純鈦表面負載無定形多聚磷酸鈣涂層對成骨分化影響

單爍 周歡 陳勝男 魏子然 楊磊 于騰波

［收稿日期］2023-03-05;? ［修訂日期］2023-07-18

［基金項目］國家自然科學基金杰出青年基金（82025025）；國家自然科學基金青年科學基金（31802022）；山東省重點研發(fā)計劃項目（2021SFGC0502）；河北省自然基金綠色通道項目（C2021-202003）；河北省自然基金創(chuàng)新研究群體項目（H2022202007）；天津市多元投入基金項目面上項目（21JCYBJC01030）；國家骨科與運動康復臨床醫(yī)學研究中心創(chuàng)新基金項目（2021-NCRC-CXJJ-Z-H-17）

［第一作者］單爍（1995-），男，碩士研究生。

［通信作者］楊磊（1982-），男，博士，教授，博士生導師。E-mail：ylei@hebut.edu.cn。于騰波（1970-），男，博士，主任醫(yī)師，博士生導師。E-mail：ytb8912@hotmail.com。

［摘要］? 目的

探討純鈦表面負載無定形多聚磷酸鈣（Ca-polyP）涂層對成骨分化的影響。

方法? 取TA2級純鈦片，表面構(gòu)建Ca-polyP涂層，采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、X射線能量色散譜儀、X射線衍射儀、傅立葉變換紅外光譜儀和接觸角測量儀對材料進行表征。將小鼠胚胎成骨前體細胞接種于純鈦片（對照組）以及負載Ca-polyP涂層的鈦片（實驗組）上進行細胞培養(yǎng)，采用CCK-8法測定細胞的增殖活性，通過堿性磷酸酶活性測定以及堿性磷酸酶染色評估兩組鈦片表面細胞的成骨分化能力。

結(jié)果? 多種物理表征方法檢測結(jié)果證明20鏈長Ca-polyP涂層成功負載在鈦片表面。CCK-8檢測結(jié)果顯示，兩組鈦片均無細胞毒性，且共培養(yǎng)7 d時實驗組鈦片表面的細胞增殖活性顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（F=1 375.183，P<0.001）。隨著共培養(yǎng)時間的延長，兩組鈦片表面細胞的堿性磷酸酶活性均逐漸增高，共培養(yǎng)7 d時實驗組鈦片表面細胞的堿性磷酸酶活性顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（F=41.141，P<0.01）。堿性磷酸酶染色后熒光倒置顯微鏡下觀察，實驗組鈦片上的藍紫色深染結(jié)節(jié)明顯多于對照組。

結(jié)論? 與純鈦相比，鈦片表面負載Ca-polyP涂層可以顯著增強小鼠胚胎成骨前體細胞的增殖和成骨分化能力。

［關(guān)鍵詞］? 鈦；磷酸鈣類；小鼠胚胎干細胞；成骨分化

［中圖分類號］? R329.21

［文獻標志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2024）01-0006-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.014

［開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240307.1046.001;2024-03-09? 19：18：47

Effect of pure titanium surface-loaded amorphous calcium polyphosphate coating on osteogenic differentiation

＼ SHAN Shuo， ZHOU Huan， CHEN Shengnan， WEI Ziran， YANG Lei， YU Tengbo

＼ （Department of Sports Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the effect of pure titanium surface-loaded amorphous calcium polyphosphate （Ca-polyP） coating on osteogenic differentiation.

＼ Methods＼ TA2 titanium sheets were taken， coated with Ca-polyP on the surface， and characterized by field emission scanning electron microscopy， X-ray energy dispersive spectroscopy， X-ray diffractometry， Fourier transform infrared spectroscopy， and contact angle measurement. Mouse embryo osteoblast precursor cells were inoculated on pure titanium sheets （control group） and titanium sheets loaded with Ca-polyP coating （experimental group） for cell culture. The proliferation activity of cells was measured by CCK-8 assay. The osteogenic differentiation ability of cells on the surface of titanium sheets in both groups was assessed by alkaline phosphatase activity assay and alkaline phosphatase staining.

＼ Results＼ Successful loading of 20-chain-length Ca-polyP coating on titanium sheet surface was demonstrated by various physical characterization me-

thods. The results of CCK-8 assay showed that titanium sheets in both groups were non-cytotoxic， and the cell proliferation activity on the surface of titanium sheets in the experimental group was significantly higher than that in the control group after 7 days of co-culture （F=1 375.183，P<0.001）. With the extension of co-culture time， the alkaline phosphatase activity of cells on the surface of titanium sheets gradually increased in both groups， and the alkaline phosphatase activity of cells on the surface of titanium sheets in the experimental group was significantly higher than that in the control group after 7 days of co-culture （F=41.141，P<0.01）. Alkaline phosphatase staining followed by inverted fluorescence microscopy showed that there were significantly more blue-purple darkly stained nodules on titanium sheets in the experimental group than in the control group.

＼ Conclusion＼ Titanium sheets loaded with Ca-polyP coating on the surface significantly enhances the proliferation and osteogenic differentiation of mouse embryo osteoblast precursor cells compared with pure titanium sheets.

［Key words］＼ titanium; calcium phosphates; mouse embryonic stem cells; osteogenic differentiation

骨缺損是困擾人們幾個世紀的難題。至今，實現(xiàn)更快、更好地種植體骨整合仍然是骨科領(lǐng)域面臨的一個重要挑戰(zhàn)。金屬鈦及鈦合金因有優(yōu)良的力學性能和生物相容性長久以來都被人們當作骨科移植的首選材料［1-3］。無機多聚磷酸鹽（polyP）作為一種與骨礦物質(zhì)成分相似的化合物已經(jīng)引起了研究人員的注意。polyP廣泛存在于多種生物體內(nèi)，是一種由最多1 000個磷酸鹽（Pi）單元構(gòu)成的無機線性聚合物，由高能磷酸鍵相互連接，在人體內(nèi)主要存在于成骨細胞和血小板中［4］。polyP的生物學功能多種多樣，其降解產(chǎn)物如Pi和能量可以參與骨再生和能量代謝［5］。polyP作為一種聚陰離子，帶強負電荷，可以與二價和三價金屬離子等結(jié)合從而發(fā)揮不同作用。眾所周知，骨骼礦化過程需要大量的無機鹽和能量，所以很多研究者嘗試利用polyP合成多聚磷酸鈣（Ca-polyP），從而促進成骨反應(yīng)。本研究制備了負載20鏈長無定形Ca-polyP的鈦表面涂層，

探討其對小鼠胚胎成骨前體細胞生物活性的影響，以期為構(gòu)建具有優(yōu)良成骨活性的種植體涂層提供新思路。

1? 材料和方法

1.1? 實驗材料

TA2級純鈦（興化市江浙鈦制品有限公司，江蘇）；20鏈長polyP（Sigma，美國）；二水氯化鈣（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、丙酮及氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1（中國科學院細胞庫）；MC3T3-E1成骨誘導分化培養(yǎng)液、MC3T3-E1細胞完全培養(yǎng)液（蘇州海星生物科技有限公司）；堿性磷酸酶染色及活性檢測試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；CCK-8試劑盒（蘇州新賽美生物科技有限公司）。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 實驗分組? 將100個鈦片隨機分為2組，每組50個。以純鈦組作為對照組，該組預(yù)處理后的鈦片記為Ti；以負載Ca-polyP組作為實驗組，該組鈦片記為Ca-P20-Ti。

1.2.2? 純鈦的預(yù)處理? 將純鈦片（10 mm×10 mm×

1 mm）分別用1 000、1 500、2 000目的砂紙逐級打磨，橫豎反復交替打磨直到鈦片表面光潔，去掉氧化層后呈現(xiàn)鏡面狀。然后依次用丙酮、乙醇和去離子

水分別超聲清洗3 h，充分去除鈦表面雜質(zhì)。隨后

配制5 mol/L NaOH溶液，將鈦片放入其中浸泡，

撈出后用去離子水和乙醇反復超聲清洗3次，以清除鈦片表面油污，最后放入37 ℃烘箱中干燥備用。

1.2.3? 20鏈長的Ca-polyP涂層負載? 將20鏈長的polyP 1.1 g溶解于50 mL去離子水中，超聲溶解均勻。隨后將預(yù)處理好的若干鈦片拋光面向上浸泡于溶液中12 h，形成polyP改性鈦。再將2.9 g的CaCl2·2H2O溶解于30 mL去離子水中并超聲溶解配制過飽和CaCl2·2H2O溶液。將浸泡有鈦片的燒杯放置在攪拌器上，放入pH計電極棒，邊攪拌邊通過滴加1 mol/L NaOH調(diào)整pH值至10左右，隨后緩慢將過飽和CaCl2·2H2O溶液滴加入浸泡鈦片的燒杯中。鈦片在該反應(yīng)液中浸泡24 h，在此期間始終維持pH值在10左右。待反應(yīng)結(jié)束后分別用乙醇和去離子水交替超聲清洗3次以除去未完全反應(yīng)的物質(zhì)以及雜質(zhì)，最后放入37 ℃烘箱烘干備用。Ti表面Ca-polyP涂層構(gòu)建原理見圖1。

1.2.4? 材料的表征? 以下材料表征實驗均每組取3個干燥樣品。從烘箱中取干燥樣品固定在樣品臺上，噴金30 s后在加速電壓為10 kV的條件下采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Hitachi S-4800，Japan）觀察樣品表面形貌的微觀結(jié)構(gòu)。取出干燥樣品，采用X射線能譜儀（EDS，Genesis XM2，EDAX，America）分析樣品表面涂層的化學成分以及含量。取出干燥樣品，放入X射線衍射儀（XRD，Miniflex 600）中，利用X射線在晶體物質(zhì)中的衍射效應(yīng)進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。取出干燥樣品，使用傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR，Nicolet iS20）對樣品進行分析。將兩組鈦片分別置于樣品臺上，在距離樣品表面約5 cm處滴加10 μL去離子水，應(yīng)用接觸角測量儀進行鈦片表面水接觸角測量。

1.2.5? MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)? 細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，用MC3T3-E1細胞專用的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中2 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)數(shù)天后待細胞貼壁融合面積達T25培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%時，棄培養(yǎng)液，加入PBS清洗培養(yǎng)瓶3次。加入1 mL胰蛋白酶消化2 min后再加入5 mL的細胞培養(yǎng)液終止消化，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)

液10 mL重懸，吹打均勻，細胞計數(shù)后選擇適當?shù)?/p>

密度進行細胞傳代或凍存。

1.2.6? CCK-8法測定細胞增殖? 每組設(shè)3個平行樣，每個平行樣重復3個孔。將制備好的樣品浸泡在體積分數(shù)0.75乙醇中30 min，并用紫外線照射鈦片正反兩面進行消毒滅菌處理，處理完成后用無菌鑷將所有鈦片轉(zhuǎn)移到24孔板中。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞，用PBS漂洗后消化細胞，以每孔104個細胞的密度將細胞懸液接種到24孔板中。培養(yǎng)1、3、7 d后，每孔加入40 μL的CCK-8溶液，避光孵育2 h，使用酶標儀測量450 nm波長下的吸光度值。

1.2.7? 堿性磷酸酶定量分析? 按前述方法將樣品滅菌并放置于24孔板內(nèi)，取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞，消化后以每孔104個細胞的密度接種于24孔板中樣品的表面，每2 d更換一次培養(yǎng)液。7 d后將MC3T3-E1完全培養(yǎng)液更換為MC3T3-E1細胞專用成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)誘導培養(yǎng)。在培養(yǎng)4 d和7 d后，將樣品取出，用PBS漂洗3遍，將樣品轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，用RIPA裂解液裂解細胞30 s，并用移液槍反復吹打，將裂解后的溶液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，在4 ℃下以1 000 r/min離心10 min。用堿性磷酸酶活性測定試劑盒對離心后的樣品進行定量檢測，使用酶標儀在405 nm波長下測定吸光度值。

1.2.8? 堿性磷酸酶染色? 按前述方法將樣品滅菌并放置于24孔板中，取MC3T3-E1細胞懸液以每孔104個細胞的密度滴加到鈦片上，在24孔板中共培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)液更換為MC3T3-E1細胞專用成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)誘導培養(yǎng)7 d。7 d后進行堿性磷酸酶染色，以PBS洗滌鈦片3次，多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗滌3次，向每孔中加入1 mL堿性磷酸酶染色溶液，在室溫下避光孵育30 min。用PBS洗滌3次，在倒置熒光顯微鏡（尼康，日本）下觀察并拍照。

1.3? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS Statistics v.26軟件（SPSS， Chicago， IL）進行統(tǒng)計學分析。本實驗所得數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以±s形式表示，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗及兩因素重復測量方差分析進行統(tǒng)計檢驗。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 材料的表征

2.1.1? 表面微形貌分析? 場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察可見，Ti的表面相對光滑，可見拋光產(chǎn)生的細小紋理，無其他物質(zhì)沉積；在負載20鏈長無定形Ca-polyP后，鈦片表面可見均勻分布的Ca-polyP沉積物，呈現(xiàn)顆粒狀突起，實現(xiàn)Ca-polyP在鈦片表面自組裝與生長（圖2）。

2.1.2? 表面元素分析 ?EDS分析結(jié)果顯示，Ti的表面不含磷和鈣元素，而對Ca-P20-Ti表面顆粒突起進行EDS掃描則證明鈣和磷元素已成功負載到鈦片表面（圖3A）。EDS圖譜顯示了掃描位置以及各元素的分布情況（圖3B）。

2.1.3? 材料表面的XRD分析? Ca-polyP涂層粉末的圖譜呈饅頭峰，并沒有尖銳峰出現(xiàn)，表明本實驗所合成的Ca-polyP涂層為非結(jié)晶態(tài)。Ca-P20-Ti與Ti的圖譜基本一致，主峰可與鈦標準譜線（PDF#44-1294）對應(yīng)。見圖4。

2.1.4? 材料的FTIR分析? 將樣品放入FTIR中進行分析，如圖5所示，可在Ca-P20-Ti中見到polyP的特征吸收峰。polyP中P-O-P鍵的非對稱伸縮振動吸收峰vas（P-O-P），以及反映P-O-P鍵的對稱伸縮振動吸收峰vs（P-O-P）分別在885.32 cm-1處和736.44 cm-1處出現(xiàn)；同時，（PO3）2-的非對稱伸縮振動吸收峰vas（PO3）2-在1 087.54 cm-1處出現(xiàn)。這與先前其他的研究結(jié)果一致［6］。結(jié)合前面所述的EDS以及XRD結(jié)果，證明Ca-P20-Ti表面所沉積的為Ca-polyP。

2.1.5? 材料的親疏水性分析? 接觸角測量儀測量結(jié)果顯示，Ti接觸角為84.387°±0.678°，Ca-P20-Ti接觸角為32.220°±0.898°，Ca-P20-Ti的親水性明顯大于Ti（t=80.268，P<0.05）。

2.2? 鈦片表面細胞增殖能力

在兩組鈦片表面接種細胞共培養(yǎng)7 d，細胞表現(xiàn)出持續(xù)的增殖趨勢，兩組的吸光度值均逐漸增大。兩因素重復測量方差分析顯示，組別和時間存在交

互作用（F=471.085，P<0.001）。簡單效應(yīng)分析結(jié)

果顯示：培養(yǎng)1 d時，兩組鈦片表面細胞的增殖程度

差異無顯著性（F=0.056，P=0.815）；培養(yǎng)3、7 d時，實驗組鈦片表面的細胞增殖活性顯著高于對照組（F=76.200、1 375.183，P<0.001）。證明該涂層

具有良好的生物相容性，能促進MC3T3-E1細胞的

增殖。見圖6。

2.3? 細胞成骨分化能力

2.3.1? 兩組鈦片表面堿性磷酸酶定量分析? 兩組

鈦片表面MC3T3-E1細胞分泌的堿性磷酸酶的量隨著時間延長呈持續(xù)增長的趨勢。兩因素重復測量方差分析顯示，組別和時間存在交互作用（F=21.881，P=0.003）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)4、7 d時，實驗組鈦片表面細胞的堿性磷酸酶活性均顯著高于對照組（F=19.053、41.141，P<0.01）。見圖7。

2.3.2? 兩組鈦片表面堿性磷酸酶染色? 如圖8所示，Ca-P20-Ti表面被染成藍紫色的細胞數(shù)量較Ti更多。結(jié)合堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果，證明經(jīng)Ca-polyP修飾的鈦表面更能促進MC3T3-E1細胞的成骨分化能力。

注：標尺=10 μm。

3? 討? 論

金屬鈦仍是目前骨科移植物常用的材料，廣泛應(yīng)用于各種人工關(guān)節(jié)以及鋼板、螺釘?shù)取５驅(qū)儆诙栊越饘伲云涔钦夏芰^差，可延長骨科移植術(shù)后的康復時間。因此許多研究都采用物理、化學和生物等方法對鈦表面進行結(jié)構(gòu)微處理或者負載各種涂層，以增強鈦基材料的成骨能力［7-11］。

polyP是一種帶負電荷的直鏈生物聚合物，由多個磷酸基團通過高能磷酸鍵連接在一起［12］。很多研究證實，polyP在體內(nèi)被堿性磷酸酶水解后，會釋放出大量能量和Pi，并運輸?shù)郊毎猸h(huán)境中參與骨骼礦化過程以及合成代謝反應(yīng)［5］。polyP是一種聚陰離子聚合物，可以與金屬陽離子相結(jié)合。受此啟發(fā)，很多研究者已經(jīng)嘗試合成Ca-polyP。與結(jié)晶態(tài)Ca-polyP相比，無定形Ca-polyP更適用于人體生理環(huán)境，人工合成的Ca-polyP被認為與人體中天然存在的Ca-polyP具有相似的生理功能［13］。研究表明，這些具有促成骨作用且富含能量特性的物質(zhì)可以顯著促進細胞增殖、成骨分化以及骨組織中新生血管的形成［14］。

為了將polyP和Ca2+共同固定到鈦片上制備Ca-polyP涂層，本研究首先用polyP溶液浸泡鈦片，使polyP中的Pi與鈦片表面形成穩(wěn)定的共價鍵連接，隨后在pH=10的環(huán)境中加入過飽和CaCl2·2H2O溶液。經(jīng)polyP改性的鈦片表面帶有極強的負電荷，對鈣離子具有很高的親和力。因此，溶液中的Ca2+會隨著反應(yīng)時間延長而逐步取代polyP中的Na+形成穩(wěn)定的Ca-polyP，完成原位生長形成穩(wěn)定涂層。在掃描電鏡下可見Ti表面光滑呈拋光樣貌，而負載Ca-polyP后可以觀察到鈦片表面有顆粒狀突起。在EDS中可以觀察到，與Ti不同的是，Ca-P20-Ti表面顆粒主要以鈣、磷、氧元素為主，說明是Ca2+與polyP之間結(jié)合形成了化學鍵連接。刮取鈦片表面涂層進行XRD分析，可見圖譜呈非晶態(tài)饅頭峰狀，證明鈦片表面為無定形態(tài)物質(zhì)，這與有關(guān)研究結(jié)果一致［15］。Ca-P20-Ti與Ti的XRD圖譜基本一致，與鈦的標準譜線對應(yīng)。這可能是因為Ca-polyP的圖譜為較寬的非晶態(tài)峰，無新的結(jié)晶態(tài)物質(zhì)產(chǎn)生。FTIR分析可見polyP的標志性吸收峰，分別在885.32、736.44及1 087.54 cm-1處出現(xiàn)。這與先前Ca-polyP的FTIR分析研究結(jié)果一致［6］，證明鈦片表面負載物質(zhì)為Ca-polyP。以上材料表征證明了Ca-polyP成功地負載到鈦片表面。

在細胞增殖實驗中，兩組細胞隨著時間延長均表現(xiàn)出持續(xù)增殖的趨勢，但在培養(yǎng)7 d時，Ca-P20-Ti表面的細胞數(shù)量遠遠超過Ti。這可能是因為鈦

片表面的Ca-polyP浸泡在培養(yǎng)液中可以釋放大量

的Ca2+、Pi以及能量，為細胞生長提供了更良好的生長環(huán)境。同時，改性鈦片表面本身的親水性也可能與細胞的增殖相關(guān)［16］。堿性磷酸酶活性的高低是評價MC3T3-E1細胞早期成骨分化水平的一個重要指標，代表了成骨能力。本文結(jié)果顯示，兩組鈦片的堿性磷酸酶活性均隨時間延長而增加，培養(yǎng)7 d 時Ca-P20-Ti的堿性磷酸酶活性顯著高于Ti；堿性磷酸酶染色也觀察到，與Ti相比，Ca-P20-Ti有更多的藍紫色結(jié)節(jié)，這與堿性磷酸酶活性測定的結(jié)果是一致的。說明Ca-P20-Ti對MC3T3-E1細胞早期成骨分化的促進作用十分顯著。有證據(jù)表明，這不僅是因為Ca-polyP在成骨過程中提供了原料和能量，還可能因為參與了依賴成纖維細胞生長因子介導的細胞信號傳導通路從而調(diào)節(jié)了細胞增殖和骨骼礦化［17］。

綜上，本研究選用20鏈長的polyP與CaCl2·2H2O作為原料，利用電荷吸引的原理，用極其簡單的制備方法，在室溫下即可使Ca-polyP在鈦表面原位生長形成涂層，提升了純鈦的成骨能力。盡管20鏈長Ca-polyP涂層表現(xiàn)出不錯的生物學活性，但未來在骨科領(lǐng)域中應(yīng)用仍有不小的困難。Ca-polyP材料目前還不能大規(guī)模制備，且研究中使用的前體反應(yīng)物也僅為食品級，尚不能滿足醫(yī)藥標準。微生物體內(nèi)積累的大量polyP儲備為規(guī)模生物合成制備提供了新的前景。目前已有使用釀酒酵母合成食品級polyP的報道。未來仍需要縮小從實驗室制備到商業(yè)化生產(chǎn)之間的差距。目前20鏈長Ca-polyP涂層的骨整合能力驗證僅停留在體外研究，未來仍需進行體內(nèi)研究驗證其功能及穩(wěn)定性。

［參考文獻］

［1］BUSER D， SCHENK R K， STEINEMANN S， et al. Inf-

luence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs［J］. Journal of Biomedical Materials Research， 1991，25（7）：889-902.

［2］SCHNEIDER G B， PERINPANAYAGAM H， CLEGG M， et al. Implant surface roughness affects osteoblast gene expression［J］. Journal of Dental Research， 2003，82（5）：372-376.

［3］MENDONA G， MENDONA D B， ARAGO F J， et al. Advancing dental implant surface technology： from micron- to nanotopography［J］. Biomaterials， 2008，29（28）：3822-3835.

［4］KUMBLE K D， KORNBERG A. Inorganic polyphosphate in mammalian cells and tissues［J］. The Journal of Biological Chemistry， 1995，270（11）：5818-5822.

［5］OMELON S， GEORGIOU J， VARIOLA F， et al. Colocation and role of polyphosphates and alkaline phosphatase in apatite biomineralization of elasmobranch tesserae［J］. Acta Biomaterialia， 2014，10（9）：3899-3910.

［6］MLLER W E G， NEUFURTH M， LIEBERWIRTH I， et al. Functional importance of coacervation to convert calcium polyphosphate nanoparticles into the physiologically active state［J］. Materials Today Bio， 2022，16：100404.

［7］WALSH W R， BERTOLLO N， CHRISTOU C， et al. Plasma-sprayed titanium coating to polyetheretherketone improves the bone-implant interface［J］. The Spine Journal， 2015，15（5）：1041-1049.

［8］NYAN M， HAO J， MIYAHARA T， et al. Accelerated and enhanced bone formation on novel simvastatin-loaded porous titanium oxide surfaces［J］. Clinical Implant Dentistry and Related Research， 2014，16（5）：675-683.

［9］BALLO A M， BJRN D， ASTRAND M， et al. Bone response to physical-vapour-deposited titanium dioxide coatings on titanium implants［J］. Clinical Oral Implants Research， 2013，24（9）：1009-1017.

［10］LUO F X， WANG L， XIAO Z W， et al. Application of femtosecond laser microfabrication in the preparation of advanced bioactive titanium surfaces［J］. Journal of Materials Chemistry B， 2021，9（18）：3912-3924.

［11］BRESSEL T A B， DE QUEIROZ J D F， GOMES MOREIRA S M， et al. Laser-modified titanium surfaces enhance the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］. Stem Cell Research & Therapy， 2017，8（1）：269.

［12］XIE L H， JAKOB U. Inorganic polyphosphate， a multifunctional polyanionic protein scaffold［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2019，294（6）：2180-2190.

［13］DOCAMPO R， SOUZA W D， MIRANDA K， et al. Acidocalcisomes-conserved from bacteria to man［J］. Nature Reviews Microbiology， 2005，3（3）：251-261.

［14］MLLER W E， SCHRDER H C， TOLBA E， et al. Mine-

ralization of bone-related SaOS-2 cells under physiological hypoxic conditions［J］. The FEBS Journal， 2016，283（1）：74-87.

［15］WANG X H， SCHRDER H C， MLLER W E G. Amorphous polyphosphate， a smart bioinspired nano-/ bio-material for bone and cartilage regeneration： towards a new paradigm in tissue engineering［J］. Journal of Materials Chemistry B， 2018，6（16）：2385-2412.

［16］TANG J， PENG R， DING J D. The regulation of stem cell differentiation by cell-cell contact on micropatterned material surfaces［J］. Biomaterials， 2010，31（9）：2470-2476.

［17］KAWAZOE Y， KATOH S， ONODERA Y， et al. Activation of the FGF signaling pathway and subsequent induction of mesenchymal stem cell differentiation by inorganic polyphosphate［J］. International Journal of Biological Sciences， 2008，4（1）：37-47.

（本文編輯? 馬偉平）