替羅非班對(duì)急性缺血性卒中小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

滿旭 韓濱 汪青青 孫錦平

［收稿日期］2023-06-01;? ［修訂日期］2023-08-21

［基金項(xiàng)目］國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1315200）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2020QH099）

［第一作者］滿旭（1995-），女，碩士研究生。

［通信作者］孫錦平（1969-），女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。E-mail：sunjinping@qdu.edu.cn。

［摘要］? 目的

探討替羅非班對(duì)急性缺血性卒中（AIS）小鼠腦梗死體積及神經(jīng)元凋亡的影響。

方法? 將65只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及替羅非班低、中、高劑量組，每組13只。采用光化學(xué)腦卒中法建立小鼠腦缺血模型。模型組尾靜脈注射相同體積的生理鹽水，替羅非班各劑量組尾靜脈注射不同劑量的替羅非班。采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（mNSS評(píng)分）評(píng)估小鼠神經(jīng)功能缺損，2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）測(cè)定小鼠腦梗死體積，TUNEL染色與NeuN染色檢測(cè)小鼠神經(jīng)元凋亡情況。

結(jié)果? 5組的mNSS評(píng)分、腦梗死體積、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量和NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.630～124.927，P<0.05）。與模型組相比，替羅非班中劑量組神經(jīng)行為損傷明顯改善、腦梗死體積下降、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量減少、NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論? 中劑量替羅非班可降低AIS小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、減小腦梗死體積及減輕神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］? 替羅非班；缺血性腦卒中；神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)；腦梗死；神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制蛋白

［中圖分類號(hào)］? R972.7;R743.3

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］? A

［文章編號(hào)］? 2096-5532（2024）01-0017-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.021

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240319.1459.004;2024-03-21? 17：37：49

Neuroprotective effects of tirofiban in mice with acute ischemic stroke

＼ MAN Xu， HAN Bin， WANG Qingqing， SUN Jinping

（Center for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Department of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the effects of tirofiban on brain infarct volume and neuronal apoptosis in mice with acute ischemic stroke （AIS）.

＼ Methods＼ Sixty-five C57BL/6 mice were randomly divided into sham group， model group， and low-dose， medium-dose， and high-dose tirofiban groups， with 13 mice in each group. Amouse model of cerebral ischemia was established through photochemical thrombosis. The model group received injection of the same volume of normal saline via the tail vein， while the tirofiban groups receivedinjection of different doses of tirofiban into the tail vein.The neurological deficits of mice were evaluated using the modified neurological severity scale （mNSS）.The brain infarct volume was measuredwith 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride staining. Neuronal apoptosis was determined with TUNEL staining and NeuN staining.

＼ Results＼ There were significant differences in the mNSS score， cerebral infarction volume， the number of TUNEL-positive cells， and the number of NeuN-positive cells between the five groups （F=9.630-124.927，P<0.05）. Compared with the model group， the medium-dose tirofiban group showed significantly resolved neurobehavioral damage， a significantly decreased cerebral infarction volume， a signi-

ficantly decreased number of TUNEL-positive cells， and a significantly increased number of NeuN-positive cells （P<0.05）.

＼ Conclusion＼ A medium dose of tirofiban can play a neuroprotective role in mice with AIS， decreasing neurological deficit score， infarct volume，and neuronal apoptosis.

［Key words］＼ tirofiban; ischemic stroke; neurobehavioral manifestations; brain infarction; neuronal apoptosis-inhibitory protein

急性缺血性卒中（AIS）病人約占所有卒中的80%［1］。AIS的病理過程涉及炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元損傷［2］。對(duì)于AIS病人，在發(fā)病后4.5 h內(nèi)，靜脈溶栓是標(biāo)準(zhǔn)治療方法［3］，可改善臨床預(yù)后并降低死亡率［4］。目前針對(duì)AIS的治療方法十分有限，迫切需要開發(fā)新療法。AIS治療的主要目標(biāo)是保護(hù)正常腦組織，促進(jìn)梗死區(qū)附近缺血半暗帶區(qū)域的功能恢復(fù)［5］。有研究表明，抗血小板藥物的使用對(duì)于AIS治療是必要的［6-7］。替羅非班是一種半衰期短的速效糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa抑制劑，可通過可逆阻斷纖維蛋白結(jié)合受體來抑制血小板聚集的最終共同途徑［8］。替羅非班在未接受早期再通治療的AIS病人中是安全有效的［9］。本研究探討不同劑量替羅非班對(duì)小鼠腦梗死體積以及缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響，為替羅非班用于AIS病人提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

雄性C57BL/6小鼠65只，體質(zhì)量為（26±2）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）購自美國(guó)Sigma公司。TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。NeuN抗體購自英國(guó)Abcam公司。驢抗兔IgG二抗購自美國(guó)Thermo Scientific公司。40 g/L多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司。鹽酸替羅非班氯化鈉注射液由魯南貝特制藥有限公司提供。制備光化學(xué)模型所需光纖冷光源儀器購自德國(guó)Schott公司。冷凍超薄切片機(jī)購自德國(guó)Leica公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 光化學(xué)卒中模型制備及實(shí)驗(yàn)分組? 采用光化學(xué)方法誘導(dǎo)血栓形成腦缺血模型［10］。將所有小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、替羅非班低劑量組（2.5 mg/kg）、替羅非班中劑量組（7.5 mg/kg）和替羅非班高劑量組（12.5 mg/kg），每組13只。光化學(xué)卒中模型建立后，假手術(shù)組注射孟加拉玫瑰紅后不光照，其余手術(shù)步驟同模型組。模型組小鼠尾靜脈注射相應(yīng)體積的生理鹽水，其余各組小鼠分別尾靜脈注射低、中、高劑量替羅非班。24 h后，每組隨機(jī)選取10只小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（mNSS評(píng)分），之后處死小鼠，測(cè)量腦梗死體積。隨后，每組取剩余的3只小鼠進(jìn)行冷凍切片標(biāo)本采集，進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

1.2.2? mNSS評(píng)分? mNSS評(píng)分范圍為0～18分，內(nèi)容主要包括運(yùn)動(dòng)測(cè)試、感覺測(cè)試、平衡木測(cè)試和反射測(cè)試［10］。mNSS評(píng)分越高，表示神經(jīng)系統(tǒng)損傷越嚴(yán)重。

1.2.3? 腦梗死體積的測(cè)定? 在光化學(xué)所致的腦缺血模型形成后24 h后采用TTC染色法對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行染色。白色區(qū)域的體積即為腦梗死體積。具體步驟如下：腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，去除小鼠顱骨后，取出腦組織放置在載玻片上，之后迅速置于-20 ℃冰箱中速凍10 min。將冷凍過的腦組織取出，沿冠狀面切成約2 mm厚的腦片。將切片置于20 g/L TTC溶液中，37 ℃下避光孵育30 min。切片每5 min翻轉(zhuǎn)一次，最后將染色完成后的腦片放置在40 g/L多聚甲醛中固定1 h，將固定好的腦片旁邊放置直尺，并進(jìn)行拍照。利用Image-Pro-Plus軟件對(duì)梗死區(qū)域進(jìn)行體積的測(cè)量，計(jì)算腦梗死體積比例。腦梗死體積比例=（總梗死體積/各腦切片體積之和）×100%。

1.2.4? TUNEL法檢測(cè)小鼠腦缺血半暗帶區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)? 光化學(xué)致腦缺血模型建立成功后24 h，麻醉小鼠后分離腦組織，腦組織在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，將腦組織轉(zhuǎn)移到含有150 g/L蔗糖水的離心管中進(jìn)行脫水，待腦組織沉入到離心管管底后，將腦組織轉(zhuǎn)移到含有300 g/L蔗糖水的離心管中進(jìn)行進(jìn)一步脫水，直至腦組織沉入管底，進(jìn)行下一步包埋。脫水后的腦組織嵌入OCT包埋，干冰快速冷凍后，使用溫度為-20 ℃的冷凍切片機(jī)將腦組織沿冠狀面切成厚度為8 μm的腦片，之后用40 g/L多聚甲醛固定腦片30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，每次10 min。加入含體積分?jǐn)?shù)0.005聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的PBS，待破膜完畢后，將腦片用PBS清洗3次。使用TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TUNEL測(cè)定。加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合物（5 μL TdT酶溶液和45 μL標(biāo)記溶液），并將所得混合物在黑暗潮濕的環(huán)境中在37 ℃下孵育1 h。用PBS洗滌3次。最后，細(xì)胞核使用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。用熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)綠色的凋亡細(xì)胞。

1.2.5? 免疫熒光染色方法檢測(cè)小鼠腦缺血半暗帶區(qū)NeuN的表達(dá)? 將-20 ℃冰箱中的腦冷凍切片復(fù)溫至室溫，多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽吐溫緩沖液洗3次，每次5 min。之后利用體積分?jǐn)?shù)0.003 Triton X-100室溫通透10 min，破膜完畢后，將腦片清洗3次。用PBS配制30 g/L的牛血清清蛋白進(jìn)行室溫封閉1 h。封閉完成后，加入NeuN一抗（1∶500），并置于4 ℃的冰箱中孵育過夜。一抗孵育完畢之后，用PBS清洗3次，每次5 min。加入熒光二抗（1∶500）后室溫避光孵育40 min。二抗孵育完成后，加入DAPI染色，抽選3個(gè)熒光顯微鏡下的視野進(jìn)行圖像分析并計(jì)算NeuN陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 各組小鼠mNSS評(píng)分比較

mNSS評(píng)分結(jié)果顯示，5組小鼠mNSS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=97.234，P<0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷（P＜0.05）；與模型組相比，替羅非班中劑量組小鼠神經(jīng)行為功能損傷減輕（P＜0.05）。見表1。

2.2? 各組小鼠腦梗死體積比較

TTC染色結(jié)果顯示，5組小鼠腦梗死體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.080，P<0.01），與模型組相比，替羅非班中劑量組小鼠腦梗死體積減小（P＜0.05）。見圖1和表1。

2.3? 各組小鼠缺血半暗帶區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較

凋亡染色結(jié)果顯示，5組小鼠缺血半暗帶區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=124.927，P<0.05）。與假手術(shù)組相比較，模型組

小鼠缺血半暗帶區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)上升（P＜0.05）；

與模型組相比，替羅非班中劑量組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。見圖2和表1。

2.4? 各組小鼠缺血半暗帶區(qū)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)的比較

免疫熒光結(jié)果顯示，5組小鼠缺血半暗帶區(qū)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.630，P<0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組、低劑量替羅非班組小鼠缺血半暗帶區(qū)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，替羅非班中劑量組的NeuN陽性細(xì)胞數(shù)顯著上升（P＜0.05）。見圖3和表1。

3? 討? 論

本研究結(jié)果顯示，替羅非班可減少腦梗死體積和神經(jīng)元凋亡，改善AIS小鼠神經(jīng)功能缺損。表明替羅非班可以保護(hù)AIS后帶來的神經(jīng)損傷，為替羅非班在AIS中的作用提供了新的見解。

替羅非班是一種高度特異性的非肽類血小板放大400倍，標(biāo)尺=100 μm。

GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，可有效阻斷血小板活化和

聚集的共同途徑［11］。在腦卒中相關(guān)治療中，給予GPⅡb/Ⅲa抑制劑可能是安全的，但是應(yīng)該注意藥物種

類和劑量［12-13］。阿昔單抗可以增加癥狀性顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)，替羅非班在低劑量下可以被認(rèn)為是安全的［14］。

與常見的雙重抗血小板治療相比較，替羅非班單藥治療AIS是安全的［15］，替羅非班治療作為未接受再通治療的AIS病人的補(bǔ)救治療，是安全有效的［16-17］。替羅非班可能是AIS治療潛在的安全選擇［18］。

有研究表明，替羅非班在大腦中動(dòng)脈阻塞24 h后可以減小小鼠腦梗死體積，但對(duì)小鼠神經(jīng)功能障礙無明顯影響［19］。而本研究結(jié)果顯示，7.5 mg/kg的替羅非班不僅可減小小鼠腦梗死體積，也降低了小鼠神經(jīng)功能障礙。腦卒中發(fā)生后，主要引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡及機(jī)體炎癥反應(yīng)。NeuN被認(rèn)為是一種成熟神經(jīng)元標(biāo)志物，是腦卒中研究中極其重要的一個(gè)指標(biāo)［20］。本研究結(jié)果顯示，替羅非班中劑量組小鼠NeuN陽性細(xì)胞數(shù)明顯上升。表明替羅非班通過降低梗死體積、減輕神經(jīng)功能損傷以及減少缺血半暗帶區(qū)NeuN陽性神經(jīng)元的丟失，在AIS中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［21］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，較高劑量（12.5 mg/kg）替羅非班可能導(dǎo)致更大的腦梗死體積。有學(xué)者提出了雙相劑量反應(yīng)和激效的概念，即在低劑量刺激下具有有益作用，高劑量會(huì)導(dǎo)致抑制甚至毒性效應(yīng)［22-23］。推測(cè)高劑量下腦梗死體積的增加可能與雙相劑量反應(yīng)和激效有關(guān)。

綜上所述，本研究在動(dòng)物水平觀察了不同劑量

替羅非班對(duì)AIS小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。替羅非班放大400倍，標(biāo)尺=100 μm。

可通過減少腦梗死體積以及減輕缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)

元凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究未能進(jìn)一步檢

測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化趨勢(shì)，也未涉及替羅非班發(fā)

揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體的分子機(jī)制及相關(guān)通路。這些內(nèi)容我們將在后續(xù)研究中進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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（本文編輯? 周曉彬）

醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)論文討論的寫作

討論是學(xué)術(shù)論文的重要組成部分，是結(jié)果的展開、延伸和升華，是作者表達(dá)個(gè)人見解、闡述學(xué)術(shù)思想把實(shí)驗(yàn)結(jié)果提高到理論高度的部分。討論的目的主要是回答“研究出什么？”的問題，是論述本文在選題、方法、結(jié)果等方面與過去文獻(xiàn)比較的異同和優(yōu)劣，并從中引出新的觀點(diǎn)、結(jié)論，探求新的規(guī)律。討論部分可反映作者對(duì)研究的認(rèn)識(shí)水平。討論的主要內(nèi)容包括與該研究相關(guān)的理論闡述、理論意義和實(shí)踐意義評(píng)價(jià)、研究進(jìn)展和遺留問題等。國(guó)際醫(yī)學(xué)期刊編輯委員會(huì)（ICMJE）發(fā)布的《向生物醫(yī)學(xué)期刊投稿的統(tǒng)一要求》對(duì)討論部分的書寫作了統(tǒng)一要求，主要可歸納為以下5點(diǎn)：①應(yīng)強(qiáng)調(diào)指出研究獲得的新的重要結(jié)果和結(jié)論，不要重復(fù)引言和結(jié)果部分內(nèi)容；②應(yīng)說明研究的價(jià)值和局限性，如有其他相關(guān)研究，應(yīng)闡述其間的關(guān)聯(lián)；③要與研究的目的結(jié)合起來討論，避免妄下研究結(jié)果不支持的結(jié)論；④除非做了經(jīng)濟(jì)學(xué)分析，一般不應(yīng)下成本、效益方面的結(jié)論；⑤要避免強(qiáng)調(diào)和暗示尚未完成的工作的重要性，如果有把握，可以提出新的假設(shè)和建議。寫作時(shí)要圍繞結(jié)果內(nèi)容進(jìn)行論述，必須緊扣主題，把結(jié)論與結(jié)果分開，切忌推理過分外延，要大量查閱有關(guān)文獻(xiàn)，以及堅(jiān)持一分為二的觀點(diǎn)。