94份水稻骨干材料抗稻瘟病基因和恢復基因的分子檢測與分析

摘要：為明確6個抗稻瘟病基因（Pita、Pi54、Pia、Pib、Pikm、Pikh）和1個恢復基因（Rf1a）在水稻骨干材料及新品系中的基因型和分布情況，從而為今后抗稻瘟病基因和恢復基因的合理利用及分子標記輔助育種提供依據，利用6對擴增條帶清晰、穩定的抗稻瘟病基因特異性分子標記對48份水稻品系的基因組DNA進行PCR擴增，利用恢復基因分子標記Rf1a對46份外引及自育恢復系材料進行檢測。結果表明，在48份水稻骨干材料及品系中，單個種質攜帶的抗稻瘟病基因為1～6個，攜帶4個抗稻瘟病基因的品系最多，占總數的33.33%，其次為攜帶3個（22.92%）、2個（18.75%）抗稻瘟病基因的品系，攜帶6個抗稻瘟病基因的種質資源最少（4.17%）；6個抗稻瘟病基因在48份水稻種質中的分布差異較大，Pib、Pikh、Pi54在供試粳稻中的分布最廣泛，分布頻率分別達到77.08%、64.58%、62.50%，其次為Pita、Pikm、Pia，分布頻率分別為47.92%、41.67%、33.33%；48份水稻種質共有抗稻瘟病基因組合22個，其中組合Pia+Pi54+Pikh+Pib和組合Pi54+Pikh+Pib的水稻材料數量最多（各6份）。在46份外引及自育恢復系材料中，攜帶恢復基因Rf1a的占93.48%。通過分子標記手段明確了相關種質的抗稻瘟病基因類型，為抗稻瘟病和恢復系新品系的選育及親本組配提供了較好的遺傳信息。

關鍵詞：水稻；骨干材料；抗稻瘟病基因；恢復基因

中圖分類號：S435.111.4+1" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0058-06

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物之一，水稻的高產、穩產對于維護我國糧食安全具有重要意義［1］。隨著農業供給側結構性改革的深入推進和鄉村振興戰略的全面實施，我國優質稻生產迎來新的變革，水稻生產由高產逐漸向穩產、優質、增效方向轉變。

稻瘟病是水稻三大病害之一［2］，稻瘟病的發生會嚴重影響水稻產量［3］，輕發區域減產達10%～20%，嚴重區域減產達到40%～50%，甚至導致顆粒無收［4］，極大地阻礙了水稻產業的可持續發展。目前，對稻瘟病的防治主要采取培育抗病新品種、生物防治、化學防治和栽培管理等策略［5］。研究發現，培育和合理利用抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最經濟有效的方法，但是由于稻瘟病生理小種的多樣性且復雜多變，使得抗稻瘟病品種的抗性可能會發生變化［6］。因此，只有加強對水稻種質資源抗稻瘟病的鑒定與評價，才能挖掘更多的抗稻瘟病基因，從而培育持久廣譜的抗稻瘟病品種［7］。相關研究表明，稻瘟病生理小種在不同地區、年份、種植條件下明顯不同［8-10］，因此，同一品種在不同地區種植，其抗性表現不一定相同，隨著連續大規模種植的推廣，一個抗病品種的抗性也會降低或喪失［11］。在傳統水稻育種工作中，稻瘟病抗性育種主要依靠接種鑒定和表型選擇［10］，導致選育周期長且容易產生誤差。

雜交水稻以其高產穩產、植株健壯、根系發達、分蘗力強、穗大粒多、米質優良等特性，在豐產和抗病等方面比常規種更具優勢［12］。隨著超級稻“四期”育種目標的成功實現，我國雜交水稻育種已步入新的發展階段，雜交稻的推廣應用對國內的水稻生產起到了重要作用［13］。雜交稻分為“三系”和“兩系”，其共同的親本都含有恢復系，恢復系的好壞直接決定雜交稻的產量?；謴拖祵τ缘幕謴湍芰εc恢復基因（fertility restorer gene，Rf）密切相關，但強效恢復基因在粳稻中所占比例較低［14］，許多恢復基因是從秈稻中引入的，而秈粳雜交的后代群體存在層次不齊、性狀穩定困難、恢復基因導入概率低等問題。

隨著功能基因組及分子育種技術的快速發展，大量可用于水稻遺傳育種的功能基因被挖掘，使稻米產量、品質得到較大提高，育種已進入以基因組為支撐、以生物信息大數據分析為輔助、以產業重大需求和科技引領相結合為導向、以現代分子遺傳技術為手段的分子設計育種時代。隨著越來越多高產、優質、抗病蟲、抗逆基因被克隆，分子標記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）已在遺傳改良方面發揮重要作用，通過與目標性狀基因型緊密連鎖的功能標記，在DNA水平上直接確定基因型并對目標性狀進行改良，已經成為新品種（品系）選育的常用方法［15］。目前，已有110多個稻瘟病抗性基因和500多個數量性狀基因座（QTLs）被鑒定［16］，它們分布于水稻12條染色體上的不同位點，其中至少有26個已被克隆，包括Pi9、Pigm、Pi7、pi21、Pi50、Pi57和Ptr等為廣譜抗性基因［17］。在當前生產上應用面積最大的粳稻不育系為包臺型（CMS-BT），其育性恢復性受1對顯性基因控制。截至目前，已有4個育性恢復QTL被定位到水稻10號染色體上［18］。王東元等利用特異性分子標記對107份粳稻材料的恢復基因及10個抗稻瘟病基因進行檢測和分析，明確了不同材料攜帶的基因類型，為稻瘟病、恢復基因的利用提供了借鑒［19］。陳志偉等通過回交育種結合MAS（分子標記輔助選擇），選育出10個導入Pi1、Pi9和Pikh等抗稻瘟病基因的?；?73近等基因系，這些近等基因系及其與不育系宜香A配制的雜種一代均表現出對稻瘟病的抗性，且抗性明顯強于對照福恢673，半數以上雜種一代基本保留了原組合的主要優點［20］。呂軍等利用自主開發的香味基因fgr的功能標記與抗稻瘟病基因Pita的分子標記將這2個基因聚合到一起，篩選到4個綜合性狀優良的抗稻瘟病香稻新品系遼粳香 1～4號［21］。

為進一步深入研究當前水稻品種（品系）中稻瘟病抗性基因的組合特征，明析水稻種質資源的基因型，本研究利用Pita、Pi54、Pia、Pib、Pikm和Pikh共6個抗稻瘟病基因和1個恢復基因Rf1a的功能性分子標記，對94份水稻骨干種質和品系抗稻瘟病基因和恢復基因進行檢測與分析，旨在明確骨干材料的抗病基因型，為今后選育持久廣譜的抗稻瘟病品種及合理利用抗稻瘟病種質資源提供依據，為水稻恢復系MAS和定向創制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗稻瘟病基因檢測供試材料為48份水稻骨干材料，編號為J1～J48，其中J1～J19為已審定的品種，J20～J48為新鄉市農業科學院選育出的穩定品系（表1）；恢復基因檢測材料的編號為R1～R46，R1～R23為外引材料，R24～R46為新鄉市農業科學院選育出的恢復系品系（表2）。

1.2 水稻葉片DNA的提取

在水稻的分蘗期或拔節期，取新鮮劍葉作為試驗材料，分別裝在2 mL離心管中，放入加有冰袋的泡沫箱中密封，后存放在-80 ℃超低溫冰箱中。保存的鮮葉片現用現取，在液氮中充分研磨，隨后用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA。

1.3 SSR引物

本研究中的7對簡單重復序列（SSR）引物標記（表3）用于對48份粳稻材料的抗稻瘟病基因和46份材料恢復基因進行檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為10 μL，其中Mix 5 μL、F/R引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加3 μL水補齊。PCR擴增程序如下：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，53 ℃或55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min，12 ℃保溫。PCR擴增產物采用1%～2%瓊脂糖凝膠電泳，于180 V電泳30 min后用凝膠成像儀拍照記錄，將基因型條帶信息記錄在Excel中。

1.5 數據處理

基因型條帶信息用Excel 2016進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 抗稻瘟病基因和恢復基因檢測

本研究用6個抗稻瘟病基因（Pita、Pi54、Pia、Pib、Pikm、Pikh）對48份水稻骨干材料進行檢測，用1個恢復基因Rf1a對46份材料進行檢測（圖1）。通過分析48份水稻材料攜帶的抗稻瘟病基因數目，發現單份水稻材料攜帶4個抗稻瘟病基因的材料最多，有16份，占比為33.33%；其次為攜帶3、2個抗稻瘟病基因的材料，分別有11、9份，占比分別為22.92%、18.75%；攜帶6個抗稻瘟病基因的材料最少，有2份，占比為4.17%。從以上結果可知，同時攜帶3個以上抗稻瘟病基因的粳稻占70.84%（表4）。在引進和自育恢復系材料中，有4份材料不含Rf1a基因。

2.2 不同抗稻瘟病基因和恢復基因水稻骨干材料中的分布

通過對48份骨干材料中各個抗稻瘟病基因的檢出率進行分析， 發現這6個抗稻瘟病基因的檢出率為33.33%～77.08%，存在較大差異。其中，Pib的檢出率最高，攜帶該基因的材料有37份，檢出率為77.08%；其次是Pi54、Pikh，攜帶這2個基因的材料分別有30、31份，檢出率分別為62.50%、64.58%；攜帶Pita的材料有23份，檢出率為47.92%；攜帶Pikm的材料有20份，檢出率為41.67%；攜帶Pia的材料最少，有16份，檢出率為33.33%。通過對46份恢復系材料恢復基因Rf1a檢測結果進行分析，發現攜帶恢復基因Rf1a的材料有42份，恢復基因檢出率為93.48%（表5）。

2.3 48份水稻骨干親本抗稻瘟病基因的組合類型

通過對48份骨干材料的抗稻瘟病基因組合進行分析，發現48份材料中共有抗稻瘟病基因組合22個。其中，組合為Pia+Pi54+Pikh+Pib，Pi54+Pikh+Pib的材料最多，各有6份；其次組合為Pi54+Pikh+Pib+Pita、Pib+Pikm的材料，各有4份；組合為Pia+Pi54+Pikh+Pib+Pikm+Pita、Pi54+Pikh+Pib+Pikm+Pita、Pia+Pi54+Pikh+Pib+Pita、Pi54+Pikh+Pib+Pikm、Pia+Pi54+Pikh+Pikm、Pi54+Pikh+Pita、Pib+Pikm+Pita、Pib+Pita、Pib 、Pikm的材料各有2份；組合為Pia+Pikm+Pita+Pi54+Pikh、Pi54+Pikh+Pikm+Pita、Pia+Pib+Pikm+Pita、Pia+Pib+Pita、Pia+Pita、Pikm+Pita、Pikh+Pib、Pita的材料各有1份（表6）。

3 討論

稻瘟病是影響水稻生長最主要的真菌性疾病之一。稻瘟病菌具有快速變異的特點，育成品種的稻瘟病抗性很容易喪失［17］。黃淮稻麥兩熟區是我國糧食生產核心區，對于保障國家口糧安全有著至關重要的戰略地位。該區粳稻常年種植面積約為183.33萬hm2，是我國優質稻米主產區之一。然而，由于年際氣候不穩定，尤其是在粳稻抽穗灌漿期間經常遭遇高溫、低溫、陰雨寡照等多種災害性天氣，導致稻瘟病頻繁發生，稻米產量和品質下降。因此，利用抗稻瘟病分子標記檢測水稻材料中含有的抗稻瘟病基因類型和組合，對選育抗稻瘟病新品種具有重要參考價值。

本研究采用6個具有廣譜抗性的稻瘟病分子標記（Pia、Pi54、Pikh、Pib、Pita和Pikm）對水稻骨干材料進行分析。通過分子標記輔助育種手段，將不同類型廣譜抗稻瘟病基因聚合起來以增強抗病性，為水稻的抗病分子育種奠定基礎。在48份水稻材料中，Pi54、Pikh和Pib這3個基因的分布頻率達到50%以上，說明它們在骨干材料中的分布較為廣泛，可作為后續育種的抗病親本。而Pia、Pikm的分布頻率相對較低，需要在選育過程中加強對其利用以提高稻瘟病的廣譜抗性。在檢測的6個基因中，Pib基因所占比例最高，達到77.08%。Pib基因是首個被克隆的抗稻瘟病基因［23］，位于水稻第2染色體長臂近末端區域，與Pita基因有43.2%的相似性［24］。之前的研究也表明，Pib基因在不同的水稻品種中分布廣泛，如上海的22種常規粳稻和浙江的12個晚粳品種中均檢測到Pib基因［25-26］。Pi54、Pikh基因的分布比例也較高，達到65%左右，有研究表明，這2個基因是由同一個稻瘟病的病原菌開發的2個標記。有研究發現，含有Pikh基因的單基因系表現出了廣譜抗性，抗譜達到了89.6%［27］。因此可見，Pi54、Pikh基因的利用也應受到重視，以提高水稻的抗病性。

在48份水稻材料中，有2份材料攜帶6個抗稻瘟病基因，有5份材料攜帶5個抗稻瘟病基因，16份材料攜帶4個基因，11份材料攜帶3個基因，9份材料攜帶2個基因，5份材料攜帶1個基因。通過篩選，共得到42份攜帶Rf1a恢復基因的材料，將這些攜帶多個抗病基因和恢復基因的材料結合，可以提高抗性并增強花粉育性，達到基因聚合的效果。Jiang等利用9個稻瘟病抗性基因（Pi37/Pit/Pid3/Pigm/Pi36/Pi5/Pi54/Pikm/Pib）對不育系Y58S、廣占63S、C815S和HD9802S進行改良，得到31個單基因衍生系和20個雙基因組合系［28］。Xiao等通過MAS，將2個抗性基因Pi46、Pita以及影響水稻胚芽直鏈淀粉含量（AC）的基因Wxb導入稻瘟病抗性弱、籽粒品質差的秈稻恢復系R8166中，得到了R163、R167這2個改良品系及其衍生雜交種，籽粒直鏈淀粉含量、膠稠度、堊白粒率和堊白度等品質性狀都得到改善［29］。黃乾龍等分析了重慶地區73個水稻骨干種質的稻瘟病抗性，結果顯示，攜帶3～4個抗稻瘟病基因的水稻材料的抗病率都能達到100%，表明聚合抗稻瘟病基因能夠顯著提高水稻的抗病性［30］。在本研究中，70%以上的材料攜帶3個及以上抗病基因，這類材料可以作為育種工作中的骨干親本，同時根據不同基因之間的組合，可以有目的地將這類粳稻材料作為育種材料進行改良，并建立資源庫。

本試驗只針對6個稻瘟病抗性基因的分布情況進行了檢測和分析，但是在田間，水稻品種的具體抗病表現是由多種因素共同作用的結果，這些因素包括水稻品種特性、種植環境、致病菌株的多樣性、聚合基因的表達、抗稻瘟病基因的防治等級及其他未知因素。

4 結論

本研究利用6個抗稻瘟病分子標記（Pia、Pi54、Pikh、Pib、Pita和Pikm）和1個恢復基因（Rf1a），明確了48個水稻新品系攜帶的抗稻瘟病基因類型和46份恢復系材料的恢復基因。但是，這些品系的實際稻瘟病抗性需要進一步結合田間試驗進行驗證。

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