組分差異分析結(jié)合智能感官對(duì)本草栽培銀耳風(fēng)味特征的分析

陳萬(wàn)超

吳 迪1,2,3

肖敏生4

姚淑先5

楊 焱1,2,3

劉艷芳1,2,3

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201403;3. 國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201403;4. 上海開(kāi)森生物科技有限公司,上海 201824;5. 福建山湖本草銀耳有限公司,福建 寧德 352262)

銀耳,又稱(chēng)白木耳、雪耳等,屬于擔(dān)子菌門(mén)、銀耳綱、銀耳目、銀耳科、銀耳屬,是一種常見(jiàn)的食藥兩用真菌。

中國(guó)銀耳栽培分布主要是福建、四川等地,其中福建古田銀耳歷史悠久,產(chǎn)量占全球90%以上[1]。福建古田代料栽培銀耳普遍為黃色銀耳(Tr01)和白色銀耳(Tr21)[1],栽培基質(zhì)主要采用棉籽殼、麥麩等。除此之外,亦存在以傳統(tǒng)植物本草為基質(zhì)的栽培技術(shù),目前研究主要集中在栽培設(shè)施設(shè)備的開(kāi)發(fā),關(guān)于本草基質(zhì)對(duì)銀耳子實(shí)體的品質(zhì)影響的研究鮮有報(bào)道。本草基質(zhì)栽培銀耳所選用的栽培品種為白色銀耳,旨在彌補(bǔ)銀耳的營(yíng)養(yǎng)缺陷,如粗多糖含量較低,對(duì)人體的滋補(bǔ)效果不明顯等[2]。對(duì)于飲食習(xí)慣,大眾消費(fèi)的主要以黃色銀耳為主,其肉質(zhì)脆爽,常作為拌菜的食材,而對(duì)于白色銀耳的食用習(xí)慣并未建立,其內(nèi)在原因值得進(jìn)一步挖掘。研究擬以常規(guī)栽培基質(zhì)的黃色銀耳和白色銀耳為參考,傳統(tǒng)植物本草為基質(zhì)的白色銀耳為研究對(duì)象,通過(guò)高效液相色譜技術(shù)和頂空固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)對(duì)3種銀耳中主要的滋味成分(游離氨基酸和核苷酸)進(jìn)行測(cè)定,基于這些組分的差異分析結(jié)合智能感官(如電子舌和電子鼻)探究3種銀耳的風(fēng)味特征,以期為銀耳作為食材用于烹飪提供理論支撐,同時(shí)為本草栽培銀耳的高值利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃色銀耳、白色銀耳和本草基質(zhì)栽培白色銀耳(本草銀耳):其鮮品銀耳子實(shí)體均于2022年11月產(chǎn)自福建古田,上海開(kāi)森生物科技有限公司;

粉碎機(jī):QE-400型,浙江屹立工貿(mào)有限公司;

水分測(cè)定儀:MA100型,德國(guó)Sartorius公司;

離心機(jī):Allegra 25R Centrifuge型,美國(guó)Beckman公司;

超純水設(shè)備:ELGA型,美國(guó)ULTRA公司;

液相色譜:Waters E2695 Alliance型,美國(guó)Waters公司;

高效液相色譜儀:Waters 600型,美國(guó)Waters公司;

二極管陣列檢測(cè)器:2996型,美國(guó)Waters公司;

味覺(jué)分析系統(tǒng):SA-402B型,日本INSENT公司;

氣質(zhì)聯(lián)用儀:7890A-5975C型,安捷倫科技(上海)有限公司;

電子鼻:PEN2型,德國(guó)Airsense公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 游離氨基酸測(cè)定 參考Boogers等[3]的方法,準(zhǔn)確稱(chēng)取銀耳樣品500 mg于50 mL離心管,加入20 mL超純水,沸水浴加熱提取10 min(每5 min混勻一次),趁熱抽濾,冷至室溫后定容至50 mL,過(guò)0.22 μm混合纖維素微孔濾膜,備用。樣品衍生化:分別準(zhǔn)確吸取20 μL樣品溶液于衍生管(6 mm×50 mm),加入140 μL硼酸鹽緩沖液,渦旋混勻后加入40 μL衍生劑。室溫放置1 min,55 ℃下加熱10 min,取出待測(cè)。液相測(cè)定條件與陳榮榮等[4]的方法相同。

1.2.2 游離5′-核苷酸測(cè)定 參考陳萬(wàn)超等[5]的檢測(cè)方法,準(zhǔn)確稱(chēng)取銀耳樣品1 000 mg,加入25 mL蒸餾水,煮沸并保持1 min,冷卻至室溫,16 000×g離心15 min,取出上清液,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,待測(cè)。色譜條件:Ultimate AQ -C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:KH2PO4緩沖鹽(pH 4.68);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm。

1.2.3 揮發(fā)性香氣成分HS-SPME-GC-MS測(cè)定 參考李文等[6]的分析和數(shù)據(jù)處理方法,略有修改,采用頂空固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)進(jìn)行測(cè)定,準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g,置于20 mL頂空瓶中,加入5 mL水和10 μL二氯苯(內(nèi)標(biāo)物,100 μg/mL)迅速混勻待測(cè)。頂空瓶置于55 ℃條件平衡30 min,將75 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭經(jīng)30 ℃老化20 min 后插入頂空瓶中,平衡吸附30 min,后立即將纖維萃取頭抽出并轉(zhuǎn)移到GC-MS進(jìn)樣口中,推出萃取頭中的纖維頭,在250 ℃下解吸10 min。

1.2.4 電子舌分析 采用SA-402B味覺(jué)分析系統(tǒng)對(duì)離心后的酶解液進(jìn)行測(cè)定。該裝置具有8個(gè)傳感器,分別為CA0(酸味)、C00(苦味)、CT0(咸味)、AAE(鮮味)、AE1(澀味)、甜味(GL1)和2個(gè)參比傳感器。在樣品測(cè)試前,提前將傳感器活化并進(jìn)行自檢,待各傳感器數(shù)值穩(wěn)定在允許范圍內(nèi),即CA0和AAE為-80～80 V,CT0 90～130 V,C00和AE1 80～160 V,方可進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)置:測(cè)定5次,正負(fù)極清洗90 s,標(biāo)準(zhǔn)清洗液2和3均清洗120 s,參比液(30 mmol/L 氯化鉀+0.3 mmol/L 酒石酸)測(cè)定30 s,靜止1 s,樣品測(cè)定30 s,標(biāo)準(zhǔn)清洗液4和5分別清洗3 s,參比液(30 mmol/L 氯化鉀+0.3 mmol/L 酒石酸)測(cè)定30 s。

1.2.5 電子鼻分析 采用直接頂空吸氣法,稱(chēng)取1.0 g樣品置于20 mL頂空瓶?jī)?nèi),用帶有PTFE密封墊的蓋子密封,靜止10 min待測(cè)。以潔凈干燥空氣為載氣,設(shè)置電子鼻采樣時(shí)間為160 s,氣體流量為0.3 L/min,等待時(shí)間為10 s,清洗時(shí)間60 s。每個(gè)樣品重復(fù)6次,取穩(wěn)定后的3次數(shù)據(jù),進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

表1 電子鼻傳感器陣列名稱(chēng)及其性能描述

1.2.6 等鮮濃度值計(jì)算 等鮮濃度值(equivalent umami concentration,EUC)是指100 g干樣品中,呈鮮物質(zhì)的總量,常用谷氨酸鈉(monosodium glutamate,MSG)的含量表示[7]。其計(jì)算公式為:

Y=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj),

(1)

式中:

Y——味精當(dāng)量即EUC值,g MSG/100 g;

ai——呈鮮氨基酸的含量,如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),g/100 g;

aj——呈鮮核苷酸的含量,如鳥(niǎo)苷酸(5′-GMP)、肌苷酸(5′-IMP)、黃苷酸(5′-XMP)和腺苷酸(5′-AMP),g/100 g;

bi——呈鮮氨基酸相對(duì)MSG的鮮味程度(Glu為1,Asp為0.077);

bj——呈味核苷酸相對(duì)5′-IMP的值(5′-IMP為1,5′-GMP為2.3,5′-XMP為0.61,5′-AMP為0.18);

1 218——協(xié)同作用常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Matlab 2020b,生科云(https://www.bioincloud.tech/)信息分析云平臺(tái)和TBtools等工具進(jìn)行可視化繪圖。利用Excel 2019和IBM SPSS Statistic 25進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理,數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用Tukey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(顯著水平P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀耳樣品滋味組分分析

食用菌以鮮香美味著稱(chēng),其中鮮味的重要載體包括Asp、Glu等游離氨基酸,以及5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP等游離5′-核苷酸。如表2所示,從氨基酸組成看,3種銀耳樣品氨基酸種類(lèi)存在一定差異,其中半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)均未檢出,甲硫氨酸(Met)僅在黃色銀耳中有檢出,賴(lài)氨酸(Lys)和異亮氨酸(Ile)則分別在白色銀耳和黃色銀耳中未檢出。在含量層面,白銀耳的游離氨基酸總量相對(duì)最高(8.33 mg/g),其次為普通銀耳(7.69 mg/g),本草銀耳的最低(7.37 mg/g);3種銀耳中均以精氨酸(Arg,1.51～2.52 mg/g)和Glu(1.03～2.12 mg/g)含量較高,前者具有良好的清除自由基延緩衰老的功效[8],后者可以提高鮮美的口感。對(duì)于呈味氨基酸,鮮味氨基酸和甜味氨基酸主要以Glu和甘氨酸(Gly,0.42～0.43 mg/g)為主,前者以普通銀耳的最高,比本草銀耳和白色銀耳分別高出42.3%和105.8%,由此可見(jiàn)黃色銀耳樣品鮮味較為濃郁,白色銀耳品種本身鮮味較淡;后者在3種樣品中差異不顯著(P<0.5),即甘甜味差異不大。

表2 本草銀耳、白色銀耳和黃色銀耳中游離氨基酸和5′-核苷酸含量測(cè)定結(jié)果?

5′-核苷酸是典型的呈鮮物質(zhì),近年來(lái)“I+G”(即“肌苷酸+鳥(niǎo)苷酸”)被廣泛應(yīng)用在調(diào)味品中,以增加食品的鮮味。由表2可知,3種樣品中6種游離核苷酸可檢出5種,5′-XMP除外。游離5′-核苷酸總量以黃色銀耳含量最高(1.09 mg/g),其次為草本銀耳(0.67 mg/g),白色銀耳的最低(0.36 mg/g)。就單一核苷酸而言,5′-CMP含量相對(duì)豐富(0.10～0.45 mg/g);呈味核苷酸則以5′-GMP含量較高(0.06～0.29 mg/g),有研究[9]顯示其有很強(qiáng)的助鮮作用,在與呈味氨基酸等的協(xié)同作用下可以使鮮度提高幾十倍甚至幾百倍之高。除5′-IMP外,黃色銀耳中5′-核苷酸含量普遍高于其他兩種銀耳樣品,尤其對(duì)于呈味核苷酸總量(0.40 mg/g)比本草銀耳(0.18 mg/g)和白色銀耳(0.18 mg/g)高出122.2%,該結(jié)果亦可以看出黃色銀耳樣品較其他兩種樣品的鮮味更為濃郁。

2.2 銀耳樣品的滋味物質(zhì)的呈味作用和鮮味強(qiáng)度評(píng)價(jià)

滋味活度值(taste active value,TAV)可以用于表征單一化合物對(duì)整體滋味的貢獻(xiàn),TAV<1表示該物質(zhì)對(duì)樣品滋味沒(méi)有貢獻(xiàn),TAV>1則表示有貢獻(xiàn),且貢獻(xiàn)度與數(shù)值正相關(guān)。如表3所示,僅Glu、Arg和His,以及白色銀耳品種樣品才有的Ile的TAV高于1,且分別為3.43～7.07,3.02～5.04,3.00～3.90和1.44～2.86,說(shuō)明Glu對(duì)于鮮味有較大的貢獻(xiàn),而Arg雖然對(duì)苦味有貢獻(xiàn),但是其可以與Glu和食鹽協(xié)同作用產(chǎn)生令人愉快的風(fēng)味[10],另外His和Ile也對(duì)苦味有貢獻(xiàn)。雖然絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和Gly的TAV<1,但它們與IMP協(xié)同作用可以增強(qiáng)鮮味[11]。從鮮、甜味TAV總和可以看出,黃色銀耳鮮味更為突出。

表3 銀耳樣品滋味物質(zhì)的閾值和滋味活度值?

5′-核苷酸與鮮味氨基酸的協(xié)同作用是提高食用菌鮮味的主要因素,可以通過(guò)EUC從另一個(gè)角度來(lái)評(píng)價(jià)樣品的鮮味強(qiáng)度。有研究[12]將EUC評(píng)價(jià)鮮味程度分為4個(gè)水平:>1 000,100～1 000,10～100,<10 g MSG/100 g。本草銀耳、白銀耳和普通銀耳的EUC值對(duì)比見(jiàn)圖1,可以直觀(guān)看出普通銀耳鮮味強(qiáng)度高于其他兩種樣品(P<0.01),且處于第3個(gè)水平,另兩個(gè)樣品則處于最低水平。綜上所述,研究通過(guò)鮮味物質(zhì)含量、TAV以及EUC等多個(gè)維度分析發(fā)現(xiàn),黃色銀耳鮮味突出,更適合作為烹飪的佐料,這也符合了人們?nèi)粘５娘嬍沉?xí)慣;而白銀耳鮮味強(qiáng)度較低,特別是本草銀耳,在調(diào)制飲品時(shí),口感更易于消費(fèi)者接受。

**為存在極顯著差異(P<0.01)

2.3 銀耳樣品電子舌分析

如圖2(a)所示,不同銀耳樣品差異不明顯,僅在酸味有輪廓的波動(dòng)。采用主成分分析(principle component analysis,PCA)對(duì)不同銀耳樣品的滋味進(jìn)行進(jìn)一步挖掘分析,結(jié)果如圖2(b)所示,主成分1(principle component 1,PC1)貢獻(xiàn)率占比47.4%,主成分2(principle component 2,PC2)貢獻(xiàn)率占比25.3%,前兩個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率占比72.7%,可以看出不同樣品間存在明顯差異。雖然雷達(dá)圖譜整體差異不大,但是通過(guò)PCA可挖掘到細(xì)微差異,以及不同味道對(duì)樣品整體呈味貢獻(xiàn)程度是存在差異的。黃色銀耳鮮、甜味突出,更適合作為菜肴的佐料,這與成分分析和EUC評(píng)價(jià)結(jié)果相吻合;本草銀耳具有一定苦味和苦味回味,可能與本身苦味氨基酸以及本草基質(zhì)存在的一些苦味物質(zhì)遷移到子實(shí)體中有關(guān)。

圖2 本草銀耳、白色銀耳和黃色銀耳電子舌滋味分析及其PCA結(jié)果

2.4 銀耳樣品SPME-GC-MS揮發(fā)性成分分析

4種銀耳樣品經(jīng)SPME萃取后,結(jié)合GC-MS分析,揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖3。如圖4(a)所示,黃色銀耳、白色銀耳和本草銀耳分別鑒定得到49,71,82種化合物,可見(jiàn)白銀耳香氣物質(zhì)豐富度要高于普通銀耳,且經(jīng)過(guò)本草基質(zhì)改良后,香氣豐富度進(jìn)一步提升;其中主要以酯類(lèi)和醛類(lèi)為主,本草銀耳中酯類(lèi)檢出17種,占比約21%,其次是烷烴類(lèi)化合物(12種,占比15.32%),通常情況下,大多烷烴類(lèi)化合物香氣較弱或無(wú)味,但烴類(lèi)化合物可能作為雜環(huán)類(lèi)化合物的重要中間體對(duì)風(fēng)味形成具有基底作用,且在一些情況下,它們可以作為輔助呈香物質(zhì),使得香氣更為柔和。如圖4(b)所示,本草銀耳烷烴類(lèi)化合物相對(duì)含量占比較高(14.23%),相對(duì)于白色銀耳(醛類(lèi)占比較高,13.82%)香氣更加柔和,而黃色銀耳則香氣較為平淡,沒(méi)有較為突出的香氣種類(lèi)。

圖3 3種銀耳樣品GC-MS總離子流圖

圖4 3種銀耳樣品香氣化合物種類(lèi)及其相對(duì)含量

如表4所示,篩選得到了26種銀耳特征香氣成分(即表3前26個(gè)化合物),它們不隨品種和基質(zhì)改變而消失,包括6種酯類(lèi)、5種醛類(lèi)、4種芳香類(lèi)化合物、2種醇類(lèi)、2種雜環(huán)化合物、2種烷烴化合物、2種八碳化合物、1種酮類(lèi)、1種酸類(lèi)和1種酚類(lèi)化合物。白色銀耳特有化合物有27～35號(hào)化合物,包括6種酮類(lèi)、2種醇類(lèi)和1種醛類(lèi)化合物,它們主要以花香、甜香為主。本草銀耳特有化合物有36～39號(hào)化合物,包括酯類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)化合物各1種,分別呈現(xiàn)花香、草本和煙草香等。

表4 銀耳特征指紋香氣成分?

2.5 銀耳樣品電子鼻分析

研究所使用的電子鼻包含10個(gè)傳感器,其名稱(chēng)和性能描述如表4所示,對(duì)銀耳樣品各傳感器響應(yīng)值繪圖見(jiàn)圖5(a),其中W1W、W5S、W1S和W2W等傳感器響應(yīng)存在差異?；赑CA整體差異分析,PC1和PC2的貢獻(xiàn)率占比分別為77.7%和10.1%,累積貢獻(xiàn)率達(dá)87.8%,大于85%[14],可見(jiàn)兩個(gè)主成分包含了3種銀耳樣品的大部分特征信息(87.8%),可以描述不同銀耳樣品之間香氣物質(zhì)特征的差異;如圖5(b)所示,白色銀耳系列相對(duì)聚集,與普通銀耳區(qū)分明顯,且主要差異體現(xiàn)在PC1上。品種造成的香氣差異程度要大于不同基質(zhì)所產(chǎn)生的影響,從另一個(gè)角度可以表明,電子舌加PCA具有用于不同品種樣品的初步鑒別的潛力。

圖5 智能感官電子鼻傳感器響應(yīng)值雷達(dá)圖譜和PCA得分圖

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法和HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)不同栽培基質(zhì)的銀耳樣品中的主要滋味成分和揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,并結(jié)合智能感官電子舌和電子鼻技術(shù)對(duì)樣品的風(fēng)味特征進(jìn)行了解析。結(jié)果表明,游離鮮味氨基酸以普通銀耳含量最高,比白色銀耳和本草基質(zhì)栽培的白色銀耳分別高出105.8%和42.3%。黃色銀耳呈味核苷酸總量比白色銀耳和本草基質(zhì)栽培的白色銀耳高出122.2%,反映出黃色銀耳樣品鮮味更為濃郁。本草基質(zhì)栽培的白色銀耳和白色銀耳鮮味較淡。電子舌滋味值雷達(dá)圖譜觀(guān)測(cè)到3種樣品差異不明顯,通過(guò)PCA進(jìn)一步分析,可以看出樣品間存在明顯差異,其中普通銀耳鮮、甜味突出,本草基質(zhì)栽培的白色銀耳具有一定苦味和苦味回味。揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果顯示,本草基質(zhì)栽培的白色銀耳鑒定得到82種揮發(fā)性物質(zhì),高于白色銀耳和黃色銀耳,以酯類(lèi)為主,占比16.9%～22.4%,呈現(xiàn)濃郁的花草芳香。香氣物質(zhì)含量方面本草基質(zhì)栽培的白色銀耳亦占據(jù)優(yōu)勢(shì),其中烷烴類(lèi)化合物相對(duì)含量占比較高,相對(duì)于白色銀耳香氣更加柔和。不同樣品電子鼻傳感器響應(yīng)值雷達(dá)圖譜亦差異不明顯,通過(guò)PCA整體差異分析發(fā)現(xiàn),白銀耳系列相對(duì)聚集,并且可與普通銀耳產(chǎn)生區(qū)分。品種造成的香氣差異程度要大于不同基質(zhì)所產(chǎn)生的影響。綜上所述,本草基質(zhì)栽培的白色銀耳鮮味淡香氣濃,可開(kāi)發(fā)調(diào)制飲品,而黃色銀耳更適合作為菜肴。