復方參及合劑對小鼠抗缺氧及疲勞的作用研究

李 萌，阿麗古麗·買買提依明，李建瑛，李 葉，李 倩，王 瑞，尹東鋒△

（1. 中國人民解放軍新疆軍區總醫院，新疆 烏魯木齊 830000； 2. 新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830000）

缺氧是組織細胞供氧不足或氧化過程障礙導致其代謝功能和形態結構異常引起的氧化應激損傷、穩態失衡等一系列問題［1］。疲勞是在特殊環境下，因長時間的體力、腦力勞動，乳酸（LA）及其代謝物堆積引起的能量消耗、運動耐力下降、工作效率降低的生理學現象［2］。研究顯示，復方中藥制劑療效穩定、副作用少、在機體抗缺氧及疲勞方面具有顯著優勢。人參皂苷能改善氧化應激、炎癥、缺氧損傷、能量代謝等［3］，丹參提取物具有抑制細胞增殖、保護臟器組織等作用［4］，本課題組前期將兩者組合制成復方雙參合劑，研究證明其具有顯著的抗缺氧及疲勞作用［5］。肉蓯蓉始載于《神農本草經》，具有抗衰老、抗疲勞、抗缺血、免疫調節、肝臟保護等藥理作用［6-7］，其主要成分苯乙醇苷具有抗氧化應激、維持細胞內鈣穩定［8］、保護肝臟和免疫調節等作用［9］。《中華本草-維吾爾藥卷》中記載，歐白及具有滋補心、肝、腦組織，強筋健肌、補血養發等作用。本研究中以丹參、人參為君藥，肉蓯蓉為臣藥，歐白及為佐藥，選擇含量高于80%的提取物按2∶1∶1∶1（m/m/m/m）制成復方參及合劑，利用復方中藥制劑之間相輔相成或相反相成，以及可通過多靶點、多途徑、多系統綜合調節的特點［10］，探討其對小鼠抗缺氧及疲勞的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：DNM-9602型酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）；TGL-20M 型高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；S10 型手持式高速勻漿機（寧波新藝超聲設備有限公司）；AE-240型電子分析天平（梅特勒-托利多<上海>儀器有限公司，精度為0.1 mg）；ACS - 1.5 A 型電子計重秤（上海友聲衡器有限公司）；LSY 型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫療設備廠）；RM 2135型回旋式切片機（德國Leica 公司）；CX 43 型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：鈉石灰（CAS：8006-28-8，含量98%），亞硝酸鈉（CAS：7632-00-0，含量99.99%）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為ml001998），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為ml022446），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH -Px）試劑盒（批號為ml058194），三磷酸腺苷（ATP）試劑盒（批號為ml038391），尿素氮（BUN）試劑盒（批號為ml076479），肌糖原（MG）試劑盒（批號為ml058103），肝糖原（Gly）試劑盒（批號為ml037785），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號為ml002267），均購自上海酶聯生物科技有限公司；LA試劑盒（上海優選生物科技有限公司，批號為YX - 120100M）；人參皂苷提取物（批號為20210420），肉蓯蓉苯乙醇苷提取物（批號為20210420），含量均為80%，均購自西安賽奧生物技術有限公司；丹參提取物［10∶1（10 g原材料提取出1 g），上海源葉生物科技有限公司，批號為R18J11Y116119］；歐白及（原料藥，新疆維吾爾藥業有限責任公司，批號為20220823）；紅景天膠囊（中國人民解放軍西藏軍區總醫院，軍藥準字Z2006001，批號為200806）；復方參及合劑（醫院實驗室自制）。

動物：健康成年SPF級雄性KM 小鼠150只，體質量18～22 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（新）2018 - 0002。在溫度18～25 ℃，相對濕度50%～70%環境下，適應性喂養3 d，自由攝食和飲水，12 h 明暗交替。動物實驗經中國人民解放軍新疆軍區總醫院倫理委員會審核通過（批準文號：DWLL20230120），且嚴格遵守動物實驗倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 抗缺氧能力檢測

常壓密閉缺氧實驗［5］：取小鼠50 只，隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水），陽性對照組（紅景天膠囊0.3 g/kg），復方參及合劑低、中、高劑量組（簡稱低、中、高劑量組，1.0，2.0，3.0 g/kg），各10 只，各組小鼠灌胃等體積生理鹽水或相應藥物（10 mL/kg），每日1 次，連續14 d（以下實驗同）。每天觀察小鼠的精神狀況及體質量，并于末次給藥1 h 后，將小鼠分別置盛有5 g 鈉石灰的250 mL 磨口廣口瓶中（每瓶1 只），以凡士林封口，蓋嚴，立即開始計時，以呼吸停止為終點，記錄小鼠的存活時間。結束后立即解剖，取小鼠心臟及腦組織，檢測SOD，MDA，GSH - Px 水平，嚴格按相應試劑盒說明書操作。

亞硝酸鈉中毒實驗［11］：分組及給藥同上。末次給藥1 h后，各組小鼠腹腔注射200 mg/kg亞硝酸鈉，記錄小鼠的存活時間（注射完畢至呼吸停止）。結束后同上一實驗操作，測定SOD，MDA，GSH-Px水平。

1.2.2 耐疲勞檢測

負重游泳實驗［12］：分組及給藥同上。末次給藥1 h后，在尾巴根部纏繞體質量10%的負重，將小鼠置水溫（25±2）℃，水深30 cm 的水缸中，觀察小鼠力竭游泳時間（從游泳開始到頭部不能露出水面10 s）。結束后立即摘眼球取血獲得血液樣本，檢測BUN，LA，LDH，ATP 水平，取肝臟及腿部肌肉組織分別檢測Gly和MG水平，嚴格按相應試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 常壓密閉缺氧實驗

與空白對照組比較，陽性對照組，低、中、高劑量組小鼠存活時間均顯著延長（P<0.05）。詳見表1。與空白對照組比較，腦組織中，高劑量組小鼠SOD水平，低、中、高劑量組小鼠GSH-Px水平均顯著升高（P<0.05），陽性對照組及低、中、高劑量組MDA 水平均顯著降低；心肌組織中，高劑量組小鼠SOD 水平，陽性對照組及低、中、高劑量組小鼠GSH-Px 水平均顯著升高，低、高劑量組小鼠MDA水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表2。

表1 各組小鼠常壓密閉缺氧、亞硝酸鈉中毒存活時間及游泳力竭時間比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of survival time in the closed normobaric hypoxia test，sodium nitrite poisoning test and exhaustive swimming time in each group（±s，n = 10）

表1 各組小鼠常壓密閉缺氧、亞硝酸鈉中毒存活時間及游泳力竭時間比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of survival time in the closed normobaric hypoxia test，sodium nitrite poisoning test and exhaustive swimming time in each group（±s，n = 10）

注：與空白對照組比較，*P < 0.05。表2至表4同。Note：Compared with those in the blank control group，*P < 0.05（for Tab.1 - 4）.

組別空白對照組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組劑量0.3 g/kg 1.0 g/kg 2.0 g/kg 3.0 g/kg常壓密閉缺氧存活時間（images/BZ_99_1919_2727_1942_2761.png±s，min）41.47±1.73 52.22±4.20*53.55±2.69*61.94±3.13*68.09±2.49*延長率（%）25.92 29.13 49.37 64.20亞硝酸鈉中毒存活時間（images/BZ_99_1919_2727_1942_2761.png±s，min）43.59±1.64 57.24±3.54*58.31±2.46*67.32±3.47*66.60±3.35*延長率（%）31.31 33.77 54.44 52.79力竭時間（images/BZ_99_1919_2727_1942_2761.png±s，min）5.68±0.42 5.93±0.83 8.02±0.51*8.52±0.75*9.55±1.04*

表2 常壓密閉缺氧條件下各組小鼠腦組織及心肌組織相關指標水平比較Tab.2 Comparison of brain and myocardial tissue - related indicator levels in the closed normobaric hypoxia test in each group

2.2 亞硝酸鈉中毒實驗

與空白對照組比較，陽性對照組，低、中、高劑量組小鼠存活時間均顯著延長（P<0.05）。詳見表1。與空白對照組比較，腦組織中，低、中劑量組小鼠SOD 水平，中、高劑量組小鼠GSH-Px 水平均顯著升高，陽性對照組小鼠MDA 水平顯著降低（P<0.05）；心肌組織中，與空白對照組比較，陽性對照組及中劑量組小鼠SOD 水平，中劑量組小鼠GSH - Px 水平均顯著升高，陽性對照組及低、中、高劑量組小鼠MDA 水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表3。

表3 亞硝酸鈉中毒條件下各組小鼠腦組織及心肌組織相關指標水平比較Tab.3 Comparison of brain and myocardial tissue - related indicator levels in the sodium nitrite poisoning test in each group

2.3 負重游泳實驗

與空白對照組比較，低、中、高劑量組小鼠力竭時間均顯著延長（P< 0.05），詳見表1。與空白對照組比較，高劑量組小鼠血清ATP 水平，低、中、高劑量組小鼠LDH水平，中劑量組小鼠Gly水平均顯著升高（P<0.05）；陽性對照組及低、中、高劑量組小鼠BUN 和LA 水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表4。

表4 負重游泳條件下各組小鼠相關指標水平比較Tab.4 Comparison of relevant indicator levels in the weight - loaded swimming test in each group

3 討論

缺氧是高原等特殊環境下普遍存在的應激因素，長期暴露會使機體發生氧化應激反應，影響氧化供能［13］。人參皂苷、丹參提取物、肉蓯蓉苯乙醇苷、歐白及多糖［14］已被證實具有抗缺氧及疲勞作用。本研究中以非特異性缺氧損傷和急性缺氧性損傷［15］考察小鼠的存活時間；用負重游泳實驗考察小鼠的運動耐力，在能量消耗大、氧供應不足的條件下會導致LA 大量堆積［16］、能量耗竭、代謝產物蓄積，產生氧化應激等問題［17］，導致機體疲勞［18］。SOD能清除氧自由基；MDA可反映細胞功能；GSH-Px保護細胞蛋白質免受氧化應激影響［19］。抗缺氧實驗結果表明，與空白對照組比較，各給藥組小鼠存活時間均顯著延長，部分組小鼠心肌和腦組織中SOD和GSH-Px 水平顯著升高，心肌組織中MDA 水平顯著降低，表明復方參及合劑可減輕缺氧時對機體脂質過氧化的損傷，加速自由基的清除，抑制組織細胞凋亡，減少組織器官的消耗［20］，保護心臟和腦組織中過氧化物酶的活性，具有顯著的抗氧化作用。改善機體短暫性缺氧，延長力竭時間，血清中LA和BUN水平顯著下調，LDH水平上調，減少LA堆積，增強LDH的活性，保護臟器組織。

LDH 可加速清除代謝過多的LA，延緩機體疲勞的發生；BUN 能反映機體整體蛋白的代謝情況，同時，機體的運動耐力還與糖原含量有關，主要存在于肌肉組織和肝臟組織中，是機體重要的儲能物質，一方面不斷分解Gly 進行供能，為機體儲備能量［21］，另一方面MG直接為其運動提供能量，保護骨骼肌免受氧化損傷［22］。耐疲勞實驗結果，中劑量組小鼠Gly水平，高劑量組小鼠ATP水平，以及低、中、高劑量組小鼠LDH水平均顯著升高，及時為各組織器官供氧，增加糖原儲備，延緩糖酵解速度，維持機體血糖平衡，具有顯著的耐疲勞能力。

綜上所述，復方參及合劑可顯著提高小鼠抗缺氧、耐疲勞能力，其機制可能與清除體內氧自由基、抑制脂質過氧化損傷、增加糖原儲備、維持機體血糖平衡、增強免疫調節等有關，進一步為高原抗缺氧及疲勞藥物治療提供了新的選擇。課題組前期僅從藥效學水平對復方參及合劑進行了研究，在后續研究中將通過分子機制對心肌細胞抗缺氧耐疲勞機制進行研究，探究線粒體凋亡情況及調控機制，為后期高原抗缺氧及疲勞預防用藥提供理論依據。