最易感染惡苗病病菌［19］。為方便農民生產，現在黑龍江省絕大多數農場都采用催芽工廠集中浸種催芽，而惡苗病屬于種傳病害，帶菌種子為惡苗病的初侵染源，在浸種催芽時極易大量繁殖與傳播，導致惡苗病大規模發生。這與季芝娟等的觀點［20］一致。本研究采用的芽期接種法符合生產實際。

3.2 抗惡苗病品種的選育

研究表明，不同水稻品種之間對惡苗病病菌的抗性存在明顯差異，通過人工選擇培育抗性強的水稻品種是最直接、有效的控制惡苗病發生的手段。本研究對現有水稻品種進行抗性篩選，發掘高抗水稻資源，可作為培育高惡苗病抗性水稻的骨干親本，為抗性水稻的親本選育提供理論依據［21］。

3.3 化學防治惡苗病

在當下的水稻生產實踐中，采用種衣劑包衣和浸種劑消毒是防治水稻惡苗病最主要的防治手段。研究表明，長期使用單一藥劑及采用長時間、低濃度的方式浸種易使病原菌產生抗藥性。2種或多種藥劑混合使用的防治效果顯著優于單一藥劑的使用效果［22］。近年來，以氰烯菌酯為有效成分的藥劑在生產實踐中對田間惡苗病有良好的防治效果，被廣泛應用于水稻生產中［23］。在采用混合藥劑浸種時，要注意防止高濃度、長時間浸種對種胚造成的損傷，而影響種子出苗和正常生長。在藥劑選擇時，可以考慮選擇微生物拮抗藥劑，可有效避免農藥殘留，還具有安全性高、綠色環保等特點。

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