EBV相關(guān)腫瘤和健康人群BALF2基因序列分析

于彩霞 趙夢(mèng)鶴 肖華 王云 劉雯

［收稿日期］2022-12-24;? ［修訂日期］2023-06-11

［基金項(xiàng)目］山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2020MH302）

［第一作者］于彩霞（1996-），女，碩士研究生。

［通信作者］劉雯（1985-），女，博士，講師。E-mail：liu.wen@hotmail.com。

［摘要］? 目的

探討B(tài)ALF2基因的多態(tài)性及其分布特征與EB病毒（EBV）相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

方法

采用巢式PCR結(jié)合DNA測(cè)序的方法，對(duì)349例EBV陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行DNA序列分析，利用Lasergene軟件將其與EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8序列進(jìn)行比對(duì)，并生成系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，對(duì)基因變異型進(jìn)行分類。

結(jié)果? 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)將BALF2分為5個(gè)基因型BALF2-A、BALF2-B、BALF2-C、BALF2-D和BALF2-E。其中，BALF2-E在鼻咽癌中的檢出率高于健康人群，中國(guó)南方鼻咽癌人群BALF2-E的檢出率高于北方鼻咽癌人群（χ2=10.26，P<0.01）。

結(jié)論

BALF2基因存在多態(tài)性，其變異類型分布與腫瘤類型、地域有關(guān)，BALF2-E亞型與鼻咽癌發(fā)生相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］? 皰疹病毒4型，人；多態(tài)性，單核苷酸；淋巴瘤；胃腫瘤；鼻咽癌

［中圖分類號(hào)］? R373.9;R394.25

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］? A

［文章編號(hào)］? 2096-5532（2024）01-0067-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.027

［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240326.1140.002;2024-03-28? 17：25：55

Sequence analysis of BALF2 gene in people with EBV-associated tumors and healthy people

＼ YU Caixia， ZHAO Menghe， XIAO Hua， WANG Yun， LIU Wen

＼ （Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the polymorphism of the BALF2 gene and its distribution characteristics and its relationship with the development and progression of Epstein-Barr virus （EBV）-associated tumors.

＼ Methods＼ DNA sequence analysis was performed on 349 EBV-positive specimens using nested PCR and DNA sequencing. Lasergene software was used for sequence alignment of them with the standard EBV strain B95-8 to derive a phylogenetic tree for classification of gene variants.

＼ Results

According to the phylogenetic tree， there were five BALF2 genotypes： BALF2-A， BALF2-B， BALF2-C， BALF2-D， and BALF2-E. The detection rate of BALF2-E was higher in people with nasopharyngeal carcinoma than in healthy people， and higher in southern people with nasopharyngeal carcinoma than in northern people with this disease in China （χ2=10.26，P<0.01）.

＼ Conclusion＼ The BALF2 gene is polymorphic， and the distribution of its variants is associated with tumor types and geographic regions. The BALF2-E variant is related to the development of nasopharyngeal carcinoma， especially in the high-incidence areas.

［Key words］＼ herpesvirus 4， human; polymorphism， single nucleotide; lymphoma; stomach neoplasms; nasopharyngeal carcinoma

EB病毒（EBV）屬于皰疹病毒科（γ皰疹病毒亞科），廣泛分布于世界各地，世界上超過(guò)90%的人口是EBV攜帶者［1］。EBV感染與上皮惡性腫瘤密切相關(guān)，這些腫瘤包括鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻部NK/T細(xì)胞淋巴瘤［2-6］。感染早期基因BALF2在病毒DNA復(fù)制過(guò)程中高度集中于復(fù)制小體，并在裂解復(fù)制過(guò)程中大量地表達(dá)［7］。當(dāng)DNAase在病毒體內(nèi)與BALF2編碼的分子量135 000大小DNA結(jié)合蛋白（mDBP）結(jié)合時(shí)，核酸外切酶的活性受到抑制，這可能是病毒DNA合成過(guò)程中保護(hù)DNA免受病毒DNA酶攻擊的病毒自我保護(hù)機(jī)制［8］。mDBP在不同的皰疹病毒株中具有結(jié)構(gòu)保守性，并且對(duì)于已知皰疹病毒例如EBV的裂解復(fù)制是絕對(duì)必需的［9］。鼻咽癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的區(qū)域性［10］，原因尚不清楚。研究表明，不同來(lái)源的EBV毒株具有不同的基因變異，這可能在EBV感染和致病過(guò)程中起重要作用。以往對(duì)EBV潛伏期基因多態(tài)性的研究表明，病毒基因變異具有疾病特異性，如EBER變異體EB-8M在鼻咽癌中起主導(dǎo)作用，且其地理分布存在差異［11］。近期有研究發(fā)現(xiàn)，BALF2基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)a162476g和g163364a與鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)［12］。為進(jìn)一步研究BZLF2單核苷酸多態(tài)性（SNP）與EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生的關(guān)系，本研究對(duì)359例中國(guó)南、北方地區(qū)的EBV相關(guān)性胃癌（EBVaGC）、淋巴瘤、鼻咽癌以及健康人群咽漱液（TW）樣本進(jìn)行了EBV BALF2基因的序列分析。

1? 材料與方法

1.1? 樣本和DNA提取

本研究共有349例EBV陽(yáng)性標(biāo)本BALF2基因測(cè)序成功，其中50例EBVaGC、77例鼻咽癌、55例淋巴瘤以及47例健康人群TW樣本來(lái)自青島大學(xué)附屬醫(yī)院；另一部分樣本包括EBVaGC 4例、鼻咽癌50例、淋巴瘤20例以及46例健康人群TW樣本來(lái)自中國(guó)南方鼻咽癌流行區(qū)，主要由廣東省中山大學(xué)第一、第三附屬醫(yī)院提供。根據(jù)樣本的區(qū)域來(lái)源和腫瘤類型對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分組并命名：北部EBV相關(guān)胃癌（NG），北部淋巴瘤（NL），北部鼻咽癌（NN），北部健康人群TW樣本（NT）；南部EBV相關(guān)胃癌（SG），南部淋巴瘤（SL），南部鼻咽癌（SN），南部健康人群TW樣本（ST）。本研究經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均知情同意。本研究中EBV陽(yáng)性相關(guān)腫瘤標(biāo)本均經(jīng)EBV編碼的小RNA 1（EBER-1）原位雜交鑒定，腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)EBER-1陽(yáng)性信號(hào)為EBV陽(yáng)性樣本［13］。

采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿方法和蛋白酶K消化方法從新鮮腫瘤組織（胃癌組織）和TW樣品中提取DNA。使用QIAamp DNA FFPE組織提取試劑盒（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）從石蠟包埋腫瘤組織（鼻咽癌和淋巴瘤組織）中提取DNA。將提取的DNA -20 ℃保存直至實(shí)驗(yàn)完成。

1.2? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增

采用巢式PCR法擴(kuò)增BALF2的特定區(qū)域，該區(qū)域由兩部分組成：第一部分是核苷酸162145-162562，用于擴(kuò)增的引物是BALF2-1～BALF2-8；第二部分是核苷酸163111-163508，用于擴(kuò)增的引物是BALF2-5～BALF2-4。引物及其序列見(jiàn)表1。第一次PCR的總體積為10 μL，其中包括：DNA提取物2 μL（100 μg/L），上游引物和下游引物各0.5 μL，1×Accurate Taq Master Mix（Accurate Biotechnology，AG11019）5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、 55 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸2 min。取第一次擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL為模板，進(jìn)行第二次PCR，總體積為20 μL，其中包括：DNA提取物2 μL（100 mg/L），上游引物和下游引物各1 μL，1×Accurate Taq Master Mix（Accurate Biotechnology，AG11019）10 μL。第二次擴(kuò)增條件與第一次擴(kuò)增條件相同。每次PCR均設(shè)置EBV陽(yáng)性細(xì)胞B95-8為陽(yáng)性對(duì)照，EBV陰性細(xì)胞Jurkat為陰性對(duì)照，以及空白對(duì)照。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，最終產(chǎn)物大小分別為418 bp和398 bp。使用Lasergene軟件將其剪接成816 bp的片段。

1.3? PCR產(chǎn)物的序列分析

取上述PCR產(chǎn)物25 μL送往北京華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序。獲得序列信息后，用Chromas軟件查看峰圖，Lasergene軟件中的Clastal W對(duì)基因序列與EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8序列進(jìn)行對(duì)比分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)［14］，對(duì)基因變異型進(jìn)行分類。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? BALF2基因序列變異分析

對(duì)349例EBV陽(yáng)性樣本進(jìn)行BALF2測(cè)序及多態(tài)性分析顯示，所有標(biāo)本的測(cè)序峰圖中同一核苷酸位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)雙峰，均為單一BALF2序列。與B95-8參考序列相比較，在349例樣本中鑒定出43個(gè)代表性核苷酸序列（圖1）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，將其分為5種亞型BALF2-A、BALF2-B、BALF2-C、BALF2-D和BALF2-E。見(jiàn)圖2。

本文33例樣本的核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8的核苷酸序列一致，其中包括2例NT、26例ST、4例SN和1例SL。ST4中發(fā)現(xiàn)一個(gè)氨基酸突變（S647R），SN35中發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義突變（g162246a）。96例樣本（18例NT、25例NG、28例NN、19例NL、3例ST、2例SN、1例SL）中只有一個(gè)同義突變（g162273a）。以上這些與B95-8標(biāo)準(zhǔn)株具有相同BALF2氨基酸序列或者散在突變的分離株被稱為BALF2-A。

本文97例樣本中同時(shí)有4個(gè)共有同義突變c163293t、t163377c、a163458g、a163482c，包括18例NT、20例NG、12例NN、20例NL、7例ST、1例SG、5例SN以及14例SL，上述分離株被歸類為BALF2-B。

本文在7例樣本中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)同義突變a163458g、a163482c，其中5例鼻咽癌存在一個(gè)共有同義突變c163464t，其中1例來(lái)自中國(guó)南方，4例來(lái)自中國(guó)北方。這7個(gè)樣本被認(rèn)為是BALF2-C型。

另外，在18例樣本中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)散在無(wú)規(guī)律突變，包括g162215t、g162237c、c162464t、a162476g、g162507a、c163287t、c163293t、g163364a、t163377c、g163404t、c163464t，其中的3個(gè)突變位點(diǎn)g162215t、a162476g以及g163364a具有氨基酸的改變，包括V317M，I613V和V700L，其余突變位點(diǎn)是同義突變。這18個(gè)樣本序列被命名為BALF2-D。

在89例標(biāo)本中檢測(cè)到同時(shí)存在的3個(gè)同義突變t163377c、a163458g、a163482c，NT 3例、NG 2例、NN 30例、NL 9例、ST 5例、SG 3例、SN 34例、SL 3例。其中78例樣本存在另外3個(gè)同義突變c163287t、g163404t、c163422a，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，將它們統(tǒng)一分類到同一簇中并將其稱為BALF2-E。

2.2? 中國(guó)南方和北方樣本中BALF2變異型分布

不同地區(qū)EBVaGC病人、鼻咽癌病人、淋巴瘤病人和TW中5種不同BALF2基因型的頻率見(jiàn)表2。NG、NN、NL和NT中BALF2-E的頻率分別為4.00%、38.96%、16.36%和6.38%，SG、SN、SL和ST中BALF2-E的頻率分別為75.00%、68.00%、15.00%和10.87%，SN病人的BALF2-E檢出率高于NN病人（χ2=10.26，P<0.01）。

BALF2-A在NN和NL中的頻率分別為37.66%

和40.00%，在SN和SL中的頻率分別為14.00%和10.00%。NN組BALF2-A的檢出率高于SN組（χ2=8.357，P<0.01），NL組高于SL組（χ2=6.066，P<0.05）。NT和SL病人的BALF2-B檢出率明顯高于ST和NL病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.301、6.696，P<0.01），提示淋巴瘤和健康人

群中BALF2-B檢出在北方和南方地區(qū)有顯著差異。

2.3? BALF2在惡性腫瘤和健康人群中的變異型分布比較

BALF2基因型在中國(guó)南北部地區(qū)EBVaGC、鼻咽癌、淋巴瘤和健康對(duì)照中的分布比較顯示，NN與健康對(duì)照中BALF2-E分布差異有顯著性（χ2=15.860，P<0.001），而淋巴瘤、EBVaGC與健康人群中BALF2-E的分布差異無(wú)顯著性（P＞0.05），來(lái)自南方的樣本顯示出相同的變異模式。對(duì)淋巴瘤、EBVaGC、鼻咽癌和健康人群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)南方健康人群BALF2-A的檢出率高于淋巴瘤、鼻咽癌（χ2=17.016、26.533，P<0.01）。中國(guó)北方地區(qū)健康人群BALF2-B檢出率明顯高于鼻咽癌（χ2=26.533，P<0.01）。南方地區(qū)健康對(duì)照組BALF2-B的檢出率低于淋巴瘤（χ2=19.283，P<0.01）。在中國(guó)北方，鼻咽癌BALF2-C檢出率高于EBVaGC（χ2=15.860，P<0.01）。見(jiàn)表2。

3? 討? 論

對(duì)于BALF2基因，以往文獻(xiàn)顯示其a162476g

和c163464t位點(diǎn)突變見(jiàn)于80.00%以上的鼻咽癌樣本［12］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)淋巴瘤和EBVaGC分析結(jié)果未發(fā)

現(xiàn)a162476g和g163364a突變與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了V341I、V344I和Y619N氨基酸變異，但變異只存在于少數(shù)樣本中。3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)g162273a、a163458g和a163482c均未在既往研究中發(fā)現(xiàn)。在193例樣本中檢測(cè)到a163458g和a163482c的聯(lián)合突變，這兩個(gè)同義突變同時(shí)存在于BALF2-B、BALF2-C和BALF2-E中。因此，推測(cè)BALF2蛋白的第277位和第285位氨基酸可能具有一定的相關(guān)性。還需要進(jìn)一步研究。

有研究表明，EBV編碼的LMP1基因變異與EBVaGC、淋巴瘤和鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人與正常人群中EBV編碼的LMP1基因檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但存在區(qū)域相關(guān)性。因此，EBV編碼基因變異是僅存在區(qū)域差異還是參與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生仍存在爭(zhēng)議。本研究結(jié)果顯示，BALF2的基因型在中國(guó)南北部地區(qū)的分布是不同的，南方地區(qū)鼻咽癌BALF2-E檢出率高于北方地區(qū)；在中國(guó)南方樣本中，EBV相關(guān)腫瘤和健康對(duì)照組的BALF2基因型差異也有顯著性；SN病人BALF2-E檢出率顯著高于健康對(duì)照。推測(cè)BALF2-E可能是鼻咽癌的危險(xiǎn)因素，尤其與南方鼻咽癌相關(guān)。本文由于南方EBVaGC樣本數(shù)量較少，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)一步分析，這是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)缺陷。然而，本研究結(jié)果仍可為BALF2基因多態(tài)性的區(qū)域性分布提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

鼻咽癌等EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生與EBV感染密切相關(guān)，但華南地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率明顯高于華北地區(qū)，這可能受到環(huán)境等多種因素的影響［15］。本文研究結(jié)果顯示，中國(guó)NN中BALF2-E基因型檢出率顯著高于健康對(duì)照組，南方地區(qū)鼻咽癌病人中該基因型的檢出率也顯著高于北方地區(qū)鼻咽癌病人。因此，BALF2基因型分布特征可能與環(huán)境、飲食因素一起導(dǎo)致南方地區(qū)鼻咽癌的高發(fā)病率。然而，由于本研究?jī)H限于BALF2基因多態(tài)性分析，需要進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和相關(guān)信號(hào)通路，以闡明BALF2基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上所述，BALF2在我國(guó)南北方EBV陽(yáng)性腫瘤樣本和EBV陽(yáng)性TW樣本中分為5種基因型，BALF2基因多態(tài)性分布具有地區(qū)特異性。南北方地區(qū)鼻咽癌組織中BALF2-E的檢出率明顯高于健康對(duì)照組，這可能與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

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（本文編輯? 黃建鄉(xiāng)）