腦小血管病血漿外泌體miRNA差異表達及其意義

王錚 王源 馬愛軍

［收稿日期］2023-03-08;? ［修訂日期］2023-05-22

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81971111）

［第一作者］王錚（1995-），男，碩士研究生。

［通信作者］馬愛軍（1971-），女，博士，主任醫師，博士生導師。E-mail：drmaj@qdu.edu.cn。

［摘要］? 目的

探討血漿外泌體miRNA在腦小血管病（CSVD）病人中的表達譜及臨床應用價值。

方法? 選擇CVSD病人66例和健康體檢者66例血液標本，分離血漿外泌體；隨機選取其中16例CVSD病人和16例健康對照者血漿外泌體進行基因芯片檢測構建差異表達的miRNA文庫，對132例樣本行PCR以檢驗測序結果。進行GO富集分析和KEGG分析。

結果? 基因芯片測序顯示，CVSD病人血漿外泌體中差異表達的miRNA共有38個，其中上調表達18個，下調表達20個。與健康對照者相比，miR-498、miR-320e、miR-6776、miR-455表達明顯下調。實時熒光定量PCR驗證結果與基因芯片結果一致。CVSD病人血漿外泌體miR-320e的表達水平較健康對照組顯著下調，差異有統計學意義（t=4.661，P<0.001）。生物信息學分析表明，差異表達的miRNA的靶基因參與了細胞凋亡、阿爾茨海默病、FoxO信號通路、Wnt信號通路等生物學過程。

結論? CVSD病人血漿外泌體miRNA表達譜與健康對照者存在明顯差異，miRNA可能通過靶基因及生物信號通路的調控作用參與了CVSD的發生與發展。

［關鍵詞］? 腦血管障礙；外泌體；微RNAs；生物標記；基因組學

［中圖分類號］? R743.9

［文獻標志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2024）01-0033-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.033

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240329.0927.002;2024-04-01? 12：08：22

Differentially expressed plasma exosomal miRNAs and their significance in patients with cerebral small vascular disease

＼ WANG Zheng， WANG Yuan， MA Aijun

＼ （Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266001， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the expression profile of plasma exosomal miRNAs and their application value in patients with cerebral small vascular disease （CSVD）.

＼ Methods＼ Blood samples were collected from 66 patients with CVSD and 66 healthy controls， and then plasma exosomes were isolated. Plasma exosomes were randomly selected from 16 patients with CVSD and 16 healthy controls， and gene microarray was used to construct a library of differentially expressed miRNAs. PCR was performed for all 132 samples to verify the results of sequencing. Gene ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis were performed.

＼ Results＼ Gene microarray showed a total of 38 differentially expressed miRNAs in plasma exosomes of CVSD patients， among which 18 were upregulated and 20 were downregulated. Compared with the healthy control group， the patients with CVSD had significantly downregulated miR-498， miR320e， miR-6776， and miR-455. The results of quantitative real-time PCR were consistent with gene microarray results. The patients with CVSD had a significantly downregulated expression level of plasma exosomal miR-320e compared with the healthy control group （t=4.661，P<0.001）. The bioinformatics analysis showed that the target genes of differentially expressed miRNAs were involved in the biological processes including cell apoptosis， Alzheimers disease， the FoxO signaling pathway， and the Wnt signaling pathway.

＼ Conclusion＼ There is a significant difference in the expression profile of plasma exosomal miRNAs between CVSD patients and healthy controls， and miRNAs may be involved in the development and progression of CVSD through the regulation of target genes and biological signaling pathways.

［Key words］＼ cerebrovascular disorders; exosomes; microRNAs; biomarkers; genomics

腦小血管病（CSVD）是由各種病因引起的影響腦內小動脈、微動脈、毛細血管、微靜脈和小靜脈所致的一系列臨床、影像、病理綜合征，占缺血性卒中的25%～30%，是一類臨床常見的腦血管疾病。衰老、高血壓病史和總膽固醇水平升高是CSVD的獨立危險因素［1-2］，常規降壓、調脂、抗血小板聚集治療均無法有效改善病人的認知及運動功能損害［3-4］。由于CSVD起病隱匿、機制復雜、臨床表現多樣，因此迫切需要尋找靈敏度、特異度較高的檢測標志物提高其診療水平。微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，其長度在20 nt左右，通過與靶基因的3′非編碼區相結合，以轉錄后修飾的方式發揮對下游通路的調控作用，參與多種疾病的進程［5-6］。外泌體是直徑在40～100 nm之間、表面含有典型標記蛋白的一類細胞外囊泡［5］，細胞外miRNA可以富集在外泌體中且受其表面膜的保護而具有很好的穩定性，外泌體包裹的miRNA能影響靶細胞的生物學功能和細胞行為［7］。本研究對CSVD病人外泌體miRNA表達譜進行檢測，并進行生物信息學分析，探討其功能。

1? 資料與方法

1.1? 對象及分組

收集2017年1月—2019年1月我院收治66例CVSD病人（CVSD組）和66例健康體檢者（對照組）的血液標本。CVSD病人診斷符合頭顱影像學上腦損傷的間接征象血管變化的神經影像學報告標準［8］：①MRI表現為血管源性腔隙、血管源性白質高信號、腦微出血和血管周圍間隙擴大>2 mm和腦萎縮；②發病時伴有頭昏、疲乏、認知改變等臨床癥狀；③年齡>40歲。排除標準：①明確診斷為心腦血管疾病及嚴重的頭頸大動脈狹窄、動脈硬化，腦MRI檢查不全者；②血液系統疾病或腫瘤者；③嚴重肝腎功能不全者。

1.2? 標本采集與處理

分別采集病人和健康體檢者清晨空腹靜脈血，裝入15 mL離心管中，4 ℃條件下、1.68×106 r/min離心10 min后，吸取上層淡黃色血漿，加入 PBS 至10 mL體積，4 ℃條件下、1.12×106 r/min離心10 min，棄去管底沉渣，留取上層血漿，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3? 外泌體提取

實驗使用蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific 4485229）以及Total Exosome Precipitation Reagent（REF4484451，Thermo Fisher Scientific公司）試劑盒提取外泌體。按照試劑盒說明書方法進行操作。得到外泌體溶液，立即進行下一步操作或者-80 ℃冰箱保存備用。

1.4? 外泌體鑒定

使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態，納米顆粒追蹤分析技術對所分離的外泌體進行質量鑒定。對外泌體表面蛋白質進行檢驗。

1.5? Western blot法檢測外泌體膜蛋白

將外泌體溶液解凍后取100 μL加入RIPA裂解液，使用BCA試劑盒測蛋白濃度。將蛋白樣品加

入SDS-PAGE（ACE）膠的凹槽中，對蛋白質進行電泳分離，電泳結束后將蛋白轉移到 PVDF膜上，用含有50 g/L脫脂牛奶的TBST 溶液在室溫下封閉1 h，分別加入CD9、CD63、TSG101 和 GAPDH 一抗，在搖床上振蕩培養1 h，置-4 ℃冰箱中過夜。第2天室溫復溫后先用TBST 溶液清洗PVDF膜3次，每次10 min，然后加入酶標二抗室溫孵育2 h，再次用TBST 溶液清洗3次，最后使用 ECL化學發光試劑盒進行顯影，獲取蛋白條帶圖。

1.6? 外泌體RNA的提取

使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）（Cat. No.217184）試劑盒提取總RNA。將凍存的外泌體溶液融化后，取100 μL加入TRIzol 500 μL 裂解，室溫孵育5 min。加入100 μL氯仿渦旋振蕩后，在室溫下孵育3 min。隨后按試劑盒說明書方法進行操作，提取RNA。

1.7? 構建RNA文庫

miRNA文庫的構建由上海吉凱基因醫學科技公司協助，使用Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 （miRNA表達譜芯片，100 format，902446） 完成。采取每4人一組混檢的方式，CVSD組與對照組每組隨機選取16例進行檢測。

1.8? 差異表達RNA的驗證

根據基因芯片結果，選擇4個差異表達倍數（FC）>1.5、P<0.05的miRNA （miR-320e、miR-498、miR-455、miR-6776）進行驗證。采用MiR-X miRNA First-Stand Synthesis Kit（Cat#638313）試劑盒，對 1.3 中提取的細胞總RNA進行反轉錄，得到 cDNA，用其作為模板進行熒光定量PCR反應。PCR反應引物及其序列見表1。選用RNU6基因作為內參，使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNAseH Plus）（Cat#RR820A）SYBR Green熒光染料法，以cDNA為模板，在PCR擴增儀上進行擴增。按試劑盒說明書方法進行操作和程序設定，循環數50個，結果以2-△△Ct表示。

1.9? 靶基因的預測及功能分析

通過TargetScan網站（https：//www.targetscan.org）、RNACentral（https：//rnacentral.org）、TarBase V.8（https：//dianalab.e-ce.uth.gr）在線預測miRNA靶基因，利用Metascape對靶基因進行GO分析和KEGG生物信息學分析，顯示miRNA的靶基因參與的生物學過程。

1.10? 統計學分析

使用SPSS 21.0和Graphpad軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。使用Graphpad、TBools［9］、Metascape［10］軟件繪圖。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2? 結? 果

2.1? 兩組一般資料比較

CVSD病人66例中，男38例，女28例；年齡43～87歲，平均（66.46±10.52）歲；其中高血壓26例，糖尿病9例。對照組66例中，男36例，女30例；年齡47～85歲，平均（63.90±11.63）歲；高血壓21例，糖尿病7例。CVSD組與對照組一般臨床資料比較，差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.2? 外泌體形態

透射電鏡觀察顯示，外泌體形態呈圓形或橢圓形，直徑30～150 nm（圖1A）。Western blot檢測顯示，外泌體膜表達標志蛋白CD9、CD63、TSG101（圖1B）。

2.3? 兩組血漿外泌體miRNA的差異表達

血漿外泌體中miRNA基因芯片檢測結果顯示，與對照組相比，CVSD組血漿外泌體中差異表達的miRNA共有38個（FC>1.5，P<0.05），其中表達上調18個，表達下調20個（圖2A、B），其分布熱圖見圖2C。

2.4? 差異表達miRNA的PCR驗證

對篩選出的差異表達miRNA在66例CVSD病人及66例對照者中進行qPCR驗證，驗證結果與基因芯片趨勢一致，其中CVSD病人血漿外泌體miR-320e、miR-498的表達水平較對照組明顯下調，差異具有統計學意義（t=4.661、2.145，P<0.05）。見表3。

2.5? 靶基因GO分析與KEGG分析

對差異表達miRNA的靶基因進行預測和生物信息學分析結果顯示，KEGG主要富集于代謝通路、PI3K/Akt信號通路、FoxO信號通路、Wnt信號通路、凋亡通路和阿爾茨海默病相關通路（圖3）。GO富集分析顯示，排前10位的生物信息學過程分別為Rho GTP酶參與的信號傳導（Rho GTPases、Miro GTPases 和 RHOBTB3 信號轉導）、肌動蛋白細胞骨架組織（actin cytoskeleton organization）、腦源性神經營養因子信號通路（BDNF signaling pathway）、細胞對壓力反應的調節（regulation of cellular response to stress）、衰老（aging）、細胞分裂（cell division）、細胞凋亡（apoptosis）、內膜系統構建（endomembrane system organization）（圖4）。

通過Metascape網站（https：//metascape.org）基于STRING6、BioGrid7、OmniPath8、InWeb_IM9數據庫進行分析，得到了蛋白-蛋白互相作用（PPI）網絡圖（圖5A）。在PPT網絡中，通過MCODE算法進行量化評估得出3組分值最高的PPI過程，它們分別為多途徑神經退行性變（Pathways of neuro-

3? 討? 論

CVSD的發生與發展是一個多因素、多機制參與的過程，隨著衰老的自然發生和各種血管危險因素的侵襲，

如高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白升高［11］

和氧化應激，顱內血管的功能逐漸下降，結構完整性

也逐漸喪失。由于神經-血管耦聯現象的存在，參與耦聯的任何環節發生的功能紊亂都將導致更廣泛的病理改變和臨床癥狀［12］。CVSD通常隱匿進展，多數患有CVSD的病人通常在發生腦出血或梗死、認知能力下降等后果時才被發現［13-14］。目前研究已經證明，miRNA可以通過靶向調控mRNA表達而調控血管新生和成熟［1］、維持血管壁完整性［2］、調控細胞行使各種功能［3］。RNA、DNA、蛋白質、脂質可以被包裹在外泌體中進行傳遞并且不會引發自身免疫反應［6］。

人們可以通過外泌體內容物的選擇性包裹或工程化外泌體膜，從診斷和治療等多個角度對外泌體加以利用［15］。

目前，關于外泌體和miRNA及其靶基因在CVSD中作用機制尚不清楚。本研究基因芯片測序結果顯示，CVSD病人血漿外泌體中差異表達的miRNA共有38個，表達上調18個，表達下調20個，其中miR-668-5p、miR-498、miR-320e等出現了明顯下調，miR-6089、miR-3665、miR-4466等出現了顯著上調。miR-320e的靶基因HES2受抑制可以導致Notch信號通路介導的平滑肌細胞遷移受到抑制，從而干擾血管重塑［16］。ORMDL1基因被認為是鞘脂生物發生的關鍵負調節因子，是miR-320e的靶基因之一。ORMDL1基因異常將導致嚴重的脫髓鞘和炎癥過程［17-18］。Wnt基因是miR-320e的靶點之一，Wnt/β-Catenin表達上調有利于腦損傷后血管修復過程［19］，調節血管新生和血-腦脊液屏障成熟［20］，但持續的Wnt/β-Catenin激活也會導致白質病變和中樞系統炎癥損傷［21-22］，抑制Wnt/β-catenin信號通路有利于抑制帕金森病模型中成神經細胞瘤的進展和減弱軸突變性［23］。因此我們推測，miR-320e可能通過靶向Wnt/β-Catenin信號通路發揮疾病保護作用。外泌體miR-498可以靶向抑制Prdx4過氧化物酶，Prdx4升高能引起顯著增強的IL-1β依賴性炎癥反應［24］，miR-498下調可能促進CVSD的進展；miR-320e和miR-498顯著下調可能導致其對相應靶基因的轉錄后抑制作用缺失，而抑制缺失可能產生的病理改變與已知的CVSD的病理改變相一致。此外，差異表達文庫中表達上調的miR-6087通過靶基因調節神經元凋亡［25］。miR-6087的靶蛋白RhoG的降解或缺失會導致血小板功能的改變是微血管血栓形成的一個影響因素［26］。

生物信息學分析結果顯示，KEGG顯著富集到細胞代謝通路、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、Wnt信號通路、細胞凋亡、阿爾茨海默病；GO富集顯示，上述差異表達的miRNA的靶基因廣泛地參與了細胞對壓力反應的調節、衰老、細胞分裂、細胞凋亡、內膜系統構建，這些生物學過程與CVSD的血管壁破壞、血-腦脊液屏障破壞、膠質細胞凋亡、白質病變的發生和進展均相關，這與已知的CVSD病理改變相符。

PPI圖可展示通過異構、修飾等作用發生物理結合的蛋白質，每個節點代表相應生物學過程，節點越大，表明參與該生物學過程的蛋白質越多。本文PPI網絡分析顯示，CCT2、RPS19、OYNLL2、CDK6相互聯系，并且是與其他蛋白連接的核心蛋白。伴侶蛋白CCT2是一種自噬受體，可調節細胞內聚集蛋白的清除過程，其下調會導致血管內皮細胞損傷。血管內皮細胞損傷將破壞腦血管系統的完整性，造成動脈血管僵硬、自主神經失調、神經-血管解耦聯和血-腦脊液屏障損傷，破壞腦血流和局部灌注的動態平衡，進而促進CVSD的發生和進展。

綜上所述，CVSD病人血漿外泌體miRNA表達譜存在差異，差異表達譜中miRNA通過其靶基因發揮維持血管結構完整性、調節小血管功能和調控神經細胞功能的作用，從而可能在CVSD中發揮調控作用。多個miRNA可能聯合發揮作用，miR-320e、miR-498的下調和miR-6087、miR-3960的上調可能促進CVSD的進展，這些miRNA如何參與CVSD的機制目前尚不清楚。本研究的不足之處：未對CVSD病人近期皮質下小梗死、腔隙、微出血、腦萎縮、認知功能障礙等臨床表現分型的miRNA差異表達譜進行進一步分類檢測。今后研究將擴大樣本量進一步對本文結論進行驗證，并深入探討差異表達miRNA調控的下游基因在CVSD發生發展中的分子機制。

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（本文編輯? 黃建鄉）