gga-miR-26a的組織特異性表達及其靶基因的預測分析

摘要：為初步闡明gga-miR-26a在雞脂肪沉積中的作用，以矮小品系S3系（DW）和隱性白羽雞（RR）為試驗素材，采用實時熒光定量PCR法檢測gga-miR-26a在2個品種不同生長發育時期肝臟、腹脂及腿肌組織，腹脂和肌內脂肪細胞增殖期和分化期的表達變化，并利用生物信息學的方法，對gga-miR-26a靶基因進行預測和分析。結果表明，gga-miR-26a在S3系雞（DW）和隱性白羽雞（RR）16 W時肝臟組織中的表達存在顯著的品種差異，S3系雞在5個發育階段表達均高于隱性白羽雞；腹脂組織中，gga-miR-26a在0 W時存在極顯著的品種差異（P＜0.01）且顯著高于其他周齡；gga-miR-26a在腿肌組織中的表達無顯著的品種差異（Pgt;0.05）；在脂肪細胞中，gga-miR-26a在分化4 d的表達顯著高于增殖期（Plt;0.05）。利用TargetScan、miRDB、miRmap等3個軟件對gga-miR-26a靶基因進行預測，共預測到163個交集靶基因；GO及KEGG分析提示gga-miR-26a可能通過靶向調節PTEN、ULK2和PRKCD的表達，進而調控雞的脂肪沉積。綜上所述，gga-miR-26a在2個品種雞脂肪相關組織及脂肪細胞中均有表達，且具有顯著的品種差異；gga-miR-26a參與了雞的脂肪沉積過程，PTEN、ULK2和PRKCD可能是gga-miR-26a調控脂肪沉積的預測靶基因。

關鍵詞：gga-miR-26a；雞；表達特性；靶基因

中圖分類號：S831.2" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0064-06

在我國，由于雞的生產成本比較低，而且具有很高的飼料轉化率，它已經成為繼豬肉之后的第二大肉食性食品。在很長時間內，將快速增長/增重作為肉雞選擇的主要目標，但這也造成了屠體脂肪含量過多，進而引發了一系列的問題，比如降低了飼料轉換效率，還會影響到屠宰的質量，對肉、蛋雞的產蛋性能產生影響［1］。脂肪性狀是畜禽肉品質評價的重要指標，胴體組成、肉色和嫩度等因素決定肉質性狀，脂肪沉積量和沉積部位則是肉質性狀的影響因素［2］。脂肪性狀是數量性狀，受多基因調控，挖掘出與脂肪沉積密切相關的基因將為進一步揭示脂肪沉積的分子機制奠定基礎。

miRNA是一個小的（20～23 nt）非蛋白質編碼RNA家族，它主要是發揮基因表達的轉錄后調節因子的作用，在翻譯層面上，miRNA是通過根據序列互補性的靶向mRNA來控制基因表達的［3-4］。miR-26a 在第3條染色體和第12條染色體上均表達，分別是miR-26a-1、miR-26a-2［5］。研究表明，miR-26a的表達量與癌癥的進展關系密切。miR-26a可以作為一種乳腺癌的抑癌基因，它可以通過靶向作用于FAM98A來抑制癌細胞的生長和侵襲［6］，miR-26a介導的PTEN可以促進體內膠質瘤的發生［7］，還能靶向NEK6并抑制馬立克氏病淋巴瘤細胞增殖［8］，FBXO11介導miR-26a對肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲有抑制作用［9］。

miR-26a不但調控癌癥過程，而且與生理功能有關，包括血管生成、骨骼肌細胞分化和骨骼肌損傷后再生以及脂質代謝［10-12］。miR-26a可抑制TGF-β誘導的韌帶成纖維細胞增殖［13］；在高脂肪飲食的小鼠中，miR-26a可通過減少脂肪酸合成從而減輕肥胖引起的代謝并發癥［14］；lncRNA GAS5敲低通過調節miR-26a-5p/PDE4B來激活cAMP/CREB途徑來減輕肝臟脂質積累［15］；miR-26a被抑制后，會導致創面血管生成和細胞增殖，進而加快創面愈合速度［16］。綜上所述，miR-26a參與了哺乳動物的肌肉生成和脂肪代謝過程。在家禽上，gga-miR-26a 的研究尚不完善。有研究報道，gga-miR-26a是光感受器L型電壓門控鈣通道α1C亞基（L-VGCCα1C）晝夜節律調控表達的關鍵轉錄后調節因子［17］。目前關于gga-miR-26a與優質肉雞脂肪沉積（腹脂和肌內脂肪沉積）的關系知之甚少。本試驗以江蘇省家禽科學研究所自主選育的矮小品系S3（DW）和隱性白羽雞（RR）為試驗材料，分析gga-miR-26a在不同時期的肝臟、腹脂、腿肌組織以及腹脂和肌內脂肪細胞增殖期和分化期的表達差異，將為明確gga-miR-26a在雞脂肪沉積中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗以江蘇省家禽科學研究所的DW及RR為材料，分別采集0天（0 W）、2周（2 W）、8周（8 W）、14周（14 W）、16周（16 W）的肝臟、腹部脂肪及腿部肌肉樣本，每個樣本6個重復，并將其快速冷凍后置于-80 ℃條件下進行貯藏。

1.2 細胞培養

雞原代脂肪細胞的培養根據Cryer等借鑒哺乳動物的方法［18］，利用膠原酶消化法進行細胞提取。在原代細胞融合率達到70%的情況下，傳代鋪板。

當傳代后的細胞融合到70%的時候，用0.1%油酸進行誘導分化，將這一時刻界定為分化0 h，沒有添加油酸組的為增殖期細胞，在分化后的第1天、第4天、第6天以及增殖期收集細胞。

1.3 總RNA提取

使用miRNA提取分離試劑盒與紫外分光光度計，分別對各組織與細胞樣本中的總RNA進行提取，并對RNA濃度和純度進行檢測（1.8≤D260 nm/D280 nm≤2.0）。

1.4 實時熒光定量

實時定量qPCR引物使用miRNA Design v1.01設計（表1）。各樣本中提取3 μL總RNA，用逆轉錄酶對miRNA進行第一鏈cDNA的反轉錄以及以第一鏈cDNA為模板的qPCR反應。以矮小品系S3雞0 W的表達量為參照日齡，以U6作為用于歸一化的基因（內參），采用2-ΔΔCT法對miRNA相對表達的數據進行分析。

1.5 靶基因預測及信號通路富集分析

利用3個軟件對miRNA靶基因進行預測，分別是TargetScan （https：//www.targetscan.org/vert_72/）、miRDB （http：//www.mirdb.org/.org/）、miRmap （https：//mirmap.ezlab.org/）。根據預測結果繪制venny圖，選擇3個在軟件預測中出現次數超過2次的基因作為候選目標基因。將預測的靶基因集合，通過DAVID在線工具和KOBAS 3.0在線工具對靶基因的生物學功能進行分析。

1.6 數據處理

雞gga-miR-26a的相對表達水平可以采用2-ΔΔCT法分析。試驗結果用平均數±標準差表示。用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 肝臟組織中gga-miR-26a的表達

肝臟組織中gga-miR-26a的表達在16 W時具有顯著品種特異性。5個時間點DW雞的表達量均高于RR雞。gga-miR-26a在DW雞的表達量8 W時最低，8 W后直線上升。除16 W外，gga-miR-26a在RR雞各周齡的表達量差異不顯著（圖1）。

2.2 腹脂組織中gga-miR-26a的表達

gga-miR-26a在腹脂組織中0 W時的表達量存在顯著的品種差異。0 W時DW雞與RR雞的 gga-miR-26a 相對表達量最高，顯著高于其他周齡。gga-miR-26a在2～16 W相對穩定地保持在低表達水平（圖2）。

2.3 腿肌組織中gga-miR-26a的表達

gga-miR-26a在腿肌組織中的表達存在一定的品種差異，0 W時gga-miR-26a在DW雞與RR雞中的相對表達量最低，8 W前gga-miR-26a在DW雞中的相對表達量高于RR雞，而14 W開始DW雞低于RR雞（Pgt;0.05）。2個品種間，gga-miR-26a在同一周齡的表達相對穩定，差異不顯著（圖3）。

2.4 脂肪細胞中gga-miR-26a的表達

在雞腹脂脂肪細胞中，gga-miR-26a的相對表達量在分化1 d最低，顯著低于增殖期（圖4，Plt;0.05）；在肌內脂肪細胞中，gga-miR-26a在分化 4 d 和 6 d 的相對表達量顯著高于增殖期（Plt;0.05，圖5），在分化1 d開始表達量呈現直線上升趨勢。

2.5 gga-miR-26a靶基因預測及功能分析

利用在線軟件TargetScan、miRDB和miRmap，預測出了gga-miR-26a的靶基因，它們分別是469、972、1 072個。將3種方式中超過2次的基因進行并集，得到了163個目標基因（圖6）。

對163個靶基因進行GO功能富集分析，GO分析結果（圖7）分為細胞組分（cellular component，簡稱CC）、分子功能（molecular function，簡稱MF）和生物過程（biological process， 簡稱BP）等3個部分。

在生物學過程分類中，靶基因主要富集到肽基蘇氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白質去磷酸化、蛋白質自磷酸化、轉錄調控，DNA模板、GTP酶活性的正向調節等過程；在細胞組分分類中，靶基因主要富集到胞質溶膠、核質、質膜等活動中；在分子功能分類中，靶基因主要富集到蛋白激酶結合、小GTP酶結合、相同蛋白結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析結果如圖8所示，預測到的靶基因在mTOR信號通路（ULK2、RPTOR、RPS6KA6、PTEN、MTOR、STRADB）、自噬-其他（ULK2、RPTOR、MTOR）、自噬-動物（ULK2、PTEN、RPTOR、MTOR、PRKCD）、 信使核糖核酸監測途徑（PPP2R3B、ETF1、CPSF4、PPP2R5A）等途徑顯著富集。

3 討論

本試驗結果表明，不同發育階段的肝臟、腹脂和腿肌組織中，gga-miR-26a在呈現不同的表達模式。gga-miR-26a在2個品種肝臟組織中的表達具有顯著的差異，DW雞在肝臟組織中 gga-miR-26a 的相對表達量始終高于RR雞，gga-miR-26a 在腹脂組織中0～2 W時的相對表達量RR雞高于DW雞，gga-miR-26a在腿肌組織中的相對表達量8 W以前DW雞高于RR雞。綜上所述，miR-26a 不但參與哺乳動物肌肉發育及脂肪代謝的調控過程，同時也參與了優質肉雞肌肉發育和脂肪代謝的調控，而gga-miR-26a對肌肉發育和脂肪沉積調控作用的時間因品種而異。gga-miR-26a 在體外腹脂和肌內脂肪細胞分化后期的表達量顯著高于增殖期，推測脂肪細胞分化后期是gga-miR-26a主要調控時期。有研究報道，哺乳期間通過乳汁供應的miR-26a表達量的改變能夠改變后代中靶基因的表達，并可能影響脂肪組織的發育［18］；miR-26a是一種有效的脂肪前體細胞分化抑制劑，其作用靶點是Fbxl19［19］；miR-26a是一個抑制豬前體脂肪細胞分化的基因，它通過介導ACSL3來促進肌前體脂肪細胞中脂滴的累積［20］；高表達的AP2-microRNA-26a具有降低內臟脂肪含量及血脂的作用［21］。這表明miR-26a對脂肪的調節不僅在同一物種不同品種中有差異，在物種間也存在一定的差異，后期將進一步驗證這一推論。

miRNA對相關性狀的調控都是通過靶向基因來實現的，靶基因的預測是深入研究miRNA功能的重點。本研究采用3種預測軟件進行預測，共得到163個交集靶基因，顯著富集在mTOR信號通路、信使核糖核酸監測途徑等信號通路，其中富集在mTOR信號通路、自噬-其他、自噬-動物3條通路中的靶基因都有報道與脂肪沉積密切相關。富集在mTOR信號通路、自噬-其他和自噬-動物的ULK2基因，有研究報道其主要在脂肪細胞中發揮調控脂類代謝的作用［22］；富集在mTOR與自噬-動物通路的PTEN，有研究表明，miR-26a正向調控3T3-L1細胞成脂分化，其機制可能與PTEN有關［23］，miR-21能促進BMSCs成骨分化，且能負性調控PTEN，抑制BMSCs成脂分化［24］；富集在自噬-動物的PRKCD在誘導3T3細胞的脂肪形成中起重要作用，并對脂肪形成起抑制作用［25］。綜上所述，推測PTEN、ULK2和PRKCD可能是miRNA-26a參與調控雞脂肪代謝或肌肉發育的靶基因，后續通過體外功能試驗和熒光素酶報告基因進行驗證時將重點關注這3個靶基因。

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