組分差異分析結合智能感官對本草栽培銀耳風味特征的分析

陳萬超

吳 迪1,2,3

肖敏生4

姚淑先5

楊 焱1,2,3

劉艷芳1,2,3

(1. 上海市農業科學院食用菌研究所,上海 201403;2. 農業農村部南方食用菌資源利用重點實驗室,上海 201403;3. 國家食用菌工程技術研究中心,上海 201403;4. 上海開森生物科技有限公司,上海 201824;5. 福建山湖本草銀耳有限公司,福建 寧德 352262)

銀耳,又稱白木耳、雪耳等,屬于擔子菌門、銀耳綱、銀耳目、銀耳科、銀耳屬,是一種常見的食藥兩用真菌。

中國銀耳栽培分布主要是福建、四川等地,其中福建古田銀耳歷史悠久,產量占全球90%以上[1]。福建古田代料栽培銀耳普遍為黃色銀耳(Tr01)和白色銀耳(Tr21)[1],栽培基質主要采用棉籽殼、麥麩等。除此之外,亦存在以傳統植物本草為基質的栽培技術,目前研究主要集中在栽培設施設備的開發,關于本草基質對銀耳子實體的品質影響的研究鮮有報道。本草基質栽培銀耳所選用的栽培品種為白色銀耳,旨在彌補銀耳的營養缺陷,如粗多糖含量較低,對人體的滋補效果不明顯等[2]。對于飲食習慣,大眾消費的主要以黃色銀耳為主,其肉質脆爽,常作為拌菜的食材,而對于白色銀耳的食用習慣并未建立,其內在原因值得進一步挖掘。研究擬以常規栽培基質的黃色銀耳和白色銀耳為參考,傳統植物本草為基質的白色銀耳為研究對象,通過高效液相色譜技術和頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)對3種銀耳中主要的滋味成分(游離氨基酸和核苷酸)進行測定,基于這些組分的差異分析結合智能感官(如電子舌和電子鼻)探究3種銀耳的風味特征,以期為銀耳作為食材用于烹飪提供理論支撐,同時為本草栽培銀耳的高值利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃色銀耳、白色銀耳和本草基質栽培白色銀耳(本草銀耳):其鮮品銀耳子實體均于2022年11月產自福建古田,上海開森生物科技有限公司;

粉碎機:QE-400型,浙江屹立工貿有限公司;

水分測定儀:MA100型,德國Sartorius公司;

離心機:Allegra 25R Centrifuge型,美國Beckman公司;

超純水設備:ELGA型,美國ULTRA公司;

液相色譜:Waters E2695 Alliance型,美國Waters公司;

高效液相色譜儀:Waters 600型,美國Waters公司;

二極管陣列檢測器:2996型,美國Waters公司;

味覺分析系統:SA-402B型,日本INSENT公司;

氣質聯用儀:7890A-5975C型,安捷倫科技(上海)有限公司;

電子鼻:PEN2型,德國Airsense公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離氨基酸測定 參考Boogers等[3]的方法,準確稱取銀耳樣品500 mg于50 mL離心管,加入20 mL超純水,沸水浴加熱提取10 min(每5 min混勻一次),趁熱抽濾,冷至室溫后定容至50 mL,過0.22 μm混合纖維素微孔濾膜,備用。樣品衍生化:分別準確吸取20 μL樣品溶液于衍生管(6 mm×50 mm),加入140 μL硼酸鹽緩沖液,渦旋混勻后加入40 μL衍生劑。室溫放置1 min,55 ℃下加熱10 min,取出待測。液相測定條件與陳榮榮等[4]的方法相同。

1.2.2 游離5′-核苷酸測定 參考陳萬超等[5]的檢測方法,準確稱取銀耳樣品1 000 mg,加入25 mL蒸餾水,煮沸并保持1 min,冷卻至室溫,16 000×g離心15 min,取出上清液,過0.22 μm微孔濾膜,待測。色譜條件:Ultimate AQ -C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:KH2PO4緩沖鹽(pH 4.68);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;紫外檢測波長249 nm。

1.2.3 揮發性香氣成分HS-SPME-GC-MS測定 參考李文等[6]的分析和數據處理方法,略有修改,采用頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜聯用技術(HS-SPME-GC-MS)進行測定,準確稱取0.5 g,置于20 mL頂空瓶中,加入5 mL水和10 μL二氯苯(內標物,100 μg/mL)迅速混勻待測。頂空瓶置于55 ℃條件平衡30 min,將75 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭經30 ℃老化20 min 后插入頂空瓶中,平衡吸附30 min,后立即將纖維萃取頭抽出并轉移到GC-MS進樣口中,推出萃取頭中的纖維頭,在250 ℃下解吸10 min。

1.2.4 電子舌分析 采用SA-402B味覺分析系統對離心后的酶解液進行測定。該裝置具有8個傳感器,分別為CA0(酸味)、C00(苦味)、CT0(咸味)、AAE(鮮味)、AE1(澀味)、甜味(GL1)和2個參比傳感器。在樣品測試前,提前將傳感器活化并進行自檢,待各傳感器數值穩定在允許范圍內,即CA0和AAE為-80～80 V,CT0 90～130 V,C00和AE1 80～160 V,方可進行測定。參數設置:測定5次,正負極清洗90 s,標準清洗液2和3均清洗120 s,參比液(30 mmol/L 氯化鉀+0.3 mmol/L 酒石酸)測定30 s,靜止1 s,樣品測定30 s,標準清洗液4和5分別清洗3 s,參比液(30 mmol/L 氯化鉀+0.3 mmol/L 酒石酸)測定30 s。

1.2.5 電子鼻分析 采用直接頂空吸氣法,稱取1.0 g樣品置于20 mL頂空瓶內,用帶有PTFE密封墊的蓋子密封,靜止10 min待測。以潔凈干燥空氣為載氣,設置電子鼻采樣時間為160 s,氣體流量為0.3 L/min,等待時間為10 s,清洗時間60 s。每個樣品重復6次,取穩定后的3次數據,進行下一步數據分析。

表1 電子鼻傳感器陣列名稱及其性能描述

1.2.6 等鮮濃度值計算 等鮮濃度值(equivalent umami concentration,EUC)是指100 g干樣品中,呈鮮物質的總量,常用谷氨酸鈉(monosodium glutamate,MSG)的含量表示[7]。其計算公式為:

Y=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj),

(1)

式中:

Y——味精當量即EUC值,g MSG/100 g;

ai——呈鮮氨基酸的含量,如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),g/100 g;

aj——呈鮮核苷酸的含量,如鳥苷酸(5′-GMP)、肌苷酸(5′-IMP)、黃苷酸(5′-XMP)和腺苷酸(5′-AMP),g/100 g;

bi——呈鮮氨基酸相對MSG的鮮味程度(Glu為1,Asp為0.077);

bj——呈味核苷酸相對5′-IMP的值(5′-IMP為1,5′-GMP為2.3,5′-XMP為0.61,5′-AMP為0.18);

1 218——協同作用常數。

1.3 數據處理

利用Matlab 2020b,生科云(https://www.bioincloud.tech/)信息分析云平臺和TBtools等工具進行可視化繪圖。利用Excel 2019和IBM SPSS Statistic 25進行數據分析和處理,數據均以平均數±標準偏差表示,采用Tukey HSD檢驗進行顯著性分析(顯著水平P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 銀耳樣品滋味組分分析

食用菌以鮮香美味著稱,其中鮮味的重要載體包括Asp、Glu等游離氨基酸,以及5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP等游離5′-核苷酸。如表2所示,從氨基酸組成看,3種銀耳樣品氨基酸種類存在一定差異,其中半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)均未檢出,甲硫氨酸(Met)僅在黃色銀耳中有檢出,賴氨酸(Lys)和異亮氨酸(Ile)則分別在白色銀耳和黃色銀耳中未檢出。在含量層面,白銀耳的游離氨基酸總量相對最高(8.33 mg/g),其次為普通銀耳(7.69 mg/g),本草銀耳的最低(7.37 mg/g);3種銀耳中均以精氨酸(Arg,1.51～2.52 mg/g)和Glu(1.03～2.12 mg/g)含量較高,前者具有良好的清除自由基延緩衰老的功效[8],后者可以提高鮮美的口感。對于呈味氨基酸,鮮味氨基酸和甜味氨基酸主要以Glu和甘氨酸(Gly,0.42～0.43 mg/g)為主,前者以普通銀耳的最高,比本草銀耳和白色銀耳分別高出42.3%和105.8%,由此可見黃色銀耳樣品鮮味較為濃郁,白色銀耳品種本身鮮味較淡;后者在3種樣品中差異不顯著(P<0.5),即甘甜味差異不大。

表2 本草銀耳、白色銀耳和黃色銀耳中游離氨基酸和5′-核苷酸含量測定結果?

5′-核苷酸是典型的呈鮮物質,近年來“I+G”(即“肌苷酸+鳥苷酸”)被廣泛應用在調味品中,以增加食品的鮮味。由表2可知,3種樣品中6種游離核苷酸可檢出5種,5′-XMP除外。游離5′-核苷酸總量以黃色銀耳含量最高(1.09 mg/g),其次為草本銀耳(0.67 mg/g),白色銀耳的最低(0.36 mg/g)。就單一核苷酸而言,5′-CMP含量相對豐富(0.10～0.45 mg/g);呈味核苷酸則以5′-GMP含量較高(0.06～0.29 mg/g),有研究[9]顯示其有很強的助鮮作用,在與呈味氨基酸等的協同作用下可以使鮮度提高幾十倍甚至幾百倍之高。除5′-IMP外,黃色銀耳中5′-核苷酸含量普遍高于其他兩種銀耳樣品,尤其對于呈味核苷酸總量(0.40 mg/g)比本草銀耳(0.18 mg/g)和白色銀耳(0.18 mg/g)高出122.2%,該結果亦可以看出黃色銀耳樣品較其他兩種樣品的鮮味更為濃郁。

2.2 銀耳樣品的滋味物質的呈味作用和鮮味強度評價

滋味活度值(taste active value,TAV)可以用于表征單一化合物對整體滋味的貢獻,TAV<1表示該物質對樣品滋味沒有貢獻,TAV>1則表示有貢獻,且貢獻度與數值正相關。如表3所示,僅Glu、Arg和His,以及白色銀耳品種樣品才有的Ile的TAV高于1,且分別為3.43～7.07,3.02～5.04,3.00～3.90和1.44～2.86,說明Glu對于鮮味有較大的貢獻,而Arg雖然對苦味有貢獻,但是其可以與Glu和食鹽協同作用產生令人愉快的風味[10],另外His和Ile也對苦味有貢獻。雖然絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和Gly的TAV<1,但它們與IMP協同作用可以增強鮮味[11]。從鮮、甜味TAV總和可以看出,黃色銀耳鮮味更為突出。

表3 銀耳樣品滋味物質的閾值和滋味活度值?

5′-核苷酸與鮮味氨基酸的協同作用是提高食用菌鮮味的主要因素,可以通過EUC從另一個角度來評價樣品的鮮味強度。有研究[12]將EUC評價鮮味程度分為4個水平:>1 000,100～1 000,10～100,<10 g MSG/100 g。本草銀耳、白銀耳和普通銀耳的EUC值對比見圖1,可以直觀看出普通銀耳鮮味強度高于其他兩種樣品(P<0.01),且處于第3個水平,另兩個樣品則處于最低水平。綜上所述,研究通過鮮味物質含量、TAV以及EUC等多個維度分析發現,黃色銀耳鮮味突出,更適合作為烹飪的佐料,這也符合了人們日常的飲食習慣;而白銀耳鮮味強度較低,特別是本草銀耳,在調制飲品時,口感更易于消費者接受。

**為存在極顯著差異(P<0.01)

2.3 銀耳樣品電子舌分析

如圖2(a)所示,不同銀耳樣品差異不明顯,僅在酸味有輪廓的波動。采用主成分分析(principle component analysis,PCA)對不同銀耳樣品的滋味進行進一步挖掘分析,結果如圖2(b)所示,主成分1(principle component 1,PC1)貢獻率占比47.4%,主成分2(principle component 2,PC2)貢獻率占比25.3%,前兩個主成分累積貢獻率占比72.7%,可以看出不同樣品間存在明顯差異。雖然雷達圖譜整體差異不大,但是通過PCA可挖掘到細微差異,以及不同味道對樣品整體呈味貢獻程度是存在差異的。黃色銀耳鮮、甜味突出,更適合作為菜肴的佐料,這與成分分析和EUC評價結果相吻合;本草銀耳具有一定苦味和苦味回味,可能與本身苦味氨基酸以及本草基質存在的一些苦味物質遷移到子實體中有關。

圖2 本草銀耳、白色銀耳和黃色銀耳電子舌滋味分析及其PCA結果

2.4 銀耳樣品SPME-GC-MS揮發性成分分析

4種銀耳樣品經SPME萃取后,結合GC-MS分析,揮發性成分GC-MS總離子流圖見圖3。如圖4(a)所示,黃色銀耳、白色銀耳和本草銀耳分別鑒定得到49,71,82種化合物,可見白銀耳香氣物質豐富度要高于普通銀耳,且經過本草基質改良后,香氣豐富度進一步提升;其中主要以酯類和醛類為主,本草銀耳中酯類檢出17種,占比約21%,其次是烷烴類化合物(12種,占比15.32%),通常情況下,大多烷烴類化合物香氣較弱或無味,但烴類化合物可能作為雜環類化合物的重要中間體對風味形成具有基底作用,且在一些情況下,它們可以作為輔助呈香物質,使得香氣更為柔和。如圖4(b)所示,本草銀耳烷烴類化合物相對含量占比較高(14.23%),相對于白色銀耳(醛類占比較高,13.82%)香氣更加柔和,而黃色銀耳則香氣較為平淡,沒有較為突出的香氣種類。

圖3 3種銀耳樣品GC-MS總離子流圖

圖4 3種銀耳樣品香氣化合物種類及其相對含量

如表4所示,篩選得到了26種銀耳特征香氣成分(即表3前26個化合物),它們不隨品種和基質改變而消失,包括6種酯類、5種醛類、4種芳香類化合物、2種醇類、2種雜環化合物、2種烷烴化合物、2種八碳化合物、1種酮類、1種酸類和1種酚類化合物。白色銀耳特有化合物有27～35號化合物,包括6種酮類、2種醇類和1種醛類化合物,它們主要以花香、甜香為主。本草銀耳特有化合物有36～39號化合物,包括酯類、酸類、醇類和雜環類化合物各1種,分別呈現花香、草本和煙草香等。

表4 銀耳特征指紋香氣成分?

2.5 銀耳樣品電子鼻分析

研究所使用的電子鼻包含10個傳感器,其名稱和性能描述如表4所示,對銀耳樣品各傳感器響應值繪圖見圖5(a),其中W1W、W5S、W1S和W2W等傳感器響應存在差異。基于PCA整體差異分析,PC1和PC2的貢獻率占比分別為77.7%和10.1%,累積貢獻率達87.8%,大于85%[14],可見兩個主成分包含了3種銀耳樣品的大部分特征信息(87.8%),可以描述不同銀耳樣品之間香氣物質特征的差異;如圖5(b)所示,白色銀耳系列相對聚集,與普通銀耳區分明顯,且主要差異體現在PC1上。品種造成的香氣差異程度要大于不同基質所產生的影響,從另一個角度可以表明,電子舌加PCA具有用于不同品種樣品的初步鑒別的潛力。

圖5 智能感官電子鼻傳感器響應值雷達圖譜和PCA得分圖

3 結論

采用高效液相色譜法和HS-SPME-GC-MS技術對不同栽培基質的銀耳樣品中的主要滋味成分和揮發性成分進行分析,并結合智能感官電子舌和電子鼻技術對樣品的風味特征進行了解析。結果表明,游離鮮味氨基酸以普通銀耳含量最高,比白色銀耳和本草基質栽培的白色銀耳分別高出105.8%和42.3%。黃色銀耳呈味核苷酸總量比白色銀耳和本草基質栽培的白色銀耳高出122.2%,反映出黃色銀耳樣品鮮味更為濃郁。本草基質栽培的白色銀耳和白色銀耳鮮味較淡。電子舌滋味值雷達圖譜觀測到3種樣品差異不明顯,通過PCA進一步分析,可以看出樣品間存在明顯差異,其中普通銀耳鮮、甜味突出,本草基質栽培的白色銀耳具有一定苦味和苦味回味。揮發性成分鑒定結果顯示,本草基質栽培的白色銀耳鑒定得到82種揮發性物質,高于白色銀耳和黃色銀耳,以酯類為主,占比16.9%～22.4%,呈現濃郁的花草芳香。香氣物質含量方面本草基質栽培的白色銀耳亦占據優勢,其中烷烴類化合物相對含量占比較高,相對于白色銀耳香氣更加柔和。不同樣品電子鼻傳感器響應值雷達圖譜亦差異不明顯,通過PCA整體差異分析發現,白銀耳系列相對聚集,并且可與普通銀耳產生區分。品種造成的香氣差異程度要大于不同基質所產生的影響。綜上所述,本草基質栽培的白色銀耳鮮味淡香氣濃,可開發調制飲品,而黃色銀耳更適合作為菜肴。