右美托咪定對神經元氧糖剝奪/復氧損傷的保護作用

張雅瑞 侯慶明

［收稿日期］2022-05-23;? ［修訂日期］2023-02-17

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（8217051911）

［第一作者］張雅瑞（1997-），女，碩士研究生。

［通信作者］侯慶明（1969-），男，博士，教授，博士生導師。E-mail：qingminghou69@gmail.com。

［摘要］? 目的

探討右美托咪定（Dex）對皮質神經元氧糖剝奪/復氧（OGD/R）損傷的神經保護作用及其可能機制。

方法? 培養孕18 d的SD大鼠胎鼠皮質神經元細胞，隨機分為對照組（Sham組，加入有糖細胞外液置于正常培養箱中培養）、模型組（OGD/R組，加入無糖細胞外液，置于37 ℃厭氧箱中培養制備OGD/R細胞模型）、陽性藥物對照組（OGD/R+LW6組，OGD/R模型細胞加入1 mmol/L的LW6處理1 h）、OGD/R+低濃度Dex組（OGD/R模型細胞加入0.1 μmol/L Dex處理1 h）、OGD/R+高濃度Dex組（OGD/R模型細胞加入1.0 μmol/L Dex處理1 h）。應用CCK-8比色法、免疫熒光方法檢測各組細胞的存活率，Western blot方法檢測各組低氧誘導因子1α（HIF-1α）、激活轉錄因子-6（ATF-6）及下游靶點C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達水平。

結果? CCK-8比色及免疫熒光染色結果顯示，各組神經元存活率差異有顯著性（F=63.46，P<0.05）；兩兩比較顯示，OGD/R組神經元存活率較Sham組顯著降低（P<0.05），OGD/R+高濃度Dex組神經元存活率較OGD/R組顯著提高（P<0.05）。Western blot結果顯示，各組神經元HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表達差異有顯著性（F=80.30～155.36，P<0.05）；兩兩比較顯示，OGD/R組HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表達較Sham組升高（P<0.05），OGD/R+高濃度Dex組HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表達較OGD/R組降低（P<0.05）。

結論? Dex通過抑制HIF-1α表達對OGD/R損傷的神經元模型發揮保護作用。

［關鍵詞］? 右美托咪定；低氧誘導因子1α；氧糖剝奪/復氧損傷；激活轉錄因子6；神經保護

［中圖分類號］? R338.2

［文獻標志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2024）01-0012-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.004

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240228.1250.001;2024-03-01? 17：30：08

Protective effects of dexmedetomidine against neuronal oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury

＼ ZHANG Yarui， HOU Qingming

＼ （Qingdao University? Institute of Neurodegeneration And Neurorehabilitation， Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the neuroprotective effects of dexmedetomidine （Dex） against oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） injury of cortical neurons and its possible mechanism of action.

＼ Methods＼ The cortical neurons of fetal Sprague-Dawley rats （gestational age， 18 d） were cultured and then were randomly divided into sham group （cultured in a sugar-containing medium in normal incubator）， OGD/R group （cultured in a sugar-free medium in an anaerobic incubator at 37 ℃ to prepare a neuronal OGD/R injury model）， OGD/R+LW6 group （OGD/R neurons treated with 1 mmol/L LW6 for 1 h as a po-

sitive control）， OGD/R+low-concentration Dex group （OGD/R neurons treated with 0.1 μmol/L Dex for 1 h）， and OGD/R+high-concentration Dex group （OGD/R neurons treated with 1.0 μmol/L Dex for 1 h）. The survival rate of cells was determined by co-

lorimetric assay with Cell Counting Kit-8 （CCK-8） and immunofluorescence assay. The expression levels of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， activating transcription factor 6 （ATF-6）， and the downstream target C/EBP homologous protein （CHOP） were mea-

sured by Western blot.

＼ Results＼ According to CCK-8 and immunofluorescence assay results， there was a significant diffe-

rence in the survival rate of neurons between the groups （F=63.46，P<0.05）. Pairwise comparison showed that the survival rate in the OGD/R group was significantly lower than that in the sham group （P<0.05）; and the survival rate of the OGD/R+high-concentration Dex group was significantly increased compared with that of the OGD/R group （P<0.05）. Western blot results showed significant differences in the expression of HIF-1α， ATF-6， and CHOP proteins （F=80.30-155.36，P<0.05）. Pairwise comparison showed that the expression of HIF-1α， ATF-6， and CHOP was significantly higher in the OGD/R group than in the sham group （P<0.05）; and the OGD/R+high-concentration Dex group showed significantly lower expression of HIF-1α， ATF-6， and CHOP compared with the OGD/R group， the differences are statistically significant （P<0.05）.

＼ Conclusion＼ Dex inhibits HIF-1α expression to exert protective effects in the neuronal model of OGD/R injury.

［Key words］＼ dexmedetomidine; hypoxia-inducible factor-1alpha; oxygen glucose deprivation/reoxygenation injury; activating transcription factor 6; neuroprotection

腦卒中是一種全球發病率高、致殘率高、死亡率高的腦血管疾病［1］，其中缺血性腦卒中占85%左右［2］。缺血性腦卒中發生時腦組織供血供氧突然中斷，形成以神經元壞死為主的核心區及缺血半暗帶［3-4］。氧供應中斷和糖原消耗可引起神經功能的永久性缺陷［5］，同時也會使相應部位周圍的神經元形成低氧狀態。低氧誘導因子1α（HIF-1α）是細胞在低氧狀態下的一種轉錄因子，HIF-1α通過對其下游靶基因的調控，在血管再生、炎癥、細胞增殖分化及腫瘤生長等方面均起到重要的調節用［6］。HIF-1α的過度激活（持續高表達）可通過促凋亡途徑導致細胞死亡，抑制HIF-1α的表達可能會減輕氧糖剝奪/復氧（OGD/R）損傷［7］。右美托咪定（Dex）是近年來應用于臨床麻醉和鎮靜的新型、高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛、減輕炎癥反應和應激反應保護器官等作用［8］。已有研究表明，Dex通過抑制HIF-1α的活性在心肌疾病中起著保護作用［9］，但在神經元損傷中的作用及其機制尚不明確。本研究探討Dex能否通過抑制HIF-1α的表達降低內質網應激從而減輕OGD/R損傷所導致的皮質神經元損傷，為開發有效的OGD/R損傷治療策略提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

SPF級、孕18 d的健康SD大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養于青島大學醫學部實驗動物中心。主要試劑：Dex購自青島大學附屬醫院，用9 g/L氯化鈉溶液配制低濃度（0.1 μmol/L）和高濃度（1.0 μmol/L）的Dex溶液，置于4 ℃冰箱保存備用。細胞培養試劑neurobasal medium、B-27 Supplement、DMEM-H-Glucose、青霉素-鏈霉素（100×）、Trypsin-EDTA、HEPES-Buffer、glutaMax 100×均購自Gibco公司;胎牛血清購自四季青公司；CCK-8試劑盒購自北京Bioss生物技術有限公司；激活轉錄因子-6（ATF-6）及C/EBP同源蛋白（CHOP）購自Affinity抗體公司；β-actin購自武漢三鷹生物技術公司；HRP標記的兔來源的二抗購自北京索萊寶科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）、蛋白磷酸酶抑制劑（All-inone，100×）購自索萊寶（北京）科技有限公司；兔來源抗HIF-1α多克隆抗體、兔來源抗Map2多克隆抗體、多聚賴氨酸均購自美國CST公司；LW6、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 原代神經元培養? 取孕18 d的健康SD大鼠，脫頸處死后取出胎鼠，用體積分數0.75的乙醇消毒后置于冰上。在光學顯微鏡下剝離顱骨、腦膜，機械分離大腦皮質，暫時放在DMEM培養液中。以900 r/min離心5 min，棄掉上清，加入0.5 g/L胰蛋白酶消化20 min，加入胎牛血清培養液終止消化；以900 r/min離心5 min，棄掉上清，再加入無血清培養液（neurobasal medium 50 mL、B-27 Supplement 1 mL、gluta Max 100× 0.5 mL、青霉素-鏈霉素（100×）0.5 mL），反復緩慢吹打，濾布過濾；將細胞以1.2×105/cm2的密度接種于多聚賴氨酸包被過的培養皿和孔板中，24 h后全換液，此后每3 d半換液培養。

1.2.2? OGD/R細胞模型制備及實驗分組? 神經元培養7 d后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗２次，隨機分為Sham組（A組）、OGD/R組（B組）、OGD/R+LW6組（C組）、OGD/R+低濃度Dex組（D組）、OGD/R+高濃度Dex組（E組）。Sham組加入有糖細胞外液，置于正常培養箱中培養；ODG/R組加入無糖細胞外液，置于37 ℃厭氧箱（內含體積分數0.95的N2和體積分數0.05的CO2）中低氧處理制備OGD/R細胞模型，1 h后將培養液換為無血清培養液；OGD/R+LW6組：OGD/R模型細胞加入1 mmol/L的LW6處理1 h，加入等體積無血清DMEM培養液；OGD/R+低濃度Dex組：OGD/R模型細胞加入0.1 μmol/L Dex處理1 h后，棄去原培養液，加入等體積的無血清DMEM培養液；OGD/R+高濃度Dex組：OGD/R模型細胞加入1.0 μmol/L Dex處理1 h后，棄去原培養液，加入等體積無血清DMEM培養液。

1.2.3? CCK-8比色法檢測神經元的存活率? 棄掉96孔板中的培養液，用PBS清洗細胞，每孔加入含體積分數0.10 CCK-8的細胞培養液，避光孵育4 h。使用酶標儀檢測各孔波長450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。

1.2.4? 免疫熒光染色法檢測神經元的生長狀態

原代神經元接種于裝有蓋玻片的24孔培養板中培養7 d后，取出爬片，用PBS洗3次，每次5 min；每孔加入1 mL組織固定液固定20 min；再用PBS洗3次，每次10 min；以含體積分數0.002 5 Triton-100 溶液破膜10 min，以含體積分數0.05羊血清清蛋白封閉液封閉1 h，加入一抗MAP-2抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；然后加二抗山羊抗體IgG抗體（1∶1 000）室溫避光孵育1 h。用含DAPI染料的抗熒光衰減封片劑進行封片后，熒光顯微鏡下采集圖像，觀察原代神經元的形態。

1.2.5? Western blot方法檢測相關蛋白表達? 參照相關文獻［10］，應用Western blot方法檢測皮質神經元內HIF-1α、ATF-6和CHOP蛋白表達水平，使用100 g/L SDS PAGE分析神經元樣品。應用一抗（HIF-1α、ATF-6和CHOP 為1∶1 000，β-actin 1∶4 000）和相應二抗（1∶20 000）孵育膜，ECL 顯影成像。應用Image J軟件對數據進行量化。實驗重復3次，取平均值。

1.3? 統計學分析

使用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料結果以±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結? 果

2.1? Dex處理對OGD/R損傷后神經元存活影響

CCK-8比色法檢測顯示，各組神經元存活率差異有顯著性（F=63.46，P<0.05）；兩兩比較，B組細胞存活率較A組降低（P<0.05）， C組和E組的神經元存活率較B組顯著提高（P<0.05）。見表1。免疫熒光染色觀察顯示，與Sham組相比，OGD/R處理組神經元數目明顯減少；與OGD/R處理組相比，OGD/R+高濃度Dex處理組神經元數目明顯增加，OGD/R+低濃度Dex處理組神經元數目沒有變化。免疫熒光結果顯示，加入高濃度Dex培養后神經元的存活數目增加（圖1）。

2.2? 各組HIF-1α、ATF-6和CHOP蛋白表達比較

Western blot結果顯示，各組HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表達差異有統計學意義（F=80.30～155.36，P<0.05）。兩兩比較顯示，OGD/R處理組HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表達水平均較Sham組升高，差異有統計學意義（P<0.05），OGD/R+高濃度Dex處理組HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白水平較OGD/R處理組降低（P<0.05）。見圖2、表1。

3? 討? 論

腦卒中是世界范圍內死亡率高、致殘率高的疾病，其發病后可能給家庭及社會帶來沉重負擔。本

研究通過大鼠神經元體外模擬腦缺血再灌注損傷，探討Dex對神經損傷的保護作用及其可能的機制，從而為缺血性腦損傷治療提供新的方向。

有研究表明，Dex通過抑制HIF-1α的表達發揮神經保護作用［11］。還有研究表明，神經元OGD/R損傷后HIF-1α蛋白表達水平顯著提高［12-13］。因此本文檢測了OGD/R損傷后的神經元內HIF-1α的表達。為了進一步確定HIF-1α的下游ATF-6、CHOP的蛋白變化，本文通過對OGD/R損傷后神經元模型給予Dex 1.0 μmol/L藥物處理來觀察HIF-1α下游通路ATF-6、CHOP的蛋白變化，結果表明，Dex促進了OGD/R損傷神經元的存活并且降低了損傷后原代神經元中HIF-1α、ATF-6和CHOP蛋白的表達，表明Dex在OGD/R損傷中通過調節HIF-1α的表達發揮神經保護作用。本文研究結果還顯示，低濃度的Dex對OGD/R損傷神經元存活不具有保護作用，而高濃度的Dex提高了OGD/R損傷神經元的存活，發揮了保護作用。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成。每個亞單位都包含基本bHLH-PAS結構域，該結構域介導異源二聚和DNA結合。許多研究已經通過其轉錄活性確定了HIF-1α在細胞功能和功能障礙中的重要作用。

HIF-1α是具有轉錄活性的核蛋白，具有廣泛的靶基因譜，通過對其下游靶基因的調控，在低氧適應、炎癥發展及腫瘤生長等方面均起到重要的調節作用［14］。在OGD/R損傷下HIF-1α表達升高可導致細胞死亡［15］，抑制HIF-1α的表達則可能會減輕細胞低氧復氧損傷［16］。研究顯示，LW6是HIF-1α的抑制劑［17］，其對神經元存活可起到保護作用。因此，本實驗將OGD/R損傷+LW6組作為OGD/R的陽性藥物對照組進行研究，結果顯示LW6對正常培養的神經元存活率和HIF-1α蛋白表達沒有明顯影響，但高濃度Dex提高了OGD/R損傷神經元的存活率，也顯著降低了HIF-1α表達。

DAPI：免疫熒光染色為藍色，標記各組神經元的細胞核；Map2：一抗為羊抗兔，二抗為兔來源，免疫熒光染色為紅色，標記各組神經元形態；Merge：將DAPI和Map2合并在一起，顯示細胞存活率的變化。

ATF-6是HIF-1α的下游因子。已有研究結果顯示，腦卒中后的小鼠內質網應激（ERs）顯著增強［18］。越來越多的證據表明，ERs在神經元存活過程中起重要作用。在ERs狀態下，ATF-6可易位至細胞核并誘導下游信號蛋白CHOP的表達［19］。研究表明，ERs在神經元存活過程中起重要作用［20］，ERs信號通路包括ATF-6、IRE1α和PERK通路。藥物作用于ATF-6能夠顯著減輕細胞凋亡，降低凋亡相關的細胞因子如Caspase3、Caspase6等的表達［21］。CHOP是ERs反應共同下游信號分子，正常生理狀態下其表達量低，在ERs狀態下大量表達并促進細胞凋亡［22］。腦卒中后神經元可以通過CHOP發出信號并最終導致細胞凋亡發生。本研究結果顯示，OGD/R損傷后神經元HIF-1α蛋白表達顯著升高，LW6及高濃度Dex作用后HIF-1α、ATF-6及CHOP蛋白的表達水平顯著降低，提示抑制HIF-1α的表達可能通過抑制ERs通路減輕OGD/R損傷的神經元凋亡，發揮神經保護作用。

綜上所述，Dex對OGD/R損傷的神經元細胞具有保護作用，其機制可能通過下調HIF-1α蛋白表達抑制ATF-6、CHOP信號通路發揮神經保護作用。本文結果可以為開發有效的腦卒中治療策略提供依據。但ATF-6如何通過下游信號通路發揮神經保護作用尚不清楚，有待后續進一步研究。

［參考文獻］

［1］BOURSIN P， PATERNOTTE S， DERCY B， et al. Semantics， epidemiology and semiology of stroke［J］. Soins; La Revue De Reference Infirmiere， 2018，63（828）：24-27.

［2］MARKUS H S， BRAININ M， FISHER M. Tracking the global burden of stoke and dementia： world Stroke Day 2020［J］. International Journal of Stroke， 2020，15（8）：817-818.

［3］GU J F， CHEN J， YANG N， et al. Combination of Ligusti-

cum chuanxiong and Radix Paeoniae ameliorate focal cerebral ischemic in MCAO rats via endoplasmic reticulum stress-dependent apoptotic signaling pathway［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2016，187：313-324.

［4］MENDELSON S J， PRABHAKARAN S. Diagnosis and ma-

nagement of transient ischemic attack and acute ischemic stroke： a review［J］. JAMA， 2021，325（11）：1088-1098.

［5］PRENTICE H， GHARIBANI P M， MA Z Y， et al. Neuroprotective functions through inhibition of ER stress by taurine or taurine combination treatments in a rat stroke model［J］. Advances in Experimental Medicine and Biology， 2017，975 Pt 1：193-205.

［6］JIANG Q， GENG X K， WARREN J， et al. Hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） mediates NLRP3 inflammasome-depen-

dent-pyroptotic and apoptotic cell death following ischemic stroke［J］. Neuroscience， 2020，448：126-139.

［7］LI H S， ZHOU Y N， LI L， et al. HIF-1α protects against oxidative stress by directly targeting mitochondria［J］. Redox Biology， 2019，25：101-109.

［8］CHEN H A， LI G， TAN G， et al. Dexmedetomidine enhances hypoxia-induced cancer cell progression［J］. Experimental and Therapeutic Medicine， 2019，18（6）：4820-4828.

［9］HE Z B， SU H J， WU H T， et al. Dexmedetomidine treatment prevents cerebral ischemic reperfusion injury through HIF-1α/Beclin1-mediated autophagy［J］. Brain Injury， 2023，37（8）：706-713.

［10］CUI Y， ZHANG Y， ZHAO X L， et al. ACSL4 exacerbates ischemic stroke by promoting ferroptosis-induced brain injury and neuroinflammation［J］. Brain， Behavior， and Immunity， 2021，93：312-321.

［11］SHI J， YU T X， SONG K， et al. Dexmedetomidine ameliorates endotoxin-induced acute lung injury in vivo and in vitro by preserving mitochondrial dynamic equilibrium through the HIF-1a/HO-1 signaling pathway［J］. Redox Biology， 2021，41：101954.

［12］HU X W， LI L， GONG Y Y， et al. Buyang Huanwu Decoction promotes angiogenesis of rat brain microvascular endothelial cells after oxygen-glucose deprivation reperfusion injury via activation of PI3K-AKT signaling pathway［J］. Journal of Zhejiang University （Medical Sciences）， 2022，51（5）：544-551.

［13］WEI R H， SONG L J， MIAO Z Y， et al. Hydroxysafflor yellow A exerts neuroprotective effects via HIF-1α/BNIP3 pathway to activate neuronal autophagy after OGD/R［J］. Cells， 2022，11（23）：3726.

［14］TIRPE A A， GULEI D A， CIORTEA S M， et al. Hypoxia： overview on hypoxia-mediated mechanisms with a focus on the role of HIF genes［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2019，20（24）：6140.

［15］NI H Z， LI J X， ZHENG J Y， et al. Cardamonin attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury by activating the HIF-1α/VEGFA pathway［J］. Phytotherapy Research： PTR， 2022，36（4）：1736-1747.

［16］RUAN J X， WANG L， DAI J H， et al. Hydroxysafflor yellow a promotes angiogenesis in rat brain microvascular endothelial cells injured by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R） through SIRT1-HIF-1α-VEGFA signaling pathway［J］. Current Neurovascular Research， 2021 18（4）：415-426.

［17］XU H R， CHEN Y Q， LI Z C， et al. The hypoxia-inducible factor 1 inhibitor LW6 mediates the HIF-1α/PD-L1 axis and suppresses tumor growth of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo［J］. European Journal of Pharmacology， 2022，930：175154.

［18］YIN Y， SUN G， LI E， et al. ER stress and impaired autopha-

gy flux in neuronal degeneration and brain injury［J］. Ageing Research Reviews， 2017，34：3-14.

［19］XIA T， LIAO Y Q， LI L， et al. 4-PBA attenuates fat accumulation in cultured spotted seabass fed high-fat-diet via regulating endoplasmic reticulum stress［J］. Metabolites， 2022，12（12）：1197.

［20］REN J， BI Y G， SOWERS J R， et al. Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response in cardiovascular diseases［J］. Nature Reviews Cardiology， 2021，18（7）：499-521.

［21］WANG X H， ZHAO J， GUO H M， et al. CFLAR is a critical regulator of cerebral ischaemia-reperfusion injury through re-

gulating inflammation and endoplasmic reticulum （ER） stress［J］. Biomedecine & Pharmacotherapie， 2019，117：109155.

［22］YANG H， NIEMEIJER M， VAN DE WATER B， et al. ATF6 is a critical determinant of CHOP dynamics during the unfolded protein response［J］. iScience， 2020，23（2）：100860.

（本文編輯? 黃建鄉）