生地百合西洋參膠囊對小鼠睡眠的促進作用及其安全性研究

趙雨杰 , 傅容湛 , 郭佳琦 , 朱晨輝

(1. 西北大學化工學院 西北大學生物醫(yī)藥研究院 , 陜西 西安 710069 ; 2. 陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗院 , 陜西 咸陽 712046)

據(jù)統(tǒng)計,成年人中慢性失眠患者占10%～15%,偶爾失眠的人占25%～35%[1]。老年人和婦女是失眠的主要人群,除了原發(fā)性失眠癥,共病性睡眠障礙也較常見,失眠不僅會影響日常工作,更會影響人體的健康,導致其他疾病的產(chǎn)生[2-3]。目前,治療失眠的藥物主要是化學合成的鎮(zhèn)靜類藥物,這些藥物不僅副作用大,長期服用還會產(chǎn)生藥物依賴[4-5]。

中醫(yī)治療失眠歷史悠久,組方百合地黃湯的應用也較為廣泛,百合地黃湯最早記載于《金匱要略》[6],由7枚百合和1 L生地黃汁組成,適用于由心肺陰虛血燥、百脈失和導致的疾病,如不寐和郁癥等。目前,百合地黃湯被廣泛用于治療多種疾病,如抑郁癥、焦慮癥、圍絕經(jīng)期綜合征和失眠癥等,且其在治療失眠和安神方面具有良好的功效[7-9]。百合具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效,適用于虛煩驚悸、失眠多夢和精神恍惚等癥狀[10]。百合中所含的百合皂苷具有鎮(zhèn)靜催眠的作用,能縮短入睡時間,提高睡眠質(zhì)量[11]; 其中的百合多糖和百合皂苷還具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和免疫調(diào)節(jié)的作用[12]。生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效,可清心火、滋腎陰[13]。生地黃中所含的苷類、氨基酸類、糖類和有機酸類物質(zhì)具有抗腫瘤、降血糖、抗衰老和降血糖的功效[14]。西洋參具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效,其所含的人參皂苷具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、鎮(zhèn)靜和神經(jīng)保護等作用[15]。

生地百合西洋參膠囊是由百合提取物、生地黃提取物和西洋參提取物為原料制備而成的,本試驗根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[16]對其改善睡眠的功能進行評價,并通過小鼠急性毒性試驗和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗判定其安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品與主要試劑 生地百合西洋參膠囊(其中原料生地黃提取物、百合提取物和西洋參提取物均為水提物,且其提取率分別為20%、10%和16%),規(guī)格為0.4 g/粒(每粒含生地黃提取物0.23 g、百合提取物0.08 g、西洋參提取物0.07 g,其余為淀粉和硬脂酸鎂),由某生物公司提供;戊巴比妥鈉(純度>99%),購自美國Sigma公司;小鼠5羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和多巴胺(Dopamine,DA)酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,均購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級昆明小鼠,雄性130只,雌性10只,體重為18～22 g,購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2018—001];80只SD大鼠,雌雄各半,體重為80～100 g,購于中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2019—001]。

1.3 主要儀器 RS-7010秒表(深圳市銳賽科技有限公司);電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];HC海邁血液測試系統(tǒng)(山東美醫(yī)林電子儀器有限公司);全自動生化分析儀(博士泰生物科技有限公司);TGL-20臺式高速離心機(山東百歐醫(yī)療科技有限公司);酶標儀(BioTek 伯騰公司)。

1.4 小鼠睡眠試驗

1.4.1 劑量選擇[17]生地百合西洋參膠囊的成人推薦服用量為2 次/d,3粒/次(相當于每天服用生藥量百合5 g、生地黃7 g、西洋參2.5 g),按成人體重為60 kg計算,使用劑量為40 mg/(kg·bw),根據(jù)人體推薦劑量的5、10和20倍計算小鼠生地百合西洋參膠囊低、中、高劑量組給藥劑量分別為每天200、400和800 mg/(kg·bw),對照組給予等量蒸餾水,每組30只雄性小鼠,連續(xù)灌胃給藥30 d。

1.4.2 直接誘導睡眠試驗 將小鼠置于背臥位時,其能立即翻正身位。末次給藥結(jié)束后,每組隨機選取10只小鼠,以翻正反射消失為睡眠指標,如果超過50 s不能翻正則認為翻正反射消失,小鼠進入睡眠;翻正反射恢復即為小鼠覺醒,翻正反射消失至恢復的這段時間為睡眠時間,記錄各組小鼠入睡只數(shù)和睡眠時間。

1.4.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗 預試驗確定戊巴比妥鈉的使用劑量為45 mg/(kg·bw),將1.4.2中各組小鼠在末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液,記錄各組小鼠在給予戊巴比妥鈉后的睡眠時間。

1.4.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗 預試驗確定戊巴比妥鈉閾下劑量為25 mg/(kg·bw),從1.4.1中各組各隨機選取10只小鼠,末次給藥20 min后腹腔注射戊巴比妥鈉閾下劑量,記錄各組小鼠在給予戊巴比妥鈉30 min后的入睡只數(shù)。

1.4.5 小鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定 從1.4.1中各組各隨機選取10只小鼠,在末次灌胃后處死小鼠,立即取出其腦組織,用生理鹽水清洗后,按照ELISA試劑盒說明書操作分別測定小鼠腦組織中5-HT、GABA和DA的含量。

1.5 小鼠急性毒性試驗 隨機選取20只小鼠(雌雄各半),采用最大給藥劑量試驗法(Maximum tolerated dose,MTD),按照15 g/(kg·bw)劑量對小鼠進行灌胃給藥,2 次/d,2次灌胃間隔時間為4 h,連續(xù)灌胃14 d,分別在第0、7、14天稱量小鼠體重,觀察并記錄小鼠死亡情況。

1.6 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗 將80只SD大鼠隨機分為4個組,每組20只。生地百合西洋參膠囊低[1 g/(kg·bw)]、中[2 g/(kg·bw)]和高[4 g/(kg·bw)]劑量組的給藥劑量相當于人體推薦劑量的25、50和100倍,對照組給予等量蒸餾水。連續(xù)灌胃給藥30 d。每天觀察大鼠的日常活動情況,記錄體重和進食量,計算食物利用率。試驗結(jié)束后處死大鼠,檢測其血常規(guī)指標,稱量并記錄肝臟、腎臟和脾臟的重量,計算臟器系數(shù)。

1.7 統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果以“平均值±標準差(Mean±SD)”方式表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 生地百合西洋參膠囊的直接睡眠作用 給予小鼠不同劑量生地百合西洋參膠囊30 d后,小鼠均未出現(xiàn)翻正反射消失的現(xiàn)象,表明生地百合西洋參膠囊對小鼠沒有直接誘導睡眠的作用。

2.2 生地百合西洋參膠囊對戊巴比妥鈉睡眠時間的影響 如表1所示,與對照組相比,生地百合西洋參膠囊高、中、低劑量組小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時間分別延長55.29%、46.29%和23.26%,差異均具有顯著性(P<0.05或P<0.01),且隨著生地百合西洋參膠囊劑量的增加,戊巴比妥鈉睡眠時間的延長率也隨之增加,表明生地百合西洋參膠囊能延長戊巴比妥鈉睡眠時間。

表1 生地百合西洋參膠囊對戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

2.3 生地百合西洋參膠囊對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響 如表2所示,與對照組相比,生地百合西洋參膠囊各劑量組小鼠的催眠入睡率均有所提高,其中,中、高劑量組與對照組的差異均具有顯著性(P<0.05或P<0.01),表明生地百合西洋參膠囊可以提高戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠的入睡率。

表2 生地百合西洋參膠囊對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

2.4 生地百合西洋參膠囊對小鼠腦組織中5-HT、GABA和DA含量的影響 如表3所示,與對照組相比,生地百合西洋參膠囊各劑量組小鼠腦組織中5-HT含量增高,其中,中、高劑量組與對照組的差異均具有顯著性(P<0.05);生地百合西洋參膠囊各劑量組GABA含量均升高,其中,中、高劑量組與對照組的差異均具有顯著性(P<0.05或P<0.01);生地百合西洋參膠囊各劑量組DA含量均有所降低,其中高劑量組與對照組的差異具有顯著性(P<0.05)。

表3 生地百合西洋參膠囊對小鼠腦組織中5-HT、GABA和DA含量的影響

2.5 生地百合西洋參膠囊小鼠急性毒性試驗 如表4所示,生地百合西洋參膠囊連續(xù)灌胃14 d,小鼠均未出現(xiàn)死亡和中毒現(xiàn)象,表明生地百合西洋參膠囊對小鼠的急性經(jīng)口最大耐受劑量大于15 g/(kg·bw),屬無毒級。

表4 生地百合西洋參膠囊小鼠急性毒性試驗結(jié)果

2.6 生地百合西洋參膠囊大鼠30 d喂養(yǎng)試驗 在連續(xù)30 d灌胃不同劑量生地百合西洋參膠囊期間,大鼠均無不良反應,生長發(fā)育正常。喂養(yǎng)30 d后,與對照組相比,各劑量組大鼠體重增長量、進食量、食物利用率、血常規(guī)指標、血液生化指標和臟器系數(shù)均無顯著性差異(P>0.05),表明生地百合西洋參膠囊安全性良好。

3 討論

中醫(yī)理論認為不寐即失眠,主要是由臟腑失和及體內(nèi)陰陽失衡導致心神不安的疾病所致[18]。陰虛火旺是失眠常見的原因之一,隨著社會壓力的增大,熬夜時有發(fā)生,長期熬夜、壓力倍增和情志太過都會耗傷陰液,導致陰虛火旺、神亂不寐[19]。張忠等[20]使用百合地黃湯,以百合和地黃為主藥進行加減,治療由陰虛火旺所致的失眠癥,結(jié)果顯示,患者陰復熱退、神安而寐,臨床有效率達93.75%。《金匱要略》[6]中記載的百合地黃湯能有效治療精神和飲食導致的睡眠失調(diào),目前多通過百合地黃聯(lián)用其他方法治療失眠。利順欣[21]利用百合地黃湯合酸棗仁湯加味治療老年失眠,總有效率達94.4%。褚雪菲等[22]采用四逆散合百合地黃湯加減方治療焦慮性失眠,證明其具有疏肝解郁、清心安神的作用,可改善患者的睡眠和焦慮狀態(tài)。張慧等[23]將百合地黃湯和鎮(zhèn)靜安神針法聯(lián)合使用治療女性圍絕經(jīng)期失眠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方法能提高患者的睡眠質(zhì)量,且不易產(chǎn)生藥物依賴,無不良反應,同樣說明了百合和地黃具有改善睡眠的功效。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括5-HT和DA,與失眠、焦慮和抑郁等密切相關(guān)[24]。研究發(fā)現(xiàn),5-HT含量的增加可以改善失眠癥狀[25]。張萍等[26]研究表明,百合地黃湯發(fā)揮作用是通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的表達,百合地黃湯能顯著提高大鼠大腦中5-HT的含量,與本試驗中生地百合西洋參膠囊各劑量組小鼠腦組織中5-HT的含量均有所增高的結(jié)果一致。DA對人體情緒和睡眠的調(diào)節(jié)有重要作用,DA含量過多或過少都會導致睡眠問題的發(fā)生[27]。本試驗中生地百合西洋參膠囊各劑量組小鼠腦組織中的DA含量均有所降低,與鄭竹宏等[28]關(guān)于百合地黃湯對失眠模型大鼠腦組織中DA的影響結(jié)果一致。GABA是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),對神經(jīng)元的興奮程度有重要的影響,是神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)抑制劑[29]。研究發(fā)現(xiàn),失眠患者中樞神經(jīng)中的GABA含量顯著降低[30]。本試驗中生地百合西洋參膠囊各劑量組的GABA含量均不同程度的升高。康心茹等[31]研究也顯示,百合提取物可有效增加小鼠腦組織中GABA含量,與本試驗結(jié)果一致。這些研究均表明,百合地黃西洋參膠囊改善睡眠可能是通過調(diào)節(jié)腦組織中5-HT、DA和GABA的含量。

百合具有清心安神的功效,其作用機制可能與促進單胺類神經(jīng)遞質(zhì)以及抑制其氧化酶活性相關(guān),可以改善失眠癥狀[32]。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn),百合的鎮(zhèn)靜催眠作用可能與百合中所含的總皂苷和薯蕷皂苷有關(guān)。郭秋平等[34]研究也證明,百合皂苷對大鼠腦內(nèi)DA和5-HT的紊亂具有改善作用。研究顯示,生地黃中的烯醚萜類和黃酮類等化合物能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì),適用于各種原因?qū)е碌氖遊35-36]。西洋參具有滋補、養(yǎng)陰和安神的功效,其所含的多種人參皂苷能發(fā)揮多種生物學功能,其中,人參皂苷Rb1具有改善睡眠的作用[37]。西洋參中的主要有效成分人參皂苷可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng),總皂苷能抑制中樞神經(jīng)以達到鎮(zhèn)靜的作用[38]。本試驗中的生地百合西洋參膠囊在百合和生地黃的基礎上添加西洋參,不僅能達到鎮(zhèn)靜、安神的作用,還能達到治療陰虛內(nèi)熱、補氣養(yǎng)陰的功效。

本試驗根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[16]中的改善睡眠功能評價方法,通過給小鼠灌服不同劑量生地百合西洋參膠囊進行直接誘導睡眠試驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗和戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗,證明了生地百合西洋參膠囊具有改善睡眠的作用。進一步對小鼠腦組織中5-HT、GABA和DA含量進行檢測,發(fā)現(xiàn)該膠囊改善小鼠睡眠作用的機制可能是通過調(diào)節(jié)小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT、GABA和DA)的含量。最后通過小鼠急性毒性試驗和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗,證實生地百合西洋參膠囊對小鼠無急性毒性,對大鼠無毒副作用,說明該產(chǎn)品在本試驗劑量范圍內(nèi)無毒性。本試驗為生地百合西洋膠囊在保健食品和功能食品中的應用提供了參考,但關(guān)于百合、地黃和西洋參各自改善睡眠的作用機制尚不清楚,還需進一步研究。