馬紅球菌病的初步診斷和治療

余萬里 , 馬玉輝 , 王彥峰 , 馬思遠 , 劉 璐 , 劉來珍 , 蔡 濤 , 趙紅瓊

(1.新疆農業大學動物醫學學院 , 新疆 烏魯木齊 830052 ; 2.新疆巴州動物疾病控制與診斷中心 , 新疆 巴州 841000 ; 3. 新疆昭蘇縣畜牧獸醫發展中心 , 新疆 伊犁 835600 ; 4.新疆農業職業技術學院 , 新疆 昌吉 831100)

馬紅球菌病,又稱馬化膿性支氣管肺炎,主要發生于1～6月齡馬駒,呈全球范圍分布[1-3]。該病發病率可達40%,死亡率高達80%,是引起馬駒致病和死亡的重要因素之一,嚴重制約了馬產業的發展,并造成巨大的經濟損失[4]。該病病原馬紅球菌(Rhodococcusequi,R.equi)是一種常見的土壤腐生菌,馬駒主要通過吸入塵土中的R.equi而感染[5]。R.equi不僅感染馬,也可感染豬、牛和羊等其他動物,還能感染免疫功能低下的人[6-9]。產生膽固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,ChoE)是R.equi的一個決定性特征,利用特定的引物和程序擴增choE基因可以鑒定是否為R.equi,擴增編碼15～17 kDa毒力蛋白上的vapA基因可以鑒定致病性與非致病性R.equi[2]。本試驗對4匹疑似感染馬紅球菌的馬駒進行臨床檢查并采集肛拭子進行菌落PCR鑒定,以期為獸醫臨床馬紅球菌病的診斷和治療提供參考。

1 病例情況

1.1 基本信息 2021年7月29日于新疆某馬場接診4匹患駒,均為2～4月齡英純血馬,體重分別為174.0、136.5、151.3和148.5 kg。

1.2 病史 4匹患駒在出生后2周內均有咳嗽癥狀,在2月齡左右出現較為嚴重的呼吸道疾病,通過青霉素和阿莫西林等抗生素治療1個月均無效;病例1患駒在3月齡時,左后腿因為刮傷,形成一個外傷開放創,每天注射青霉素。

2 臨床檢查

4匹患駒均可見鼻孔處有黃色膿性鼻液,呼吸急促,有輕微咳嗽,觸摸體表溫度偏高,且病例4患駒伴有腹式呼吸。4匹患駒體溫和呼吸頻率均偏高,脈搏均在正常范圍內(表1)。

表1 患駒臨床檢查結果

3 實驗室檢查

3.1 血常規和血清生化檢查 用含EDTA-K2的抗凝管采集患駒頸靜脈血,并用全自動血液細胞分析儀(Mindray,BC-5000VET)檢測血常規指標。用非抗凝管采集患駒頸靜脈血,分離血清,用全自動生化儀(Mindray,BS-240VET)檢測血清生化指標。結果顯示,4匹患駒白細胞(White blood cell,WBC)、中性粒細胞(Neutrophil,Neu)和淋巴細胞(Lymphocyte,Lym)數量均升高(表2),病例2、3和4患駒的紅細胞(Red blood cell,RBC)數量均升高。病例1、3和4患駒的血糖(Glucose,GLU)、谷丙轉氨酶(Alanine transaminase,ALT)和血清總蛋白(Total protein,TP)含量均下降;病例1和4患駒的白蛋白(Albumin,ALB)含量均下降;4匹患駒的血清肌酐(Creatinine,CREA)含量均下降(表3)。

表2 治療前患駒血常規異常指標

表3 治療前患駒血清生化異常指標

3.2 細菌分離和鑒別培養 患駒肛拭子置于腦心浸液瓊脂培養液(Brain-heart infusion broth,BHI),后接種于NANAT(Nalidixic acid-novobiocin-actidione-potassium tellurite)鑒別培養基[5],30 ℃恒溫培養48 h,觀察生長菌落的形態并進行革蘭染色。結果顯示,在NANAT鑒別培養基上有形態呈灰黑色、黏稠樣菌落(圖1A);革蘭染色結果為革蘭陽性菌,在顯微鏡下觀察到多數菌體呈兩頭鈍圓的球桿狀或棒狀,僅有少數菌體呈卵圓形、球狀、分枝形和柵欄樣排列,菌體沒有芽孢(圖1B)。

圖1 菌落形態鑒定

3.3R.equi的PCR鑒定 用細菌DNA提取試劑盒(全式金,EE61-01)提取NANAT鑒別培養基上生長的菌株的DNA進行PCR檢測。參考菌株致病性R.equi103+(choE陽性,vapA陽性)為陽性對照,非致病性R.equi103-(choE陽性,vapA陰性)為陰性對照,均獲贈于寧夏大學生命科學學院羅海霞教授。引物序列如表4所示,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR退火溫度為55 ℃,30個循環。PCR擴增后,取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(Bio-Rad,ChemiDoc XRS+)上觀察條帶位置。結果顯示,R.equi103+、R.equi103-和來自病例1～4 患駒的分離菌株均擴增出choEDNA片段,且大小符合預期960 bp;R.equi103+和病例1～4患駒的分離菌株擴均增出vapADNA片段,大小符合預期550 bp(圖2),初步判斷這4匹患駒均感染致病性R.equi。

圖2 分離菌株的PCR鑒定

表4 vapA和choE的PCR引物序列

3.4 病例4患駒胸部B超檢查 由于病例4患駒病情嚴重,使用B超對其第6肋間進行超聲檢查。結果顯示,患駒肺部左側有實質性陰影(圖3)。

圖3 病例4患駒胸部B超

4 診斷

4匹患駒均出現黃色膿性鼻液,呼吸急促、困難,體溫升高,支氣管和肺部聽診濕羅音,食欲減退等疑似馬紅球菌病臨床癥狀,結合血常規、血清生化指標和PCR等實驗室檢測結果,初步診斷均為馬紅球菌病。

5 治療和轉歸

5.1 治療方法 口服利福平5 mg/(kg·bw)和一種大環內酯類藥物,包括克拉霉素7.5 mg/(kg·bw)、阿奇霉素10 mg/(kg·bw)或紅霉素25 mg/(kg·bw),2次/ d,連用5 d,休藥3 d;之后再開啟一個同樣療程,只是每匹患駒更換成與之前不同的一種大環內酯類藥物,以期降低細菌耐藥性。

5.2 轉歸 病例1和3患駒治療1個月后,食欲、精神狀態、呼吸、血常規和血清生化指標均恢復正常。病例2患駒治療1個月后,食欲、精神狀態、血常規和血清生化指標均恢復正常,但休藥期階段聽診仍有支氣管音,患駒尚未完全恢復,需要繼續接受治療。病例4患駒在治療過程中病情加重,在治療第8天死亡。對病例4患駒剖檢后用生理鹽水沖洗肺部,抽取沖洗液進行細菌培養和PCR鑒定,結果為choE和vapA陽性,存在致病性R.equi。同時發現該患駒肺部有膿腫病變,與B超檢查結果一致(圖4)。用4%多聚甲醛固定患駒肺部組織,進行組織病理學檢查發現,肺部毛細血管明顯擴張充血,肺泡形態基本消失,部分組織細胞壞死,壞死細胞內出現大量細胞色素沉著(圖5A),中性粒細胞浸潤(圖5B)。

圖4 病例4患駒肺部解剖圖

圖5 病例4患駒肺部病理學檢查(H.E.染色)

6 討論

幼齡馬駒由于免疫系統發育尚未成熟,因此極易受到外界各種病原侵害,尤其是呼吸系統。馬駒易患的呼吸系統疾病主要是肺炎,常見的細菌性病原有R.equi和獸疫鏈球菌,革蘭陰性菌在呼吸道疾病中也常見[10-11]。本試驗中4例患駒的臨床表現均以呼吸道癥狀為主,與其他研究中馬紅球菌病的臨床癥狀具有一致性。

R.equi廣泛存在于土壤和空氣環境中,可通過呼吸道傳播,通常馬駒在出生后1周內易感染該菌,但不會表現出臨床癥狀,待馬駒成長到2月齡后,如若馬駒感染的R.equi帶有vapA毒力基因,則會迅速致病[12]。該病常見于2～6月齡的馬駒,但也有報道顯示最早可影響1月齡的馬駒[10]。該病呈急性暴發,患駒表現為精神沉郁、嗜睡和食欲減退等[13],主要臨床表現為急性發熱、呼吸困難、咳嗽和鼻腔有膿性分泌物等;血液學檢查可見患駒白細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞嚴重增多[14]。感染R.equi后,患駒上呼吸道和肺部形成膿腫,肺實質區域內形成結節灶,可以通過超聲和內窺鏡等檢查觀察到膿腫情況。肺部嚴重感染的患駒,可能會造成呼吸衰竭,如果該菌蔓延至身體其他部位,如腹腔、關節或骨髓,則會造成預后不良[15]。

白麗鴿等和Giguere等研究表明,目前尚無更好治療馬紅球菌病的特效藥,依舊建議使用紅霉素、克拉霉素或阿奇霉素與利福平聯合用藥治療馬紅球菌病[11,16]。但長期使用大環內酯類親脂類抗生素治療馬紅球菌感染會導致R.equi產生耐藥性。因此,本試驗在治療馬紅球菌病時考慮到長時間使用同一種藥或兩種以上的藥物會導致R.equi產生耐藥性,從而選擇交替用藥。大環內酯類藥物可引起成年馬匹腸道菌群的紊亂,更嚴重會造成成年馬患結腸炎。馬駒出現發熱癥狀可配合使用非甾體類抗炎藥,當患駒肺部嚴重感染影響呼吸時應及時吸氧,同時配合使用氣管擴張劑。因此當馬駒感染R.equi后,需將其隔離,以防其他馬匹通過接觸糞便感染。研究表明,利福平和大環內酯類藥物聯合用藥,會引起17%～36%患駒腹瀉,一般腹瀉會自愈,不影響給藥治療,若患駒發生嚴重腹瀉導致脫水和電解質紊亂,需要停止給藥,更改治療方案[16-21]。應注意的是,患駒在給藥治療的前5 d,給藥時間應間隔至少1 h,以提高大環內酯類藥物的吸收率。

Muscatello等研究發現,酸性的土壤可能是導致致病性R.equi含量上升的因素[3],Hughes等研究發現,馬糞中的簡單有機酸對R.equi的生長具有促進作用,因此在含有馬糞的土壤中更有利于R.equi的繁殖[22]。本試驗中病例3患駒在2月齡前體征正常,病例2患駒在3月齡前出現輕微咳嗽,有嚴重的支氣管音等癥狀,疑似感染馬紅球菌。當時由于圈舍緊張的原因,2匹患駒飼養在同一個馬廄,1周后病例3患駒出現同樣癥狀,推測病例3患駒通過接觸病例2患駒導致其感染,但具體發病機制有待進一步研究。食物的攝取對機體營養狀態和健康水平有著直接影響,劉海港等研究發現,在動物生命過程中,日糧營養在抵抗各種應激和疾病免疫機能方面發揮重要作用[23]。潘曉花等研究發現,營養物質和能量代謝是維持免疫細胞活性和功能的重要基礎[24]。在本試驗中,通過血清生化檢測發現患駒處于營養不良狀態,因此抵抗病原的能力有所下降。

本試驗病例2患駒在治療過程中病情出現好轉,但是停止用藥后,又出現呼吸急促癥狀,聽診肺部有支氣管音,考慮到可能是R.equi與其他病原菌的混合感染或者治療并未完全清除R.equi,應根據實際情況再對癥治療。

R.equi廣泛存在于土壤環境和空氣中,可以通過呼吸道傳播[5]。因此,建議加強馬圈舍的飼養管理,增加馬廄清理和消毒頻次;保持圈舍內通風;對初步診斷為馬紅球菌病的患駒應單獨隔離,避免出現交叉感染,危害到健康馬匹;增加幼駒營養,以提高自身免疫水平,使幼駒處于免疫機能最佳的狀態。