無菌檢查中污染微生物多樣性分析及數(shù)據(jù)偏差調(diào)查*

王 璐，向 東，張 艷，劉 勤，徐 帆

（1. 云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院·工業(yè)和信息化部產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺，云南 昆明 650106；2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032）

無菌檢查法用于檢查藥典規(guī)定無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌，是注射用藥品安全性評價(jià)指標(biāo)之一。無菌檢查結(jié)果的判斷是一個(gè)非常重要和復(fù)雜的步驟。國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）規(guī)定，無菌檢出結(jié)果以一次檢出為準(zhǔn)，不得復(fù)試［1］。2020年版《中國藥典》規(guī)定，當(dāng)供試品管檢出微生物時(shí)，若有證據(jù)能充分證明生長的微生物非供試品本身引起，可判定試驗(yàn)無效，可重試，否則應(yīng)判定供試品不符合無菌檢查法的要求［2］。無菌檢查判斷如出現(xiàn)假陰性結(jié)果，會造成已污染微生物的無菌藥品流向市場（如“欣弗事件”“刺五加事件”），嚴(yán)重威脅患者生命；如出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)均為高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品企業(yè)，企業(yè)必須召回上市產(chǎn)品，停業(yè)整頓，給企業(yè)帶來不可估量的損失，同時(shí)也會對藥品監(jiān)管檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的公信力造成不良影響。藥品生產(chǎn)企業(yè)或藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具備微生物污染溯源的能力。首先應(yīng)對污染微生物進(jìn)行分離純化，根據(jù)染色鏡檢結(jié)果采用生化反應(yīng)鑒定法確定細(xì)菌種屬，并與環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。當(dāng)日常微生物或生化鑒定技術(shù)靈敏度偏低或不足以提供明確的證據(jù)證明2 種分離的微生物為同一來源時(shí)，應(yīng)采用更敏感的試驗(yàn)方法（如基因型微生物鑒定）來測定分離的微生物是否為克隆關(guān)系及由同一菌株繁殖而成。無菌檢查法作為終產(chǎn)品檢查法雖能防止問題產(chǎn)品流向消費(fèi)領(lǐng)域，卻無法對藥品檢驗(yàn)進(jìn)行過程控制，無法解決藥品微生物污染來源問題。本研究中以曲安奈德注射液為例，旨在探索當(dāng)藥品的無菌檢查出現(xiàn)陽性結(jié)果后，樣品微生物與環(huán)境微生物之間的類聚特征與同源性關(guān)系，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的微生物數(shù)據(jù)偏差數(shù)據(jù)調(diào)查（MDD）程序，以期排查從樣品到檢驗(yàn)過程的污染原因，追溯陽性微生物的來源?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

STI- 1800DTC 型無菌隔離器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；HPP260eco 型生化培養(yǎng)箱（德國Memmert 公司）；AC2 - 4S1 級A2 型生物安全柜（ESCO Airstream?，新加坡ESCO 公司）；DM300 型LED 正置顯微成像系統(tǒng)（德國Leica公司）；VITEK 2 Compact型全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國Bio Mérieux公司）。

1.2 試藥

曲安奈德注射液（國內(nèi)A 企業(yè)，批號為220724，規(guī)格為每支1 mL）；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM）及胰酪大豆胨瓊脂、液體培養(yǎng)基（TSA，TSB），均購自北京三藥科技開發(fā)公司，批號分別為20220405，220331，20220412；革蘭陰性細(xì)菌及革蘭陽性細(xì)菌鑒定卡（GP 及GN，美國Bio Mérieux 公司，批號分別為2411814203，2422281503）。

2 方法與結(jié)果

2.1 無菌檢查

曲安奈德注射液為混懸液無菌產(chǎn)品，按2020年版《中國藥典（四部）》通則1101無菌檢查法下直接接種法進(jìn)行無菌檢查。培養(yǎng)期間定期觀察接種了供試品的FTM，第10 天發(fā)現(xiàn)其中1 管氧化層顏色變淡，因制劑本身為白色混懸液，接種后培養(yǎng)基管均出現(xiàn)渾濁，故從外觀上不能判斷有無微生物生長。培養(yǎng)至第14天，取該培養(yǎng)液1 mL 置同種新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)不少于4 d，新鮮培養(yǎng)基再出現(xiàn)渾濁，則判斷為有菌生長。

2.2 細(xì)菌的分離純化及鑒定

2.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及染色

取上述培養(yǎng)物，用TSA 劃板，分離純化，培養(yǎng)結(jié)果染色鏡檢［3］，結(jié)果見表1。

表1 鏡檢及生化鑒定結(jié)果Tab.1 Results of microscopic examination and biochemical identification

表2 表皮葡萄球菌生化鑒定結(jié)果Fig.2 Results of biochemical identification of Staphylococcus epidermidis

2.2.2 全自動細(xì)菌生化鑒定

根據(jù)革蘭染色鏡檢結(jié)果，選擇對應(yīng)的生化鑒定卡片，對分離純化得到的2 個(gè)菌株進(jìn)行生化鑒定，試驗(yàn)結(jié)果置信度極佳。詳見表1 至表3（其中，+ 代表陽性，-代表陰性）。

表3 克氏檸檬酸桿菌生化鑒定結(jié)果Fig.3 Results of biochemical identification of Citrobacter koseri

2.2.3 微生物多樣性分析

委托北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司對出現(xiàn)渾濁長菌的培養(yǎng)管進(jìn)行微生物多樣性分析。提取樣品總DNA 后，根據(jù)DNA 保守區(qū)設(shè)計(jì)引物（在引物末端加上測序接頭）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測序文庫，對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)量控制（包括低質(zhì)量過濾、長度過濾），得到高質(zhì)量序列，參數(shù)內(nèi)容見表4。

表4 參數(shù)內(nèi)容與信息Tab.4 Content and information of parameters

對高質(zhì)量序列進(jìn)行過濾及去噪，首先使用Trimmomatic v0.33軟件對測序得到的Raw Reads 進(jìn)行過濾；然后使用cutadapt 1.9.1 軟件進(jìn)行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads。第二步，DADA2去噪：使用QIIME2 2020.6［4］中的DADA2 方法［5］進(jìn)行去噪，雙端序列拼接并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Non-chimeric Reads）。

信息分析內(nèi)容，劃分OTUs/ASVs（Feature），并根據(jù)Feature 的序列組成得到其物種分類。進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、差異分析、相關(guān)性分析及功能預(yù)測分析。最后根據(jù)16S rRNA 或內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因測序結(jié)果，通過功能預(yù)測分析對樣品進(jìn)行基因功能或表型預(yù)測并計(jì)算功能基因或表型豐度，結(jié)果檢測到3 種細(xì)菌，分別為表皮葡萄球菌、克氏檸檬酸桿菌及唾液鏈球菌。詳見表5（其中，系列數(shù)指該微生物被檢測到的系列條數(shù)，不代表該微生物的絕對數(shù)量；相對豐度指該微生物所占同類微生物的百分比）。

表5 16S rRNA系列分析結(jié)果Tab.5 Results of 16S rRNA analysis

2.3 與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌庫比較

收集2021年至2022年隔離器內(nèi)部A級環(huán)境及隔離器放置的D 級背景的微生物，得39株環(huán)境菌。首先進(jìn)行菌落形態(tài)特征觀察，然后進(jìn)行革蘭染色，再用正置顯微成像系統(tǒng)鏡檢，根據(jù)染色結(jié)果使用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定，對其中有疑問的進(jìn)行16S rRNA 測序鑒定［6］，結(jié)果包含了樣品中檢出的表皮葡萄球菌、克氏檸檬酸桿菌及唾液鏈球菌，具體為表皮葡萄球菌7 株，沃氏葡萄球菌6 株，克氏庫克菌5 株，頭狀葡萄球菌3株，克氏檸檬酸桿菌、藤黃微球菌、唾液鏈球菌、肺炎鏈球菌各2株，腐生葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌各1株，未鑒定出的有8株。

2.4 微生物數(shù)據(jù)MDD 分析［7］

按2020年版《中國藥典（四部）》通則9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則，對檢驗(yàn)過程中出現(xiàn)的與微生物相關(guān)的不合規(guī)范的數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室MDD。

儀器狀態(tài)調(diào)查：隔離器系統(tǒng)安全艙滅菌程序調(diào)查，因當(dāng)日實(shí)驗(yàn)樣品較多，操作人員未按隔離器典型裝載方式進(jìn)行物料裝載，目測物品裝載已超過該臺隔離器年度驗(yàn)證時(shí)的最大裝載方式，部分樣品裝載時(shí)未完全分開，樣品之間未充分暴露表面，因隔離器滅菌方式為氣化過氧化氫表面滅菌，未暴露的表面可能因未接觸到過氧化氫而不能充分滅菌。儀器本次和上次運(yùn)行狀態(tài)正常，日常維護(hù)與保養(yǎng)記錄正常，儀器處于再驗(yàn)證合格期內(nèi)。

培養(yǎng)基及沖洗液質(zhì)量調(diào)查：培養(yǎng)基來源清楚、穩(wěn)定，處于有效期內(nèi)，保存條件滿足說明書要求，其他試劑及耗材滿足試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求。

潔凈保障：試驗(yàn)人員遵守?zé)o菌操作，手套檢漏合格，沉降菌和表面微生物符合規(guī)定，本試驗(yàn)不涉及浮游菌監(jiān)測，陰性對照及陽性對照符合規(guī)定。

檢驗(yàn)操作過程：供試品的內(nèi)外包裝和取樣量符合標(biāo)準(zhǔn)要求，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)使用正確。

其他需要說明的情況：當(dāng)天同時(shí)進(jìn)行的其他2批曲安奈德注射液無菌檢查符合規(guī)定，未見異常。

糾正和預(yù)防措施：對所有無菌試驗(yàn)人員再次進(jìn)行無菌隔離器使用規(guī)范培訓(xùn)，再次確認(rèn)隔離器的典型裝載方式及滿載狀態(tài)，確保今后試驗(yàn)中裝載量不會超過經(jīng)驗(yàn)證合格的儀器滿載狀態(tài)。此外，MDD 調(diào)查結(jié)果表明，樣品中污染的微生物是由試驗(yàn)操作人員未完全按無菌隔離器使用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行規(guī)范操作而引起的污染，污染菌來源于環(huán)境中。由于樣品的裝載方式存在問題，造成樣品表面滅菌不完全。該樣品的無菌檢查法為直接接種法，導(dǎo)致培養(yǎng)管更易污染環(huán)境中的細(xì)菌。故本次無菌試驗(yàn)結(jié)果無效，應(yīng)重試。

2.5 無菌試驗(yàn)重試結(jié)果

取同批次同量供試品，同2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行無菌試驗(yàn)。將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)不少于14 d。培養(yǎng)期間逐日觀察，結(jié)果陽性對照菌24 h 生長良好，陰性對照各管在培養(yǎng)期間無菌生長，供試品管無菌生長，判定樣品無菌檢查符合規(guī)定。

3 討論

2020年版《中國藥典（四部）》通則1101 規(guī)定，當(dāng)無菌檢查培養(yǎng)基任何1管渾濁并確認(rèn)微生物污染時(shí)，若能證明污染的微生物非樣品所含，可判定試驗(yàn)結(jié)果無效，并對該樣品的無菌試驗(yàn)進(jìn)行重試。對供試品管中有菌生長的無菌試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)認(rèn)真分析產(chǎn)生的原因，如果分析原因符合下列其中1 條，可判定試驗(yàn)結(jié)果無效。1）無菌檢查試驗(yàn)所用設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法中對設(shè)備及環(huán)境的要求；2）回顧整個(gè)無菌試驗(yàn)操作過程，有充分證據(jù)表明在其中某一環(huán)節(jié)有可能引起供試品管的微生物污染；3）陰性對照管有微生物污染，當(dāng)供試品管有菌生長時(shí)，陰性對照試驗(yàn)對判斷無菌試驗(yàn)結(jié)果的有效性非常重要。供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，應(yīng)與環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確認(rèn)是否為同一來源。但該判斷方法與所用鑒定技術(shù)關(guān)系很大，需采用更敏感的試驗(yàn)來判斷2種分離的微生物是否為克隆關(guān)系或由同一菌株繁殖而成，目前微生物常用鑒定同源性分析方法有生化反應(yīng)鑒定法、16S rRNA 的微生物多樣性分析、核糖體分型RP 鑒定方法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法、脈沖場凝膠電泳法等［8］。

微生物多樣性研究是以擴(kuò)增序列變體為分子標(biāo)記研究環(huán)境樣品中微生物系統(tǒng)分類、物種構(gòu)成。16S rRNA為核糖體小亞基的組分，普遍存在于所有細(xì)菌中，具有拷貝數(shù)多、分子大小適中、有突變序列也有保守序列、信息量較大且能體現(xiàn)不同菌株種屬間差異的特點(diǎn)，是細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用的“分子鐘”，作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定最常用的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識序列，素有“細(xì)菌化石”之稱［9-10］。微生物多樣性是基于Illumina Nova-Seq 測序平臺，利用雙末端測序（Paired - End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序。通過對Reads 拼接過濾，聚類或去噪，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可揭示樣品的物種構(gòu)成；進(jìn)一步進(jìn)行α 多樣性分析（Alpha Diversity）、β多樣性分析（Beta Diversity）、顯著物種差異分析、相關(guān)性分析、功能預(yù)測分析等，以挖掘樣品之間的差異。目前，基于16S rRNA 的微生物多樣性分析已廣泛應(yīng)用于菌株的鑒定研究。

目前，微生物污染的溯源依然是很多藥品生產(chǎn)企業(yè)操作的難點(diǎn)，盡管如此，藥品生產(chǎn)企業(yè)或藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)仍應(yīng)積極建立潔凈區(qū)環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫，企業(yè)可通過數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)對生產(chǎn)全過程的微生物監(jiān)控，有利于生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的控制，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)過程中的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，從被動的排查污染上升到主動預(yù)防，當(dāng)監(jiān)測數(shù)據(jù)超過警戒線和糾偏限時(shí)，就應(yīng)高度重視，啟動相應(yīng)程序，讓潔凈區(qū)始終保持受控狀態(tài)［11］。檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)建立污染趨勢分析圖，可應(yīng)用到溯源分析及污染調(diào)查中［12］，當(dāng)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果異常時(shí)，調(diào)取環(huán)境中微生物數(shù)據(jù)庫的菌種進(jìn)行比對分析。因此，環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫的建立對藥品生產(chǎn)企業(yè)和藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)來說均非常重要且必要。