酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒超高效液相色譜指紋圖譜及化學模式識別研究*

許樹萍，黃凱偉，張 輝，魏家保，譚 沛

（1. 華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518110； 2. 華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒為蓼科植物唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf. 的干燥根和根莖經酒炙法炒干并按標準湯劑的主要質量指標加工制成［1］。唐古特大黃又稱“雞爪大黃”，主產于甘肅、青海、西藏等高寒、高海拔地區，據報道，唐古特大黃有瀉熱攻堅、化瘀行滯、清火解毒消火功效，藥用歷史悠久，是我國常用傳統大宗中藥材［2］。酒大黃苦寒瀉下作用稍緩，并借酒升提之性，引藥上行，善清上焦血分熱毒，可用于目赤咽腫、齒齦腫痛的治療［3］。有研究表明，其主要化學成分包括游離/結合型的蒽醌類、蒽酮類，二苯乙烯類，苯丁酮類，色原酮類，黃酮類及鞣質類化合物［4-7］。其中，酒大黃中的游離/結合型蒽醌類、蒽酮類成分是發揮其瀉下作用的關鍵成分［8］。本研究中根據國家藥品監督管理局《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》及2020年版《中國藥典》中中藥質量標準研究制定技術要求，采用超高效液相色譜（UPLC）法建立酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒指紋圖譜，同時結合相似度評價，以及聚類分析（CA）法、主成分分析（PCA）法、正交偏最小乘- 判別分析（OPLS - DA）法，對不同原料產地、批次的配方顆粒質量進行評估，探討主要化學成分間的相關性，為全面控制酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒的質量提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H - Class Plus 色譜系統（美國Waters 公司），包括四元溶劑管理器（ACQ - QSM）、自動進樣器（ACQ-FTN）、原裝進口色譜柱溫箱（ACQCM）、二極管陣列紫外檢測器（ACQ - PDA）、Empower色譜管理系統；XS204 型、XS205 型、XSE205 型電子分析天平（精度均為0.1 mg），ME36S型電子分析天平（精度為0.001 mg），均購自梅特勒-托利多<上海>儀器有限公司；SK3310HP 型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；JC - HH - 8 型恒溫水浴鍋（青島精誠儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒（華潤三九醫藥股份有限公司）21 批，編號為S1-S21，其中S1-S3，S4-S6、S16-S21，S7-S9，S10-S12，S13-S15原料產地分別為青海省果洛藏族自治州瑪沁縣，青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣，四川省阿壩藏族羌族自治州若爾蓋縣，四川省甘孜藏族自治州色達縣，甘肅省甘南藏族自治州合作市。沒食子酸對照品（批號為110831-201605，含量90.8%），兒茶素對照品（批號為110877 -201604，含量99.2%），番瀉苷A對照品（批號為110824-202003，含量97.2%），蘆薈大黃素對照品（批號為110795-202011，含量97.5%），大黃酸對照品（批號為110757-201607，含量99.3%），大黃素對照品（批號為110756-201913，含量96.0%），大黃酚對照品（批號為110796-201922，含量99.4%），大黃素甲醚對照品（批號為110758 - 201616，含量99.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院。白藜蘆醇-4'-O-β-D-（6''-O-沒食子酰）葡萄糖苷對照品（批號為STC3930105，含量98.0%），異蓮花掌苷對照品（批號為STC3710105，含量98.0%），蓮花掌苷對照品（批號為ST82330105，含量98.0%），蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號為ST79960105，含量98.0%），大黃酚-1-O-β-D- 葡萄糖苷對照品（批號為ST83090105，含量98.0%），大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號為ST15280120，含量98.0%），大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號為ST23870205，含量98.0%），大黃素甲醚- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷對照品（批號為ST23870110，含量98.0%），均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號為040090-202105，含量96.3%）；表兒茶素- 3 -O- 沒食子酸酯對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為MFCD00075940，含量97.2%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CORTECS UPLC T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相：甲醇-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～1 min時5%A →20%A，1～9 min時20%A →35%A，9～17 min時35%A →37%A，17～21 min時37%A →48%A，21～24 min 時48%A →60%A，24～30 min 時60%A →100%A，30～35 min 時100%A）；流速：0.25 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

取18種對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶液制成每1 mL 分別含沒食子酸、兒茶素、番瀉苷A、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素140，20，20，16，16，16，16，8 μg及其余10種對照品各20 μg的單一對照品溶液。取樣品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加80%甲醇50 mL，密塞，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，冷卻至室溫，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取同一份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，分別以15 號峰與17 號峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積（穩定性、重復性試驗同）。結果相對保留時間的RSD為0.01%～0.16%（n= 6），相對峰面積的RSD為0.15%～3.23%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取同一份供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果相對保留時間的RSD為0.02%～0.37%（n=6），相對峰面積的RSD為0.16%～3.91%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果相對保留時間的RSD為0.02%～0.36%（n=6），相對峰面積的RSD為1.13%～5.42%（n= 6），表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

取樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），形成21批樣品的UPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（見圖1和圖2）；通過與混合對照品溶液色譜圖（見圖3）比對，指認出18個共有成分。

圖1 21批酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒的超高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 UPLC superimposed fingerprints of 21 batches of Wine - Processed Rhei Radix et Rhizoma（Rheum tanguticum）Formula Granules

圖2 酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒超高效液相色譜圖對照指紋圖譜Fig.2 UPLC reference fingerprints of Wine - Processed Rhei Radix et Rhizoma（Rheum tanguticum）Formula Granules

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）評價相似度，結果均大于0.950，表明21 批樣品的質量較穩定。詳見表1。

表1 相似度評價結果Tab.1 Results of similarity evaluation

2.5 化學模式識別研究

2.5.1 CA

采用SPSS 26.0統計學軟件，以21批樣品各特征峰面積為變量進行CA 分析，結果見圖4。可見，當分類距離為15 時，21 批樣品可聚為3 類，S1 - S6、S10 - S11，S7-S9、S12-S15，S16-S21各聚為一類。

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Tree diagram of cluster analysis

2.5.2 PCA

采用SPSS 26.0統計學軟件，對21批樣品各特征峰面積的標準化值（Xi）進行PCA，主成分結果以特征值>1為標準提取得到2個主成分（PC1，PC2），計算得特征值和方差貢獻率（見表2），主成分因子載荷矩陣見表3。可見，提取的2個主成分能反映酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒指紋圖譜的大部分信息［9］。

表2 樣品主成分分析特征值及方差貢獻率Tab.2 Eigenvalue and variance contribution rate of principal component analysis of samples

表3 主成分因子載荷矩陣Tab.3 Loading matrix of principal component factors

峰1-峰3、峰6、峰8、峰10-峰18主成分1載荷較高，表明這14個峰主要反映PC1的信息；峰4-峰5、峰7、峰9 PC2載荷較高，表明這4個峰主要反映PC2的信息。根據表2和表3的數據，由公式Fi=Wi1X1+Wi2X2+…+WijXj（其中，W為主成分中各個變量的權重，由成分矩陣中的第j 列載荷除以對應成分特征值的算術平方根所得），計算得主成分得分F1和F2，主成分得分圖見圖5。

圖5 主成分得分圖Fig.5 Scoring plot of principal component analysis

2.5.3 OPLS-DA

采用SIMCA 14.1 軟件，以21 批樣品的特征峰峰面積為變量進行OPLS-DA 分析（見圖6）。結果數據矩陣的解釋率參數R2X（cum）= 0.888，模型區分參數R2Y（cum）= 0.715，模型預測參數Q2= 0.523，均符合要求（即R2Y>Q2，Q2≥0.5）。經200 次置換檢驗，Q2回歸線與縱軸的相交點小于0.05，說明模型未過擬合，驗證有效，且穩定可靠［10］。21 個樣品可分成3 類，以變量投影重要性（VIP）值> 1 為提取標準，得到峰4（異蓮花掌苷）、峰7（白藜蘆醇-4'-O-β-D-（6''-O-沒食子酰）葡萄糖苷）、峰2（兒茶素）、峰17（大黃酚）、峰1（沒食子酸）、峰9（番瀉苷A）、峰5（蓮花掌苷）、峰10（大黃酚-1-O-β-D-葡萄糖苷）是影響分類的主要標志性成分。

A. 得分圖 B.VIP值 C. 模型交叉驗證圖6 OPLS-DA分析結果A.Scoring plot B.VIP value C.Cross - verification of modelsFig.6 Results of OPLS - DA

3 討論

3.1 色譜條件選擇

預試驗中考察了不同流動相系統（甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸水溶液），不同流動相的酸比例（甲醇- 0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液）等，不同流速（0.20，0.25，0.30 mL/min），不同柱溫（30，35，40 ℃）的影響，確定選擇2.1 項下色譜條件，各色譜峰分離效果最好。

3.2 供試品溶液制備方法考察

預試驗中考察了多種提取溶劑（水、甲醇、乙醇、60%甲醇、80%甲醇），結果選擇80%甲醇時指紋圖譜得到的色譜峰峰形較好，系統適用性參數相對較優；還考察了超聲提取和加熱回流2 種提取方式，結果顯示提取方式對指紋圖譜的影響較小，在此基礎上，考察了提取時間（15，30，45 min），在該范圍內，各特征成分能被完全提取，綜合考慮，選擇30 min 為提取時間。對取樣量（0.25，0.50，0.75 g）也進行了考察，當取樣量為0.5 g 時，色譜峰的峰高及峰寬相對適中，因此，取樣量確定為0.5 g。通過考察確定了供試品溶液最佳制備方法，采用該方法能更好將樣品中的游離型蒽醌類、蒽酮類、鞣質類、二苯乙烯類成分充分提取出來，更全面展現各化學成分特點，為進一步的質量評價奠定基礎。

3.3 酒大黃配方顆粒不同基源區分研究

前期試驗還對不同基源大黃藥材配方顆粒的指紋圖譜進行了研究［11-15］。取酒大黃（唐古特大黃、掌葉大黃、藥用大黃）配方顆粒樣品分別按2.1 項下色譜條件進行指紋圖譜分析。根據相關報道，白藜蘆醇-4'-Oβ-D-（6''-O-沒食子酰）葡萄糖苷是唐古特大黃的專屬性成分，而蓮花掌苷、大黃酸- 8 -O-β-D- 葡萄糖苷、番瀉苷A等成分是引起不同基源大黃差異的主要標志性成分，且這些成分在唐古特大黃樣品中的含量明顯高于其他基源的樣品。預試驗研究結果顯示，酒大黃（唐古特大黃）樣品中峰5、峰8 和峰9 的響應值明顯高于其他基源的樣品，峰7 在其他基源樣品中缺失。通過對照品的定位，確定了峰5 為蓮花掌苷、峰7 為白藜蘆醇-4'-O-β-D-（6''-O-沒食子酰）葡萄糖苷、峰8 為大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、峰9 為番瀉苷A。與文獻報道的結果一致。

3.4 化學模式識別分析

相似度評價結果顯示，21 批樣品指紋圖譜相似度均大于0.950，說明不同的酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒樣品在化學成分類型及含量上無明顯差異。CA，PCA，OPLS-DA 均將樣品分為3 類，結果顯示，不同樣品的化學成分類型一致，但成分的含量存在一定差異，其中S10-S12 樣品的原料屬同一產地但未聚成同一類，推測該產地原料批次間的差異較大。PCA 通過少數幾個主成分來解釋多個共有峰間的內部結構，距離越近的樣本點間相似度越高，體現批次間的可視化，累積方差貢獻率顯示，前2 個主成分包含了全部測量指標所具有的主要信息。在OPLS - DA 模型下，以VIP值篩選出了導致各批次間產生差異的8 個標志性成分，后期將對上述成分進行藥理學研究，明確其藥效差異。目前關于酒大黃的指紋圖譜報道較少，未來可以從這8 個成分出發，進一步評價酒大黃（唐古特大黃）飲片、標準湯劑和配方顆粒指紋圖譜的相關性，為酒大黃飲片的投料、提取、干燥濃縮、制粒的各個環節提供依據。

3.5 方法評價

本研究中建立了酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒UPLC 指紋圖譜，該方法簡便、重復性較好；并結合化學模式識別研究反映了酒大黃主要化學成分類型及有效成分的特點。所建立的方法適用于快速評定不同批次酒大黃（唐古特大黃）配方顆粒的穩定性和一致性，可為其質量評價提供參考。